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海洋放线菌(Salinispora arenicola)基因转移系统的建立马艳玲;李海贤;翁萍;刘泽璇;许小庆;曾荣【摘要】该实验旨在建立海洋放线菌Salinispora arenicola基因转移系统,以便基因敲除和外源基因表达等遗传操作.以整合型质粒pSET152和pIB139为出发质粒,通过接合转移构建了海洋放线菌Salinispora arenicola的基因转移系统.结果表明,25μg/mL阿泊拉霉素可有效筛选接合子,大肠杆菌与孢子的比例为8:1时可获得较多的转化子.经聚合酶链式反应(PCR)验证,质粒成功整合到菌株海洋放线菌S.arenicola基因组中,接合子经多次传代后,导入的质粒pSET 152和pIB139仍稳定整合于接合子基因组上.成功构建了海洋放线菌S.arenicola接合转移系统.%The objective of this study is to establish the gene transfer system of marine-derived actinomycetes Salinispora arenicola,which can be used for genetic manipulations such as gene knock-out and expression of foreign ing integrated plasmid pSET 152 with pIB 139 as original plasmid,the gene transfer system of actinomycetes S.arenicola was constructed by conjugating transfer.Results showed that 25 μg/ml apramycin may be used to efficiently screening conjugants,and more transformant can be acquired with Escherichia coli to spores ratio 8:1.PCR verification revealed that exogenous plasmid was successfully integrated in the chromosomal DNA of actinomycetes S.arenicola.After multiple generations of zygotes,the transformed plasmid pSET152 and pIB139 of conjugants were stably integrated in the zygote genome.The S.arenicola conjugational transfer system was successfully constructed.【期刊名称】《中国酿造》【年(卷),期】2018(037)003【总页数】4页(P131-134)【关键词】海洋放线菌;Salinispora arenicola;接合转移;遗传稳定性【作者】马艳玲;李海贤;翁萍;刘泽璇;许小庆;曾荣【作者单位】佛山科学技术学院食品科学与工程学院,广东佛山528231;佛山科学技术学院食品科学与工程学院,广东佛山528231;佛山科学技术学院食品科学与工程学院,广东佛山528231;佛山科学技术学院食品科学与工程学院,广东佛山528231;佛山科学技术学院食品科学与工程学院,广东佛山528231;佛山科学技术学院食品科学与工程学院,广东佛山528231【正文语种】中文【中图分类】Q93-331天然药物的一个重要来源是海洋放线菌[1]，其作为一类特殊菌群其可以产生多种生物活性物质，这些活性物质很多都具有成为新药先导化合物的研制潜能，如多肽、酶类、抗肿瘤物质和抗生素等[2-4]。
EGFP的原核表达分析首都师范大学生命科学学院100048摘要：利用PCR反应扩增出所需要的EGFP基因，与pTrc His蛋白表达载体重组，转化大肠杆菌BL21,提取质粒，诱导EGFP蛋白表达，进行进一步的分离纯化并用SDS-PAGE和Western-blot 做检测。
这个实验让我们充分熟悉了整个流程。
关键词：绿色荧光蛋白蛋白的诱导表达、分离纯化表达蛋白检测 E.coli材料和方法：1、主要材料及仪器1.1、菌株和质粒：大肠杆菌BL21为本实验室保存；重组筛选质粒pTrcHis购自Invitroge公司。
1.2、培养基：LB培养基（液/固）内含氨苄青霉素浓度为100 ug/ml。
