大鼠肝组织RNA提取策略与注意事项

RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS（溶液均需用DEPC处理过的水配制）。

操作步骤：1. 匀浆处理a. 植物组织:以叶片RNA提取为例.取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在Trizol中研磨,研磨要迅速,最好不要超过1min.，大约100mg 叶片使用1 ml Trizol.b. 动物组织:以鼠肝脏RNA提取为例.取新鲜或-70℃冻存组织,每50-100mg组织加1ml Trizol,用匀浆仪进行匀浆处理.样品体积一般不要超过Trizol体积的10%.c. 单层培养细胞.直接在培养板中加入Trizol裂解细胞,每10cm2面积加1ml Trizol.用取样器吹打几次.注意:Trizol加量根据培养板面积决定,不是由细胞数决定.如果Trizol加量不足,可能导致提取的RNA中有DNA污染.d.细胞悬液:离心取细胞，每5-10×106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml Trizol。

加Trizol 前不要洗涤细胞，以免降解mRNA。

一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理。

e.血液处理:直接取新鲜的血液,加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10min，10 000rpm 离心1min。

弃上清，收集白细胞沉淀。

每1ml血液收集的白细胞沉淀中加入1ml Trizol。

2. 将匀浆样品在15-30℃放置5mim，使得核酸蛋白复合物完全分离。

3. 可选步骤:4 ℃10 000rpm离心10min，取上清。

如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等，可离心去除。

离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。

处理脂肪组织样品时，上层是大量油脂，应除去。

取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。

4. 每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置3min。

一、枪头和EP管等的消毒灭菌1、用去离子水配制0.1%（千分之一）的DEPC（剧毒物），须在通风橱中小心使用，避光，密闭4℃保存;DEPC水是用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压消毒的MiliQ纯水。

经检测不含 RNase、DNase和proteinase。

2、将枪头和EP管放入0.1%的DEPC内，保证枪头和EP管内都充满0.1%的DEP,3、避光、静置、过夜（12-24 h）4、装枪头和EP管的盒子不需要用DEPC浸泡，将枪头或者EP管内的DEPC水大致去除干后，装起，包好5、121摄氏度，30min6、180摄氏度，干燥数个钟头（至少3小时以上）。

注意：a、处理DEPC时需要戴乳胶手套、口罩！b、或者不用DEPC消毒，130℃，90min高压灭菌（许多实验室高温灭菌两次）二、RNA提取注意事项1、组织 RNA 抽提失败的两大现象是： RNA 降解和组织内杂质的残留。

关于降解问题，首先看一下为什么从培养细胞中抽提 RNA 不容易降解。

现有的RNA 抽提试剂，都含有快速抑制 Rnase 的成分。

在培养细胞中加入裂解液，简单的混匀，即可使所有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻底裂解。

细胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的 Rnase，所以 RNA 得以保持完整。

也就是说，培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触，所以其 RNA 不容易被降解；反过来讲，组织中的 RNA 之所以容易被降解，是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致。

因此，假定有一种办法，在抑制 RNA 活性的同时能使组织变成单个细胞，降解问题也就可以彻底解决了。

液氮碾磨就是最有效的这样一种办法。

但是，液氮碾磨方法非常麻烦，如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。

这样就产生了退而求其次的方法：匀浆器。

匀浆器方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制 Rnase 活性这个问题，而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的 Rnase 降解 RNA 的速度快。

RNA提取的操作步骤、注意事项和常见问题分析RNA的提取准备试剂：氯仿，异丙醇，75�G乙醇，无RNase的水或0.5�GSDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)操作步骤:1. 匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml TRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。

样品体积不应超过TRIzol体积10�G。

b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。

TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。

TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。

加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。

一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。

离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。

处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。

取澄清的匀浆液进行下一步操作。

5. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

6. 2-8℃10000×g离心15分钟。

样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。

RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol 试剂的60�G。

7. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。

用异丙醇沉淀水相中的RNA。

每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

8. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。

一、枪头和EP管等的消毒灭菌1、用去离子水配制0.1% （千分之一）的DEPC（剧毒物），须在通风橱中小心使用，避光，密闭4C保存；DEPC水是用DEPC（diethypyrocarbonate ，焦碳酸二乙酯）处理过并经高温高压消毒的MiliQ纯水。

