膜基结合力的划痕法实验分析(1)

第1篇一、实验背景细胞划痕实验是一种常用的细胞生物学实验方法，主要用于研究细胞迁移、增殖和细胞间通讯等生物学过程。

通过在细胞培养板上划痕，模拟细胞在伤口愈合和组织修复过程中的行为，从而研究细胞迁移能力。

本实验旨在探究细胞在不同条件下的迁移能力，为细胞生物学研究提供实验依据。

二、实验目的1. 了解细胞划痕实验的基本原理和方法。

2. 掌握细胞划痕实验的操作技能。

3. 分析细胞在不同条件下的迁移能力。

三、实验原理细胞划痕实验是通过在细胞培养板上划痕，模拟细胞在伤口愈合和组织修复过程中的行为，从而研究细胞迁移能力。

实验过程中，细胞在划痕区域受到损伤，随后会启动一系列信号传导和基因表达，使细胞向划痕区域迁移，填补损伤区域。

四、实验材料与仪器1. 材料与试剂：- 细胞培养板- 细胞培养液- 划痕工具（如：微针）- 染料（如：结晶紫）2. 仪器：- 光学显微镜- 相机- 细胞培养箱- 恒温培养箱五、实验步骤1. 将细胞接种于细胞培养板，培养至一定密度。

