实验一细胞器的活体染色与观察
线粒体活体染色与观察
实验目的
1．掌握细胞器活体荧光标记技术。
2．观察和了解活细胞内线粒体的形态、结构与分布特点。
实验原理
对细胞的结构及功能的研究历来是细胞生物学的主要内容。活体染色是指使生活有机体的细胞或组织着色但对其又无毒害作用的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动。根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是将胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，使这些特殊结构易于被识别。体外活染又称超活染色，它是将活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，用染料溶液浸染，染料被选择性地固定在活细胞的某种结构上而显色。随着细胞生物学的实验研究技术发展，对细胞的研究正经历着从简单到复杂，从静态到动态，从单维度到多维度的发展。其中，细胞器的活体荧光标记技术是现代细胞生物学研究常用的重要实验技术。这种技术可以从分子水平上动态地研究活细胞中的各种生理活动，极大地增强了人们对细胞的认识能力。这种技术能够用来分析细胞的信号转导、物质运输、能量代谢和膜电位的变化等。现在，已经有许多细胞器特异的商业化荧光染料。
Golgi-Tracker Red是一种高尔基体红色荧光探针，可以用于活细胞高尔基体特异性荧光染色。Golgi-Tracker Red为采用Molecular Probes公司的BODIPY TR进行了荧光标记的C5-ceramide。Golgi-Tracker Red可以用于活细胞的高尔基体荧光标记，但不适合用于固定细胞的标记。Golgi-Tracker Red的最大激发光波长为589 nm，最大发射光波长为617 nm。BODIPY-FL-神经酰胺是一种脂类物质，能特异地标记高尔基体。BODIPY-FL-神经酰胺的最大激发光波长是464 nm，最大发射光波长为532 nm。DiO-C6( 3)是一种短链碳酸化氰苷染料，可以标记包括内质网在内的多种膜性细胞器。但是，根据形态、结构特征，内质网很容易被识别。D10-C6(3)的最大激发光波长为484 nm，最大发射光波长为501 nm。罗丹明123是一种阳离子荧光染料。活体线粒体能够产生膜电位，可以吸引罗丹明123进入线粒体。因此，罗丹明123能够特异地标记线粒体。罗丹明123的最大激发光波长为504 nm，最大发射光波长为534 nm。Hoechst 33258是一种可以穿透细
胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。这种染料会结合到DNA的A-T富集区域，所以也常用于普通的细胞核染色或常规的DNA染色。Hoechst 33258的最大激发光波长为346 nm，最大发射光波长为460 nm; Hoechst 33258和双链DNA结合后，最大激发光波长为352 nm，最大发射光波长为461 nm。詹纳斯绿B(Janus green B)可专一性地对线粒体进行活性染色，这是由于线粒体内细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色。中性红( neutral red)对液泡和溶酶体的染色具有专一性，可将活细胞中的液泡和溶酶体染成红色。中性红也可作为荧光染料来标记液泡和溶酶体，其最大激发光波长为541 nm，最大发射光波长为640 nm。
实验用品
1．材料
小白鼠肝细胞
2．试剂
( 1) Ringer液NaCl: 0.85%; KCI: 0.03%; CaCI2: 0.033%。
( 2) 0.02%詹纳斯绿B水溶液。
3．器材
剪刀、镊子、解剖刀、眼科剪、载玻片、盖玻片、吸管、牙签、吸水纸。
实验程序
1．线粒体的活体染色与光学显微镜观察（詹纳斯绿B染色法）
（1）人口腔黏膜上皮细胞线粒体的活体染色与观察’
1)取干净的载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上，滴两滴0.02%詹纳斯绿B染液。
2)实验者用牙签在自己口腔颊黏膜处稍用力刮取上皮细胞，将刮下的黏液状物放人载玻片上的染液中，染色10-15 min（注意不可使染液干燥，必要时可再加染液），盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置于光学显微镜下观察。
3)在低倍镜下，选择平展的口腔黏膜上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。可见扁平状上皮细胞细胞核周围的胞质中，分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即为线粒体。
（2）小白鼠肝细胞线粒体的活体染色与观察
1)用脊椎脱臼法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝边缘较薄的肝组织块，放人表面皿内。用吸管吸取Ringer液，反复浸泡冲洗肝脏，洗去血液。
2)在干净的凹面载玻片的凹穴中，滴加0.02%詹纳斯绿B染液，再将肝组织块移人染液，注意不可将组织块完全淹没，要使组织块上半部分露在染液外，这样细胞内的线
粒体酶系可充分氧化，易被染色。当组织块边缘被染成蓝绿色即可（一般需染20-30 min）。
3)吸去染液，滴加Ringer液，用眼科剪将组织块着色部分剪碎，使细胞或细胞群散出。然后，用吸管吸取分离出的细胞悬液，滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片进行观察。
4)在低倍镜下选择不重叠的肝细胞，在高倍镜或油镜下观察，可见具有1-2个核的肝细胞质中，有许多被染成蓝绿色的线粒体，注意其形态和分布状况。
(3)洋葱鳞茎表皮细胞线粒体的活体染色与观察
1)用吸管吸取0.020-/0詹纳斯绿B染液，滴一滴于干净的载玻片上。然后撕取一小片洋葱鳞茎内表皮，置于染液中，染色10-15 min。
2)用吸管吸去染液，加一滴Ringer液，注意使内表皮组织展平，盖上盖玻片进行观察。
3)在高倍镜下，可见洋葱表皮细胞中央被一大液泡所占据，细胞核被挤至一侧贴细胞壁处，仔细观察细胞质中线粒体的形态与分布。‘
实验二细胞的原代培养
【实验目的】
1．熟悉并掌握原代培养中取材、消化及无菌操作等基本实验技术。
2．了解细胞原代培养的原理及其方法。
【实验原理】
原代培养( primary culture)是从供体取得组织或细胞后在体外进行的首次培养，是建立各种细胞系的第一步。原代培养的细胞由于刚刚离体，生物学特性与在体细胞接近，故在各种细胞生物学实验中有广泛应用，较适合进行药物测试、细胞分化等实验。
原代培养的方法很多，最基本的方法有两种，即组织块法和消化法。组织块法是最常用的原代培养方法，该方法利用刚刚离体的、有旺盛生长活力的组织作为实验材料，将其剪成小块接种在培养瓶中，大约24h后，细胞即可从贴壁的组织块四周游出并生长。
利用组织块法进行的原代培养，操作过程简便、易行，培养的细胞较易存活，在对一些来源有限、数量较少的组织进行原代培养时，选择该法尤为合适。
消化法是一种结合化学与生化手段进行的原代培养方法。该方法的主要特点是利用消化试剂将较小体积的动物组织中妨碍细胞生长的间质（基质、纤维等）加以分解、消化，使组织中结合紧密的细胞连接松散、相互分离，形成含单细胞或细胞团的悬液，因