1.3、器材和试剂器材：移液枪、PCR仪、离心机—（HetticZENTRIFUGEND-78532 Tuttlingen）、SIGMA2-16K(4℃离心机)、SIGMA 3-18K(离50ml大离心管)、紫外透射观察仪、水浴锅、核酸电泳仪（BIO-RAD）、超声波破碎仪（SONICSVIbra cell）、气浴恒温振荡器（THZ-82江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）、SDS-PAGE电泳装置、WesternBlotting电转移装置、水平摇床（WD-9405）、胶片观察灯（WD-9406）、封口机、超净台、250ml锥形瓶。
试剂：PCR反应体系缓冲液（10~50 mMTris-HCl，50 mM KCl，1.5 mMMgCl2）、DNA聚合酶（Taq E）、dNTPs混合物（每种2.5mM）、博大泰克PCR产物快速回收试剂盒、限制性核酸内切酶（BglII、EcoRI）、0.5M EDTA、琼脂糖凝胶（1g琼脂糖、100ml1xTAE、10ulEB）、电泳缓冲液（50 xTAE、Tris—乙酸、EDTA）、溴酚兰、蔗糖、甘油、连接酶（购于Promega公司的T4DNA连接酶及10×ligation buffer）、0.1MCaCl2、碱裂解液（溶液I：50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl，pH=8.0、10mM EDTA；溶液II：0.2 M NaOH，1％SDS；溶液III：5 M KAc，11.5 ml冰醋酸，加水定容至100ml）、RNaseA、无水乙醇、PBS缓冲液、裂解缓冲液（含20mM咪唑）、冲洗液（含100mM咪唑）、洗脱液（含500mM咪唑）、5×样品缓冲液、30%凝胶贮液、4×分离胶缓冲液、4×浓缩胶缓冲液（4℃保存）、TEMED原液、10%过硫酸铵、Tris-甘氨酸电极缓冲液（pH=8.3）、考马斯亮蓝G250染色液、GFP抗体（200ug/ml，用pH=7.5 TBS配置)、转移缓冲液、TBS、封闭液（5%脱脂奶粉）、显色液（氯萘酚，30mg/ml于甲醇中）、ddH2O、脱色液（（100 ml冰乙酸:100 ml乙醇:800 ml蒸馏水）2、方法2．1、EGFP基因的PCR扩增及其电泳检测在一灭菌的0.2mL小离心管中依次加入(总体积为50ml)：10×buffer(Mg2+)5ml4×dNTPs （每种 2.5mM ）8mlEGFP-F1mlEGFP-R1mlTemplate(模板)34mlTaq E1ml--------------------------------------------------------------------------------Total volume 50µl循环参数94 ℃3min94 ℃30s55 ℃30s 27cycle72 ℃1min72 ℃10min4 ℃保存2.2、PCR扩增产物的回收———试剂盒法1)、柱平衡：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500ml的平衡液BL，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中。
波赛链霉菌dnrK基因中断突变株代谢产物鉴定余贞;王继栋;李美红;周军;黄隽【摘要】目的鉴定波赛链霉菌HS062(柔红霉素工业菌株)dnr基因中断突变株新次级代谢产物.方法将dnrK基因中插入了阿泊拉霉素抗性基因及“海正”标记片段的中断载体pBSSP-KA导入波赛链霉菌HS062,筛选获得dnrK插入失活的突变株DK55,通过HPLC-MS和NMR对DK55菌株产生的新代谢产物进行结构鉴定.结果 dnrK中断突变株DK55产生了一个新的蒽环类代谢产物,该化合物经结构鉴定为histomodulin,并且其效价远远高于原产物柔红霉素.结论本研究通过基因工程手段获得高产histomodulin菌株,为该化合物的应用研究打下了基础;同时,探讨了工业菌株中dnrK基因敲除后菌株代谢产物变化原因, 为进一步提高柔红霉素及其衍生物的产量提供了新的思路.【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2015(040)011【总页数】6页(P813-817,835)【关键词】波赛链霉菌;dnrK;Histomodulin;基因中断【作者】余贞;王继栋;李美红;周军;黄隽【作者单位】浙江海正药业股份有限公司,台州318000;浙江海正药业股份有限公司,台州318000;浙江海正药业股份有限公司,台州318000;浙江海正药业股份有限公司,台州318000;浙江海正药业股份有限公司,台州318000【正文语种】中文【中图分类】R978.1自1963年意大利学者DiMarco等[1]从波赛链霉菌(Streptomyces peucetius)分离获得柔红霉素(daunorubicin,6)以来，国内外学者对波赛链霉菌进行了深入研究，先后分离出多柔比星(doxorubicin,7)[2]、表柔红霉素(epidaunorubicin)[3]、表阿霉素(epirubicin)[3]、洋红霉素(carminomycin,3)[4]、13-脱氧洋红霉素(13-deoxocarminomycin)[5]等一系列临床应用十分广泛的蒽环类抗肿瘤抗生素。