2. 使用划痕工具在细胞培养板上划痕。

3. 用PBS清洗细胞培养板，去除划痕区域周围的细胞。

4. 加入适量染料，使细胞染色。

5. 将细胞培养板放入光学显微镜下观察并拍照。

6. 比较不同条件下的细胞迁移能力。

六、实验结果与分析1. 结果展示通过观察实验结果，发现不同条件下的细胞迁移能力存在差异。

在正常培养条件下，细胞迁移能力较强；而在抑制细胞迁移的条件下，细胞迁移能力明显减弱。

2. 结果分析（1）细胞迁移能力与细胞密度相关。

在较高细胞密度下，细胞迁移能力减弱，可能是因为细胞之间的相互抑制。

（2）细胞迁移能力与细胞类型相关。

不同类型的细胞具有不同的迁移能力，如上皮细胞和间质细胞。

（3）细胞迁移能力与细胞生长条件相关。

在适宜的生长条件下，细胞迁移能力较强。

（4）细胞迁移能力与细胞信号通路相关。

抑制细胞信号通路，如RhoA、MAPK等，可降低细胞迁移能力。

七、结论细胞划痕实验是一种研究细胞迁移能力的重要方法。

《Al-Nd合金镀层及微弧氧化膜的制备与性能研究》篇一摘要：本文针对Al-Nd合金镀层及微弧氧化膜的制备工艺、结构特征和性能进行了系统研究。

通过多种实验方法，探讨了制备过程中各参数对镀层及膜层性能的影响，并对结果进行了分析讨论。

本研究旨在为相关领域的科研与实际应用提供理论依据和技术支持。

一、引言随着科技的发展，金属表面处理技术日益受到重视。

Al-Nd 合金镀层因其良好的耐腐蚀性、高硬度及优良的机械性能，在航空航天、汽车制造、电子封装等领域有着广泛的应用。

微弧氧化技术作为一种新兴的表面处理技术，能够在金属表面形成一层致密、结合力强的陶瓷膜层，显著提高金属的耐腐蚀性和硬度。

因此，对Al-Nd合金镀层及微弧氧化膜的制备与性能进行研究具有重要的现实意义。

二、实验材料与方法1. 实验材料实验所使用的Al-Nd合金材料，以及相关的化学试剂和设备。

2. 制备方法（1）Al-Nd合金镀层的制备：采用特定的电镀工艺，通过控制电流密度、电镀时间等参数，在基体上制备Al-Nd合金镀层。

（2）微弧氧化膜的制备：利用微弧氧化设备，通过调整电解液成分、电压、时间等参数，在Al-Nd合金镀层上形成微弧氧化膜。

三、结果与讨论1. Al-Nd合金镀层的制备与结构特征通过控制电镀过程中的电流密度和时间，可以获得不同厚度和成分的Al-Nd合金镀层。

镀层表面光滑，结晶致密，具有良好的金属光泽。

XRD和SEM等分析手段表明，镀层中Al和Nd的分布均匀，无明显偏析现象。

2. 微弧氧化膜的制备与结构特征微弧氧化膜的制备过程中，电解液成分、电压和时间等参数对膜层的性能有着显著影响。

通过调整这些参数，可以获得不同厚度和性能的微弧氧化膜。

膜层表面光滑，结合力强，具有较高的硬度和耐腐蚀性。

XRD和SEM分析表明，膜层主要由氧化物组成，具有陶瓷般的结构特征。

3. 性能测试与分析（1）耐腐蚀性：通过盐雾试验和电化学腐蚀试验，发现Al-Nd合金镀层及微弧氧化膜均具有优异的耐腐蚀性。

表面技术第53卷第5期高温对含氢DLC涂层的微观结构及力学性能的影响贾伟飞1，梁灿棉2，胡锋1,2*（1.武汉科技大学 高性能钢铁材料及其应用省部共建协同创新中心，武汉 430081；2.广东星联精密机械有限公司，广东 佛山 528251）摘要：目的针对含氢DLC涂层热稳定性很差的问题，探究高温下含氢DLC涂层的微观组织变化特征，以及高温对其力学性能的影响。

方法采用等离子体强化化学气相沉积（Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition, PECVD）在S136模具不锈钢表面沉积以Si为过渡层的含氢DLC复合涂层，利用光学显微镜、扫描电镜、拉曼光谱、X射线电子衍射仪、三维轮廓仪研究DLC涂层的微观结构，采用划痕测试仪、往复式摩擦磨损试验机、纳米压痕仪研究DLC涂层的力学性能，并通过LAMMPS软件，利用液相淬火法建立含氢DLC模型，模拟分析经高温处理后涂层的组织变化特征和纳米压痕行为。

结果在400 ℃、2 h的退火条件下，拉曼谱峰强度I D/I G由未退火的0.7增至1.5，涂层发生了石墨化转变，同时基线斜率下降，H元素析出；XPS结果表明，在此条件下涂层中sp2杂化组织相对增加，氧元素增多，涂层粗糙度增大；在600 ℃、2 h退火条件下，DLC发生了严重氧化，LAMMPS模拟结果表明，在400 ℃高温下涂层的分子键长变短，表明sp3杂化组织在高温下吸收能量，并向sp2杂化转变。

纳米压痕模拟结果显示，在400 ℃下退火后，涂层的硬度下降。

结论在400 ℃下退火处理后，涂层中的H元素释放，涂层内应力减小，保证了涂层的强度；在600 ℃退火条件下，过渡层的Si和DLC在高温下形成了C—Si键，使得DLC薄膜部分被保留；LAMMPS 模拟结果表明，在高温下涂层发生了石墨化转变，涂层的硬度减小。