经检测不含RNase、DNase 和proteinase。

2、将枪头和EP管放入0.1%的DEPC内，保证枪头和EP管内都充满0.1%的DEP,3、避光、静置、过夜（12-24 h ）4、装枪头和EP管的盒子不需要用DEPC浸泡，将枪头或者EP管内的DEPC水大致去除干后，装起，包好5、121 摄氏度，30min6、180摄氏度，干燥数个钟头（至少3小时以上）。

注意：a、处理DEPC时需要戴乳胶手套、口罩！b、或者不用DEPC消毒，130C, 90min高压灭菌（许多实验室高温灭菌两次）二、R NA提取注意事项1、组织RNA抽提失败的两大现象是：RNA降解和组织内杂质的残留。

关于降解问题，首先看一下为什么从培养细胞中抽提RNA不容易降解。

现有的RNA抽提试剂，都含有快速抑制Rn ase的成分。

在培养细胞中加入裂解液，简单的混匀，即可使所有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻底裂解。

细胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的Rnase,所以RNA得以保持完整。

也就是说，培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触，所以其RNA不容易被降解；反过来讲，组织中的RNA之所以容易被降解，是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致。

因此，假定有一种办法，在抑制RNA 活性的同时能使组织变成单个细胞，降解问题也就可以彻底解决了。

液氮碾磨就是最有效的这样一种办法。

但是，液氮碾磨方法非常麻烦，如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。

这样就产生了退而求其次的方法：匀浆器。

匀浆器方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制Rn ase活性这个问题，而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的Rnase降解RNA的速度快。

大鼠肝脏总RNA的提取（液氮研磨法）
1）从-80℃冰箱中取出保存的大鼠肮脏样品，用液氮速冻后迅速研磨成细粉，取约0.1g细粉于1.5ml离心管中（动作尽量迅速，避免RNA降解）；
2）加入1ml TRIzol，用力摇动使混合均匀，室温下放置5min；
3）12,000g，4℃离心10min，将上清液（800μl）吸入一新的1.5ml离心管中；4）加入0.2ml氯仿（按照0.2mL氯仿/1mL TRIzol），用力振荡15sec，室温放置2~3min，12,000g，4℃离心15min；
5）将离心管倾斜成45度，将上清液（约400μl）吸入一新的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇后，颠倒混匀，室温放置10min；
6）12,000g，4℃离心10min，弃上清；
7）加入1ml 75%乙醇洗涤沉淀，7,500g，4℃离心5min，弃上清；再重复此步骤1~2次；
8）沉淀室温下干燥5~10min，加50µl RNase-free water溶解RNA，55~60℃水浴10min，使RNA充分溶解；
9）吸取部分RNA进行电泳和检测浓度等，其余的贮存于-80℃冰箱中备用。

在做Northern等杂交实验、构建cDNA文库、获取能够编码真核生物蛋白的基因、获得RNA 病毒基因时，会用到RNA提取和RT-PCR技术。

真核生物的基因组是DNA，为什么不直接从DNA PCR得到我们需要的基因呢？因为真核生物的基因含有大量的非编码区，称为内元（intron），真正编码蛋白的区段是被这些内元隔开的，这些编码区叫做外元（exon）。

真核生物的DNA转录成为RNA之后，经过剪切和拼接，去掉这些非编码区，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻译成蛋白质。

所以，如果直接从真核生物的基因组DNA获取目的基因，克隆再表达，试图获取目的蛋白的思路是行不通的，因为获取的DNA里面会含有非编码区。

要表达真核生物的基因并表达出相应的蛋白，只能通过提取其mRNA并RT-PCR这条颇费周折的途径。

1.RNA的提取RNA的提取其实原理很简单：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。

但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA 降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。