细菌培养常用培养基和抗生素的配制方法、常用培养基1、LB 培养基将下列组分溶解在0.9L 水中：蛋白胨10g酵母提取物5g氯化钠10g如果需要用INNaOH （〜1ml）调整pH至7.0，再补足水至1L。
注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。
2 、SOB 培养基将下列组分溶解在0.9L水中：蛋白胨20g酵母提取物5g氯化钠0.5g1mol/L 氯化钾2.5ml用水补足体积到1L。
分成100ml的小份，高压灭菌。
培养基冷却到室温后，再在每100ml 的小份中加1ml 灭过菌的1mol/L 氯化镁。
3、SOC培养基成分、方法同SOB培养基的配制，只是在培养基冷却到室温后，除了在每100ml的小份中加1ml 灭过菌的1mol/L 氯化镁外，再加2ml 灭菌的1mol/L 葡萄糖（18g 葡萄糖溶于足够水中，再用水补足到100ml，用0.22um的滤膜过滤除菌）。
4 、TB 培养基将下列组分溶解在0.9L水中:蛋白胨12g酵母提取物24g甘油4ml各组分溶解后高压灭菌。
冷却到60 C , 再加100ml灭菌的170mmol/LKH2PO4/0.72mol/LK2HPO4 的溶液（2.31g 的KH2PO4和12.54gK2HPO4溶在足量的水中，使终体积为100ml。
高压灭菌或用0.22um的滤膜过滤除菌）。
5、2X Y培养基将下列组分溶解在0.9L水中:蛋白胨16g酵母提取物10g氯化钠4ml如果需要用INNaOH (〜1ml )调整pH 至7.0，再补足水至1L 。
注：琼脂平板需添加琼脂粉 12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉 7g/L 。
6、YPD 培 养基将下列组分溶解在 0.9L 水中： 蛋白胨 20g 酵母提取物 10g 葡萄糖 20g用水补足体积为 1L 后，高压灭菌。
建议在高压灭菌之前，对色氨酸营养缺陷型每升培养基 添加1.6g 色氨酸，因为 YPD 培养基是色氨酸限制型培养基。
大肠杆菌的保存和培养大肠杆菌, 培养, 保存一．菌种的保存重组DNA 分子(质粒、噬菌体、粘性质粒)必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。
通常采用宿主菌是大肠杆菌，根据不同载体需求，选用不同品系大肠杆菌1. 概述：大肠杆菌其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此，而变异性，使微生物的性状在繁殖过程中出现某些改变，给菌种保藏带来了困难。
由于存在变异，即菌种常出现所谓的退化，主要指理想性状的丧失，从而导致发育缓慢，存活率和产质量降低等现象，菌种保藏工作就是使菌种的变异降低至最小水平，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征以及不污染杂菌。
能够长期在研究上应用。
2. 微生物的变异速度，通常情况下，与其新陈代谢速度有关，微生物代谢活力旺盛，它的变异速度快，代谢活动微弱，变异速度就慢。
并且在多次的无性繁殖过程中可能会有突变的积累。
人们利用这一规律，可以创造各种条件，使微生物活动处于微弱活动或不活动状态，以减少变异的发生。
3. 菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。
由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。
要求保存的菌种在复苏后vf fv 的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的改变外，还不允许污染任何杂菌。
此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。
4. 常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等保护剂。