关键词：含氢DLC涂层；退火处理；微观组织；力学性能；LAMMPS模拟中图分类号：TB332 文献标志码：A 文章编号：1001-3660(2024)05-0174-10DOI：10.16490/ki.issn.1001-3660.2024.05.018Effect of High-temperature on Microstructure and MechanicalProperties of Hydrogen-containing DLC CoatingJIA Weifei1, LIANG Canmian2, HU Feng1,2*(1. Collaborative Innovation Center for Advanced Steels, Wuhan University of Science and Technology, Wuhan 430081,China; 2. Guangdong Xinglian Precision Machinery Co., Ltd., Guangdong Foshan 528251, China)ABSTRACT: The thermal stability of hydrogen-containing DLC coating is poor, and the work aims to explore the microstructure changes of hydrogen-containing DLC coating at high temperature and their impact on mechanical properties. The收稿日期：2023-01-09；修订日期：2023-05-18Received：2023-01-09；Revised：2023-05-18基金项目：中国博士后科学基金（2021M700875）Fund：China Postdoctoral Science Foundation (2021M700875)引文格式：贾伟飞, 梁灿棉, 胡锋. 高温对含氢DLC涂层的微观结构及力学性能的影响[J]. 表面技术, 2024, 53(5): 174-183.JIA Weifei, LIANG Canmian, HU Feng. Effect of High-temperature on Microstructure and Mechanical Properties of Hydrogen-containing DLC Coating[J]. Surface Technology, 2024, 53(5): 174-183.*通信作者（Corresponding author）第53卷第5期贾伟飞，等：高温对含氢DLC涂层的微观结构及力学性能的影响·175·hydrogen-containing DLC composite coating with Si as the transitional layer was deposited on the surface of S136 stainless steel by plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD). The microstructure of DLC coating was investigated by optical/scanning electron microscopy, Raman spectroscopy, XPS (X-ray photoelectron spectroscopy) and three-dimensional profiler, the mechanical properties of DLC coating were studied by scratch, reciprocating friction wear and nano-indentation experiment, and the nano-indentation experiment behavior of DLC coating was simulated by LAMMPS to analyze the microstructure characteristics in annealing. The coating was subject to annealing conditions of 400 ℃for 2 hours and 600 ℃for 2 hours. Under the former condition, Raman spectroscopy showed an increase in the intensity ratio of the I D/I G peaks from0.7 to 1.5, indicating graphitization transition, accompanied by a decrease in baseline slope and H element segregation. XPSanalysis revealed an increase in sp2 hybridization and oxygen content in the coating under this condition, as well as an increase in surface roughness. At 600 ℃, severe oxidation of the DLC coating was observed. Under that condition, the matrix stainless steel was also oxidized. Molecular dynamics simulations using LAMMPS suggested a decrease in molecular bond length at 400 ℃high temperature. The three-dimensional profile test showed that the roughness under the unannealed condition was mainly from the large particles produced during deposition. At 400 for 2℃h, the coating had the minimum surface roughness. At this time, some large particles in the coating structure fell off, and the coating was basically completely damaged at 600 for℃ 2 h. The roughness was mainly from the original stainless steel roughness. The scratch test showed that under the condition of 400 for℃2 h, due to the release of the internal stress of the coating and the tighter bonding of the transition layer, the coating had the bestbonding effect with the substrate and was the least likely to fall off. The statistical results of LAMMPS simulation showed that the chemical bonds of the original DLC model tended to become shorter after annealing at high temperature. Relative to the unannealed DLC coating, the mechanical properties of DLC coating were best under 400 for℃ 2 h. Under this condition, the precipitation of mixed H elements in the coating led to the transformation of the original C—H sp3 structure, which occupied a large space to the smaller C—C sp3 and C—C sp2 structure, releasing internal stress in the coating, while ensuring the strength.The nano-indentation experiments showed that the elastic recovery and hardness of the coating were the highest at 400 for℃ 2 h, compared with that at other annealing temperature. The structure of the DLC coating containing hydrogen changed due to the precipitation of H element at 400 ℃. On the one hand, the coating structure changed from sp3 to sp2 due to high temperature, and on the other hand, the precipitation of H element changed the original C—H sp3 to C—C sp3, reducing the internal stress of the coating and improving the mechanical properties. The coating is basically damaged at 600 for 2 h, but the substrate still℃retains part of the coating. This is because the transition layer Si reacts with the coating to improve the heat resistance of the remaining coating. Molecular dynamics simulations using LAMMPS showed that the coating undergoes a graphitization transition at high temperature, leading to a reduction in its hardness.KEY WORDS: hydrogen-containing DLC coating; annealing treatment; microstructure; mechanical properties; LAMMPS simulationDLC（Diamond-Like Carbon，类金刚石碳，简称DLC）涂层材料具有超高硬度、低摩擦因数、优良化学稳定性等特点，广泛应用于机械、电子、生物医学等领域[1-3]。

（1）结合力：①锉刀试验。

根据GB/T13913—92，利用热震试验和锉刀试验评价镀层的结合力。

样品在250℃±10℃的电炉内保温1h时，取出后立即投入冷水中，反复进行20次，试样表面仍然完好，无起皮和剥落现象；利用锉刀沿450锉去非主要表面，露出基体金属与镀层的界面，镀层不起皮，说明镀层的结合力良好。