1.1 分离高质量RNA成功的cDNA合成来自高质量的RNA。

高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。

RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。

一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。

一般不必使用oligo(dT)选择性分离poly(A)+RNA。

不管起始模板是总RNA还是poly(A)+ RNA，都可以检测到扩增结果。

另外，分离poly(A)+RNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。

然而，当分析稀有mRNA时，poly(A)+RNA会增加检测的灵敏度。

1.2 RNA提取的最大影响因素-RNA酶在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。

而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。

RNA提取准备工作及注意事项RNA提取是分子生物学实验中常用的操作步骤之一，它是从细胞或组织中提取RNA分子的过程。

在进行RNA提取前，需要进行一系列的准备工作以及注意事项，以确保提取出的RNA质量好、纯度高。

下面是RNA提取的准备工作及注意事项的详细介绍。

一、实验前准备1.实验器材准备：常用的器材有离心管、离心机、恒温水浴器、pH计、显微镜等，根据实验的需要选择相应的器材，并确保所有器材都经过充分的洗涤和消毒。

2.试剂准备：RNA提取试剂盒通常包括缓冲液、酚-氯仿、异丙醇等，根据试剂盒的说明书准备相应的试剂溶液，并保证试剂的纯度和保存状态。

3.工作区准备：RNA提取实验应在清洁、干净的台面上进行。

实验室湿度应保持在50-60%之间，温度保持在20-25°C之间，以防止RNA降解和污染。

二、实验注意事项1. 避免污染：RNA易受到RNase的污染，因此，实验操作时应避免污染源。

严格控制实验室环境的清洁程度，使用无RNase酶的试剂和离心管，避免直接接触RNase。

2. 快速操作：RNA易被RNase降解，因此在提取过程中应尽量减少操作时间。

在每一个步骤中，应迅速进行，尽量避免长时间的搅拌和振荡。

4.酚-氯仿提取法：酚-氯仿法是一种经典的RNA提取方法，但需要注意的是，该方法中酚对人体有毒，因此在操作时应注意避免接触皮肤和吸入。

5.商业试剂的选择：市场上有许多RNA提取试剂盒可供选择，根据实验需求和预算，选择可靠的商业试剂。

确保试剂的批次一致，并严格按照说明书操作。

6.RNA样品的保存：提取得到的RNA样本应立即保存在低温条件下，如-80°C冰箱中，以避免RNA的降解和污染。

7.评估RNA质量：提取得到的RNA样品可以通过吸光光度计检测A260/A280比值来评估其纯度。

通常来说，纯度好的RNA样品A260/A280比值应在1.8-2.0之间。

总结：RNA提取是一项关键的实验步骤，准备工作和注意事项的严格执行对RNA提取的结果和后续实验的顺利进行非常重要。

RNA提取心得/经验/体会/纪律（RNA提取注意事项）！纪律一：杜绝外源酶的污染。

注意一：操作环境干净无灰尘，严格戴好口罩，手套。

注意二：实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。

注意三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。

纪律二：阻止内源酶的活性注意四：选择合适的匀浆方法。

注意五：选择合适的裂解液。

注意六：控制好样品的起始量。

纪律三：明确自己的抽提目的注意七：任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。

注意八：RNA 抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。

Rnase 污染的10大来源1：手指头–手指头是外源酶的第一来源，所以必需戴手套并且频繁更换。

另外，口罩也必需戴，因为呼吸也是一个重要的酶来源。

戴手套口罩的另外的好处是保护实验人员。

2：枪头，离心管，移液器–单纯的灭菌是不能灭活 Rnase 的，所以枪头和离心管要用 DEPC 处理，即使是标明为 DEPC 处理过的。

移液器最好是专用的，用前用 75% 的酒精棉球搽拭干净，尤其是杆子；另外，一定不要使用褪头器。

3：水/缓冲液–一定要确保无 Rnase 污染。

4：实验台面–最起码要用 75% 的酒精棉球搽拭干净。

5：内源 Rnase –所有组织均含内源酶，故组织用液氮速冻是降低降解的最好办法。

液氮保存/碾磨方法的确不方便，但对有一些内源酶含量很高的组织，却是唯一的办法。

6：RNA 样品– RNA 抽提产物可能都会含痕量的 Rnase 污染。

7：质粒抽提–质粒抽提往往用到 Rnase 降解 RNA，残留的 Rnase 要用Proteinase K 消化，PCI 抽提。

8：RNA 保存–即使低温保存，痕量的 Rnase 亦会导致 RNA 降解。

长期保存RNA 的最好办法是盐/醇悬液，因为醇在低温时抑制所有的酶活性。

9：阳离子 (Ca, Mg) –在含这些离子时，80C 加热 5 分钟会导致 RNA 被剪切，故如果 RNA 需要被加热，保存液需要含螯合剂 (1mM Sodium Citrate, pH 6.4)。