5. 甘油低温保存法(－70℃—－196℃)的特点i.甘油菌低温保存的基本原理是：在-70℃或液氮中冻存，细菌内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。
在0℃—-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。
LB培养基中抗生素的贮液配置和工作液浓度
①以水为溶剂的抗生素贮存液应用0.22 μm滤器过滤除菌；
②用乙醇溶解的抗生素溶液无须过滤除菌；
③所有抗生素贮液都应放于不透光的容器中保存。
注意：镁离子是四环素的拮抗剂。
对于以四环素为筛选抗性的细菌，应使用不含镁离子的培养基，如LB培养基。
下面是常用抗生素的贮液浓度及工作浓度
氨苄青霉素：贮液浓度50 mg/ml 溶于水-20℃保存工作浓度20 μg/ml （严紧型质粒）60 μg/ml （松弛型质粒）
羧苄青霉素：贮液浓度50 mg/ml 溶于水-20℃保存工作浓度20 μg/ml （严紧型质粒）60 μg/ml （松弛型质粒）
氯霉素：贮液浓度34 mg/ml 溶于乙醇-20℃保存工作浓度25 μg/ml （严紧型质粒）170 μg/ml （松弛型质粒）
卡那霉素：贮液浓度10 mg/ml 溶于水-20℃保存工作浓度10 μg/ml （严紧型质粒）50 μg/ml （松弛型质粒）
链霉素：贮液浓度50 mg/ml 溶于水-20℃保存工作浓度10 μg/ml （严紧型质粒）50 μg/ml （松弛型质粒）
四环素：贮液浓度 5 mg/ml 溶于乙醇-20℃保存工作浓度10 μg/ml （严紧型质粒）50 μg/ml （松弛型质粒）
质粒类型：。
一．菌种的保存重组DNA 分子(质粒、噬菌体、粘性质粒)必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。
通常采用宿主菌是大肠杆菌，根据不同载体需求，选用不同品系大肠杆菌1. 概述：大肠杆菌其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此，而变异性，使微生物的性状在繁殖过程中出现某些改变，给菌种保藏带来了困难。
由于存在变异，即菌种常出现所谓的退化，主要指理想性状的丧失，从而导致发育缓慢，存活率和产质量降低等现象，菌种保藏工作就是使菌种的变异降低至最小水平，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征以及不污染杂菌。
能够长期在研究上应用。
2. 微生物的变异速度，通常情况下，与其新陈代谢速度有关，微生物代谢活力旺盛，它的变异速度快，代谢活动微弱，变异速度就慢。
并且在多次的无性繁殖过程中可能会有突变的积累。
人们利用这一规律，可以创造各种条件，使微生物活动处于微弱活动或不活动状态，以减少变异的发生。
3. 菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。
由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。
要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的改变外，还不允许污染任何杂菌。
此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。
4. 常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等保护剂。
5. 甘油低温保存法(－70℃—－196℃)的特点i.甘油菌低温保存的基本原理是：在-70℃或液氮中冻存，细菌内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。
在0℃—-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。
实验一LB培养基的配制和大肠杆菌的培养第一部分理论知识一．生物工程所需的微生物学原理基因工程主要采用革兰氏阴性细菌作为宿主细胞表达系统。
下面着重讲述大肠杆菌。
1.大肠杆菌的一般特性大肠杆菌（Escherichia coli，简写为E.coli）属于革兰氏阴性细菌，大肠杆菌不仅能液体培养，也能在固体培养基上很好地生长。
在细菌培养过程中，有两方面的因素影响它的纯度：1.其它细菌造成的细菌污染。
因此，用于培养的所有药品、器皿必须消毒，全部过程应在无菌条件下操作；2.遗传的异质性。
遗传上的异质性发生在培养过程中原有细菌株系遗传成分的变异，导致原有标记性状的改变。