②胶纸试验。

锋利刀片在测试面上割10×10个1×1mm 的方格，用思高牌 3M 600胶纸粘牢刻割处，一分钟后再同一位置撕扯二次。

判定标准：外观无剥落/起皮现象，且附著力在4B级或以上才为合格。

附：著力级别判定方法5B级——割线旁相当光滑，网格上无方格涂层脱落4B级——片状涂层脱落或损伤的面积小于5%3B级——片状涂层脱落或操作的面积在5%-15%之间2B级——片状涂层脱落或操作的面积在15%-35%之间或：10mm×10mm的阳极氧化膜上，以1mm为间距，用锋利的刀刃划出大小均匀的100个小方格(划痕深度控制在保证膜下基体金属暴露)，统计膜脱落的小方格的个数n1后，在膜上的划格区域贴上宽度为24mm的透明胶带，并用重为1500g的钢块推轧5次以保证胶带与膜层之间紧密结合，之后立即用一垂直膜面的力将胶带揭起，并再次统计膜脱落的小方格的个数n2。

评级方法如下:采用百分制，膜结合力分数G=100-(n1+n2)。

③分别用锯磨实验和划痕实验检测四种微弧氧化膜的结合力。

锯磨实验是用手锯锯断试样以检测膜层的结合力，观测表面膜是否出现起泡或剥落。

膜层如无起泡或剥落为合格，否则为不合格。

用划痕实验检测四种膜层的结合力时，用刀片在表面膜上划出间隔3mm的4-6条平行线，划线的压力应使刀片一次划穿膜层直至基体。

划痕后观察试样表面的膜层在划口处是否出现剥落。

如膜层未剥落为合格，否则为不合格。

（2）孔隙率：①由于镁合金上镀层孔隙率没有标准测定方法,本文采用两步法测定。

将用侵蚀液(150g/L氯化钠,10g/L明胶)润湿的试纸贴于样品的表面30min,并保持湿润状态,之后将碱性镁试剂(0.001g镁试剂I溶于100mL的2mol/L氢氧化钾中)滴于试纸上,清点试纸上或样品表面的天蓝色斑点,单位面积上的斑点数即为孔隙率。

膜厚对(Ti,Al)N涂层微结构、机械性能及切削特性的影响苏永要;胡荣;王锦标;冯桐;鲜济遥【摘要】利用蒸发与磁控溅射二元组合源设备,通过控制沉积时间在钨钴类硬质合金螺纹刀表面制备了不同膜厚的(Ti,Al)N涂层.采用X射线衍射仪、扫描电镜、能谱仪、维氏显微硬度计、洛氏硬度计和摩擦试验机考察了涂层厚度对涂层微观结构、表面形貌、元素组成、显微硬度、膜-基结合力及摩擦磨损性能的影响,并通过切削40Cr钢材研究了涂层刀具的切削特性.结果表明,沉积6h所得涂层(膜厚约5.0 μm)的复合硬度(涂层+基材的显微硬度)显著高于沉积2h(膜厚约1.8 μm)所得涂层,但膜-基结合力更弱,磨耗速率更快.【期刊名称】《电镀与涂饰》【年(卷),期】2016(035)018【总页数】5页(P990-994)【关键词】氮化钛铝;涂层;钨钴类硬质合金;刀具;厚度;磁控溅射;真空镀;摩擦学【作者】苏永要;胡荣;王锦标;冯桐;鲜济遥【作者单位】重庆文理学院新材料技术研究院,重庆402160;重庆市高校微纳米材料工程与技术重点实验室,重庆402160;重庆文理学院新材料技术研究院,重庆402160;重庆文理学院新材料技术研究院,重庆402160;重庆市高校微纳米材料工程与技术重点实验室,重庆402160;重庆文理学院新材料技术研究院,重庆402160;重庆文理学院新材料技术研究院,重庆402160【正文语种】中文【中图分类】TG174.444;TB43First-author’s address:Research Institute for New Material Technology, Chongqing University of Arts and Sciences, Chongqing 402160, China (Ti,Al)N涂层是在TiN涂层基础上发展起来的一种三元涂层，Al元素的加入使其具有更高的硬度、高温抗氧化能力及红硬性[1-4]，被广泛应用于交通运输、机械制造、航空航天等领域。