一、概述RNA提取是生物学研究中的重要步骤，它涉及到从细胞或组织中提取出RNA分子，为后续的分子生物学实验和分析提供基础数据。

在RNA提取过程中，有许多关键步骤和注意事项需要注意，才能确保提取到高质量的RNA样品。

本文将重点介绍RNA提取过程中的关键步骤及注意事项。

二、样品采集和保存1. 样品的采集要尽量避免受到外界环境的污染，采集器具要事先经过严格的消毒处理。

2. 采集后的样品应立即冷藏或置于液氮中保存，避免RNA降解。

三、细胞破碎1. 细胞破碎是RNA提取的第一步，直接影响到RNA的得率和质量。

常用的方法包括酚-氯仿法、超声波法和离心破碎法等。

2. 选择合适的细胞破碎方法，要充分破碎细胞膜，释放出RNA分子，同时避免RNA的降解。

四、蛋白质沉淀1. 蛋白质沉淀的目的是去除DNA和蛋白质，以纯化RNA。

常用的方法包括酚-氯仿法和硅胶柱法。

2. 在进行蛋白质沉淀时，要注意去除酚相和混合相中的DNA和蛋白质，以免对RNA纯化产生影响。

五、RNA沉淀和洗涤1. RNA沉淀的方法有乙醇沉淀法和硅胶柱法等，选择合适的方法要根据样品的特点和后续实验的需要进行。

2. 在RNA洗涤的过程中，要充分去除盐和其他杂质，以保证提取到干净的RNA样品。

六、RNA溶解和质量检测1. RNA溶解的过程要充分溶解RNA，并保证溶解液的质量纯净。

2. 对提取得到的RNA样品进行浓度和完整性的检测，以确保RNA的质量达标。

七、总结RNA提取是分子生物学研究中的重要步骤，本文介绍了RNA提取过程中的关键步骤和注意事项。

通过严格控制每个步骤，可以保证提取到高质量的RNA样品，为后续的实验和分析提供可靠数据。

希望本文能够帮助读者更好地理解RNA提取过程，并在实验操作中取得更好的效果。

八、RNA存储和稳定性1. 存储RNA样品时，应尽量避免反复冻融，因为这样容易导致RNA 降解。

合适的储存温度通常为-80摄氏度。

2. 另外，干燥的RNA样品更容易保存，因此可以考虑使用适当的稳定剂，如DEPC水或RNAlater等，来保护RNA在样品采集至提取过程中的稳定性。

1.抽提RNA都是为了得到其mRNA，而mRNA和组织的状态密切相关，因此需要超低温的状态，一般选择用液氮保存组织。

而且去的时候要尽可能的新鲜，动作要快，取后立即放入液氮罐中。

2.提取RNA前要对脑组织进行研磨，切记要在液氮中进行，也是为了防止rna的降解。

研磨要充分，使组织块变小。

3.加入trizol后要充分吹打开，目的是使组织中的核蛋白体，多糖等与rna分离。

4.其次是注意外源性的rna酶污染，操作全过程要戴口罩，手套。

操作速度要快，冰上进行。

我做过大鼠下丘脑组织的RT-PCR，在动物房将组织取好先放在RNa－free的EP管中，放在冰盒内，然后再转移到实验室的－70°冰箱内，在抽RNA的时候，脑组织最好要氯仿抽提两次，这个是我在别的地方看到的，但是真的很好用，可以改善RNA抽提的质量。

用生理盐水或PBS冲洗掉血液，分切成50-100mg大小的组织块，早点把提RNA的试剂盒买过来就可以根据说明书加入变性液中（ep管内），－80储存，到时候拿出来组织就很容易撵碎了。

如果试剂盒没到，那就直接放在EP管中，提RNA的时候再拿出来再加也可以。

就是组织可能会不容易撵碎一些。

我觉得你可以用高压过的EDPC处理的水进行清洗（2－3次），后迅速切成合适的大小的组织（具体大小与RNA提取方法相关，我用的是TRNZOL法，一般取50－100mg，）于EP管中，直接放到－80度冰箱，不需要液体浸泡！到时直接取出提取RNA即可！建议你的剪刀、镊子等物品最好DEPC处理过！1.组织块若没有很多血液，可直接冻存；2.若有较多血液，可用生理盐水冲洗；3.我以前取小肠组织时，先剪开自来水冲洗，再生理盐水冲洗；4.一般1cm左右就可以，根据标本将来的用途。