其原因可能是天然突变的结果；或是在由质粒携带标记性状的情况下，异质性可能来自细胞分裂过程中质粒的丢失或质粒的分离。
据目前所知，许多质粒以相当高的频率在寄主细胞分裂时发生分离，从而引起所带性状的变化。
2. 抗生素抗性抗生素阻止细菌生长往往有抑菌和杀菌两种方式。
抑菌就是指药物仅仅使细菌生长受阻而未直接引起细胞死亡；而杀菌是指药物引起细胞裂解或死亡。
一种抗生素抑菌或杀菌效果取决于细菌接触药物的条件。
例如，大肠杆菌接触低水平的四环素将会通过四环素与核糖体结合，影响细菌蛋白质的合成而最终抑制细胞生长。
然而，结合着四环素的核糖体是可恢复的，因为受抑制的细胞被稀释到无药物的培养基上，将会重新恢复正常细胞的生长。
这种抑制的可恢复性表明四环素正以抑菌的方式发挥功能。
当四环素浓度加大，阻止细菌声中的另一种方式变得明显而不可逆，亦即在高浓度下，四环素以杀菌方式发挥功能。
细菌有三种抗生素抗性的机制：（1）抗生素在细菌中作用的目标位置发生了变化。
例如蛋白质合成抑制剂链霉素的抗性通常是由于细菌合成了一种变化了的核糖体蛋白质，这种蛋白质不再与链霉素相连，因此阻止了链霉素的抑制行为；（2）组织药物进入细胞。
如对四环素的抗性是由于细菌合成了阻止四环素进入细胞的膜蛋白，因而四环素的穿透性大为减低所致；（3）改变或钝化药物。
品质管理检测项目细菌形态学分类一乳酸杆菌乳酸杆菌的基本属性：乳酸菌为一群可发酵碳水化合物以获取能量，并生成大量乳酸的一类细菌的总称。
利用发酵技术保藏食品，最典型的是通过乳酸菌的发酵。
这在发酵乳工业中已经得到广泛的应用。
利用天然的或经筛选的乳酸菌发酵，已经生产出多种不同类型的发酵乳。
因而分离和鉴定乳酸菌对人类的生产和生活都具有非常重要的意义。
无芽孢，革兰氏染色呈阳性。
微好氧，厌氧发酵，最适温度30~40摄氏度，最适PH值为5.5~6.2，在微酸环境下可以生长，中性或者偏碱性环境中则生长速率下降。
在固体培养基上培养时，通常厌氧条件或者减少氧气压力和充有体积分数为5%~10%的CO2可以增加其表面生长物，有些菌株在分离时就是厌氧的。
（一）实验仪器和试剂：实验仪器：现有的仪器：欠缺的仪器：培养基和试剂：①培养基：BCP培养基、MRS培养基和SL培养基BCP培养基：酵母膏2 5g，蛋白胨5g，葡萄糖5g，溴甲酚紫0.04g，琼脂15g，蒸馏水lO00ml，pH7 0；MRS培养基（可以培养包括双岐乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌）：重量(g) 牛肉蛋白粉10 ，鱼肉汁10 ，酵母浸出汁粉5 ，葡萄糖20 ，醋酸钠5 ，柠檬酸二铵 2 ，吐温80 0.1 ，硫酸镁0.58 ，硫酸锰0.28 ，蒸溜水1 000ml ，备注：用高压锅在121℃灭菌15min，调节pH6.2～6.4 。
乳酸杆菌选择性琼脂SL：酪蛋白水解物10g；酵母提取物5g；柠檬酸二铵2g；乙酸钠（CH3COONa？3H2O）25g；MgSO4？7H2O 0.58g；琼脂15g；葡萄糖20g；吐温80 1.0ml；磷酸氢二钾6g；FeSO4？7H2O 0.03g；MnSO4？4H2O 0.15g。
以上用量为1000ml培养基的用量。
溶解琼脂在500ml的沸水中，溶解其他组分在500ml的水中，用冰醋酸调pH=5.4，并混合已融化的琼脂，进一步煮沸5分钟，倾倒平板或此热的培养基适量分装入灭菌的试管，这样无需进一步灭菌，避免重复融化和冷却。
抗生素的贮液和工作液浓度
①以水为溶剂的抗生素贮存液应用0.22 μm滤器过滤除菌；
②用乙醇溶解的抗生素溶液无须过滤除菌；
③所有抗生素贮液都应放于不透光的容器中保存。
注意：镁离子是四环素的拮抗剂。
对于以四环素为筛选抗性的细菌，应使用不含镁离子的培养基，如LB培养基。
下面是常用抗生素的贮液浓度及工作浓度
氨苄青霉素贮液浓度50 mg/ml 溶于水-20℃保存工作浓度20 μg/ml （严紧型质粒）60 μg/ml （松弛型质粒）
羧苄青霉素贮液浓度50 mg/ml 溶于水-20℃保存工作浓度20 μg/ml （严紧型质粒）60 μg/ml （松弛型质粒）
氯霉素贮液浓度34 mg/ml 溶于乙醇-20℃保存工作浓度25 μg/ml （严紧型质粒）170 μg/ml （松弛型质粒）
卡那霉素贮液浓度10 mg/ml 溶于水-20℃保存工作浓度10 μg/ml （严紧型质粒）50 μg/ml （松弛型质粒）
链霉素贮液浓度50 mg/ml 溶于水-20℃保存工作浓度10 μg/ml （严紧型质粒）50 μg/ml （松弛型质粒）
四环素贮液浓度 5 mg/ml 溶于乙醇-20℃保存工作浓度10 μg/ml （严紧型质粒）50 μg/ml （松弛型质粒）
质粒类型：。