纳米划痕仪测结合力原理
纳米划痕仪是一种用于测量材料表面硬度和结合力的仪器。

它基于一种称为纳米划痕测试的方法，通过在材料表面施加微小的力量并测量产生的划痕来评估材料的性能。

纳米划痕仪的工作原理可以简单地描述为以下几个步骤：首先，仪器会使用一个纳米尖端来施加一个小的力量在材料表面上。

这个力量通常在纳牛顿级别，足够小以避免对材料造成显著的损伤。

然后，纳米尖端会在材料表面上划出一个微小的痕迹。

这个划痕的形状和深度可以提供关于材料硬度和结合力的重要信息。

纳米划痕仪通过测量划痕的形状和深度来评估材料的性能。

通常，仪器会使用一种称为原子力显微镜的技术来观察和测量划痕。

原子力显微镜可以在纳米级别上测量材料表面的形貌和拓扑结构，从而提供高分辨率的划痕图像。

通过分析划痕的形状和深度，可以得出关于材料硬度和结合力的重要信息。

例如，如果划痕较浅且形状较宽，这可能意味着材料较软或结合力较弱。

相反，如果划痕较深且形状较窄，这可能表示材料较硬或结合力较强。

纳米划痕仪在材料科学和工程领域中具有广泛的应用。

它可以用于评估不同材料的硬度、强度和耐磨性，从而帮助科学家和工程师选择合适的材料用于特定的应用。

此外，纳米划痕仪还可以用于研究
材料的微观结构和力学性能，为材料设计和制造提供重要的参考。

纳米划痕仪是一种用于测量材料表面硬度和结合力的重要工具。

它通过施加微小的力量并测量产生的划痕来评估材料的性能。

通过分析划痕的形状和深度，可以得出关于材料硬度和结合力的重要信息。

纳米划痕仪在材料科学和工程领域中具有广泛的应用，为材料设计和制造提供重要的参考。

细胞划痕实验
细胞划痕实验是一种常用的细胞迁移实验方法，通过创造人工“划痕”来观察细
胞在愈合过程中的迁移和增殖情况，从而研究细胞间的相互作用、信号传导和细胞迁移的机制。

实验原理
在细胞划痕实验中，首先在细胞培养皿中种植一层细胞，在细胞形成单层后，
用刮刀等工具在细胞层中划一条“刀痕”，即人工划伤细胞层。

然后观察细胞在划痕
区的迁移和增殖情况，通过比较划痕前后细胞的变化，可以研究细胞迁移、增殖和愈合过程中的生物学机制。

实验步骤
1.预处理细胞：培养所需的细胞株，并保证细胞活性和纯度。

2.细胞接种：将细胞接种在培养皿中，培养至细胞形成单层。

3.划痕操作：使用刮刀等工具在细胞层中划一条“刀痕”，注意操作要轻
柔并且一致。

4.图像记录：立即在划痕前后拍摄图像，并在不同时间点继续记录细胞
迁移和增殖的情况。

5.数据分析：根据不同时间点的图像，量化分析细胞迁移距离和细胞密
度等指标。

结果解读
通过细胞划痕实验，可以观察到划痕区域细胞的迁移、增殖及愈合情况。

通常，划痕后细胞会向划痕区域迁移，填补伤口，形成新的细胞层。

通过比较不同处理组的细胞迁移速度、距离和形态等指标，可以揭示细胞因子、信号通路等对细胞迁移的调控机制。

应用领域
细胞划痕实验在癌症转移、组织再生、损伤修复等研究领域具有广泛的应用。

在癌症转移研究中，可以通过划痕实验检测抗转移药物的疗效；在组织工程和再生医学中，可以评估生物材料对细胞迁移和愈合的影响。

细胞划痕实验是一种简单有效的细胞迁移实验方法，虽然存在一些局限性和技
术挑战，但在研究细胞迁移和增殖等问题上仍具有重要的应用意义。

金刚石涂层基体间结合力的测定李建国;胡文军【摘要】结合力是制约金刚石涂层工具大规模应用的关键因素之一.针对热丝化学气相沉积制备的金刚石薄膜的膜基结合力进行划痕实验,运用划痕仪所测的声发射数据、摩擦力数据及光学、电子扫描划痕形貌来综合评定膜基结合力.评定结果表明:单一的声发射图谱或摩擦力曲线不能准确判定膜基结合力的表征值临界载荷,声发射图谱、摩擦力曲线与划痕形貌综合评定临界载荷结果才可信.%The adhesion between diamond film and substrate is one of the key factors limiting the diamond coating tools to be applied in a large scale. The diamond films were deposited by hot filament chemical vapor deposition on silicon substrate. The scratch tracks made with a micro - scratch tester (MST) were characterized with an optical microscope. The adhesion at the interface of the diamond films and the substrate were then evaluated by calculating the acoustic emission and frictional force data obtained with the MST, and the optical images micrographs of the scratches. The results show that neither acoustic emission spectra nor friction force curve can exclusively determine the adhesion strength; the critical load and the interfacial adhesion can only be precisely evaluated by combining the acoustic emission spectra, the friction force curve and the scratch truck morphologies.【期刊名称】《中国测试》【年(卷),期】2012(038)002【总页数】4页(P13-16)【关键词】金刚石涂层;结合强度;划痕试验;临界载荷;评定【作者】李建国;胡文军【作者单位】中国工程物理研究院总体工程研究所,四川绵阳621900;中国工程物理研究院总体工程研究所,四川绵阳621900【正文语种】中文【中图分类】TB874;O642.20 引言金刚石涂层具有高硬度、高耐磨性、低摩擦系数、高化学稳定性等一系列与金刚石膜相似的优异性能，因此在很多领域得到了应用。

基于UMT试验机可控环境的划痕实验装置任婧;秦力;王水生【摘要】A new environment controllable scratch experimental device is designed on the UM T micro-friction and wear tester ,and it can be used to study the indentation response characteristics of materials under different temperature and humidity ,and expand the direction and range of the equipment .The controlled environment scratch experiment of the DLC film on the developed experimental device is carried out .The experimental results show that the different temperatures and humidities have the comparatively important influence on the study of binding force of the DLC film .Moreover ,this scratch device can effectively judge the critical load , improve the accuracy of the scratch experiment , and accurately achieve the measurement of the scratch experiment in a given environment .%在UMT微摩擦磨损试验机上设计了一种新的环境可控的划痕实验装置,可开展不同温度、不同湿度下材料压痕响应特性研究,开拓了设备的使用方向和范围.在研制的实验装置上对DLC膜进行可控环境划痕实验,实验结果表明,不同温度以及湿度对DLC膜的结合力研究有着比较重要的影响.且此套划痕装置可以有效地判断临界载荷,提高了划痕实验的准确性,准确地实现在给定环境下划痕实验的测量.【期刊名称】《实验技术与管理》【年(卷),期】2018(035)001【总页数】5页(P76-79,91)【关键词】划痕实验装置;结合力;可控环境【作者】任婧;秦力;王水生【作者单位】清华大学机械工程系 ,北京 100084;清华大学摩擦学国家重点实验室 ,北京 100084;清华大学机械工程系 ,北京 100084;清华大学摩擦学国家重点实验室 ,北京 100084;河北旅游职业学院机电工程系 ,河北承德 067000【正文语种】中文【中图分类】TB383硬质薄膜的失效源于微小变形损伤和缺陷，而膜基结合力是硬质薄膜非常重要的力学性能，其表征是研究硬质薄膜工艺以及应用的重要环节[1]。

划痕实验：1.细胞接种到六孔板中，每孔接约5×105 个细胞（SMMC7721，不同细胞具体接种数量掌握为24 h能铺满板），放入37℃ 5%CO2培养箱培养，20～24 h观察是否铺满板。

待铺满后开始划痕实验。

2.用灭过菌的200uL黄色枪头在每个孔中间划一条痕（枪头垂直划线，每次力度均一，划线要直，一次性划到底，可用板盖当尺子），PBS洗2遍，去除划下的细胞，显微镜拍照（放大倍数为100倍）。

3.换含不同药物的无血清培养液继续培养（空白组用PBS代替药物，每组设3个平行）。

4.24h或48h后拍照（放大倍数为100倍）固定点测量划痕距离是否改变。

5.用Photoshop中的直方图测量间距大小，表示不同组细胞发生迁移的距离。

将对照组迁移距离大小设为100%，实验组迁移比例为：（对照组迁移距离-实验组迁移距离）/对照组迁移距离*100%。

6.数据分析后作图。

如图例：Transwell实验：1、收取处于对数生长期的细胞。

终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2遍，再用无血清培养基重悬，彻底去除血清干扰，调整细胞密度1~5×105个。

2、Transwell小室（孔径大小有不同规格，一般肿瘤细胞选8 μm；迁移实验用普通Transwell小室，侵袭实验用含有基质胶的Transwell小室）里加入制备好的细胞悬液（1×105个），小室内液体总体积为200 μL。

3、24孔板中加入500 μL含10% 胎牛血清的完全培养基。

将Transwell小室放入24孔板中。

特别注意：下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，因此在种板和培养过程中要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。

4、将带有小室的24孔板置于37℃ 5% CO2培养箱中培养，18-48 h后（时间依不同实验不同细胞而定）取出，非贴壁细胞直接计数下层细胞数，贴壁细胞拍照计数小室底部膜上细胞（步骤如下）。

细胞迁移实验干货--划痕小课堂
细胞划痕是一种简单易行的检测细胞迁移的方法，实验成本低，操作方便，在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程，是研究细胞迁移的体外实验中最简单的方法。

当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。

划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。

想必这些大家都很清楚，就不过多阐述，但是作为有多年经验的实验者，在这里也有一些小小的经验，望与大家分享：1）划痕实验很重要的一个因素就是铺板量，不同细胞的大小不一样，铺板量不一样。

就像786-O细胞比较大，96孔板一般铺2-3万细胞/每孔，第二天细胞融合度达到90%以上；而RKO细胞比较小，96孔板一般需要铺7-8万/每孔，第二天细胞融合度差不多达到90%左右。

所以具体要根据细胞大小适当调整，细胞划痕铺板密度一般为70-90%之间。

密度过低，增殖因素可能会影响迁移能力，反之，对于细胞状态会有影响，以至于不能保证实验的客观真实性。

2）细胞的贴壁能力也很重要。

有的细胞贴的不牢，划痕之后不易清洗，只需轻轻换液即可；而有的细胞贴壁比较牢固，可以选择轻轻拍一下，洗去划掉的细胞再换液。

3）最后就是时间点。

细胞划痕实验基本从8h，16h，24h，36h，48h这几个时间点间进行选择，但是具体进行的时间点需要根据细胞的迁移能力进行调整；
对于细胞的迁移而言，为了保证实验的客观真实性，需要我们对细胞的生长特性特别熟悉，可以先安排预实验，来确定正式实验的条件，以保证正式实验顺利的进行。

划痕实验（单层上皮侧向运动）
1、首先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着划，均匀划横线，大约每隔0.5-1cm，至少
5条
2、每孔加入5 x 105个细胞（过夜铺满90%）
3、第二天用枪头比直尺，垂直于横线。

（200ul枪头）
4、PBS洗3次，除去划痕下的细胞，加入无血清培养基
1)观察时间小于1天，不加入血清
2)48h，可用1-4%血清
5、放入培养箱，0,6,12,24h取样拍照
注意：
一般以对照组细胞迁移到整个划痕面的一般或者以上，终止观察
Image J 来测量划痕区域的象数定量比较迁移速度
一般只用于上皮，纤维样的细胞系（迁移能力强；细胞有极性，方便测量；耐无serum （肿瘤半天的死亡率为50%）。