5.直接原组织冻存。

本实验室做过人子宫内膜FGF基因的克隆，方法是从子宫肌瘤切除的人子宫中撕下新鲜内膜组织，冻存与液氮总备用，实验前在液氮中充分研磨后提取总RNA。

RNA提取实验操作步骤、注意事项及问题指南RNA提取是一项重要的实验技术，也是分子生物学和基因表达研究的前提之一。

RNA提取的操作步骤、注意事项和可能出现的问题是影响实验结果的关键因素。

本文将介绍RNA提取实验的操作步骤、注意事项和问题指南，以便帮助读者更好地完成RNA提取实验。

RNA提取实验操作步骤1. 样本的准备在实验开始前，需要准备好样本。

样本可以是组织、细胞、菌落等，在RNA提取中通常使用 TRIzol 或 RNeasy 等试剂进行样品裂解和提取。

样本的数量和来源需要根据实验的需要来决定。

2. 细胞裂解样品准备好之后，需要进行细胞裂解，使细胞内部的 RNA 释放出来。

裂解的方法可以是机械裂解、化学裂解或声波裂解等。

3. RNA 的提取和纯化经过细胞裂解后，需要使用 RNA 提取试剂对 RNA 进行提取和纯化。

经过提取和纯化后，可以通过检测 A260/A280 值的比例来确定 RNA 的纯度和浓度。

4. 聚合酶链式反应（PCR）检测经过 RNA 的提取和纯化之后，需要进行 PCR 检测，确定 RNA 是否已经被成功提取和纯化。

PCR 检测需要使用适当的引物和探针，并遵守相应的反应条件和分析方法。

RNA提取实验注意事项1. 样品选择选择合适的样品，保证样品的活性和稳定性。

不同类型的样品需要使用不同的RNA 提取试剂，因此需要选择适当的试剂和方法。

2. 操作规范在 RNA 提取过程中，需要保持操作规范，如穿戴实验手套和实验衣服等，避免 RNA 受到污染。

在实验过程中要注意操作细节，如注射器和离心管应保证干净和无漏，对样品的取用和储存要进行标记和记录。

3. RNA 的质量控制在 RNA 提取的过程中，需要进行质量控制，如测定 RNA 的纯度和浓度等。

在进行下一步操作之前，必须检查 RNA 的质量和质量指标，如 A260/A280 值的比例要在 1.8 ~ 2.0 之间， RNA 的完整性要保证。

一、枪头和 EP 管等的消毒灭菌1、用去离子水配制 0.1% （千分之一）的 DEPC（剧毒物），须在通风橱中小心使用，避光，密闭 4℃保存 ;DEPC 水是用 DEPC(diethypyrocarbonate ，焦碳酸二乙酯 ) 处理过并经高温高压消毒的 MiliQ 纯水。

经检测不含 RNase、 DNase 和 proteinase 。

2、将枪头和 EP 管放入 0.1% 的 DEPC 内，保证枪头和 EP 管内都充满 0.1% 的 DEP,3、避光、静置、过夜（ 12-24 h ）4、装枪头和 EP 管的盒子不需要用 DEPC 浸泡，将枪头或者 EP 管内的 DEPC水大致去除干后，装起，包好5、121 摄氏度， 30min6、180 摄氏度，干燥数个钟头（至少 3 小时以上）。

注意： a、处理 DEPC 时需要戴乳胶手套、口罩！b 、或者不用 DEPC 消毒， 13 0℃， 90min 高压灭菌（许多实验室高温灭菌两次）二、 RNA提取注意事项1、组织 RNA 抽提失败的两大现象是： RNA 降解和组织内杂质的残留。

关于降解问题，首先看一下为什么从培养细胞中抽提RNA 不容易降解。

现有的RNA 抽提试剂，都含有快速抑制Rnase 的成分。

在培养细胞中加入裂解液，简单的混匀，即可使所有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻底裂解。

细胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的Rnase，所以 RNA 得以保持完整。

也就是说，培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触，所以其 RNA 不容易被降解；反过来讲，组织中的 RNA 之所以容易被降解，是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致。

因此，假定有一种办法，在抑制 RNA 活性的同时能使组织变成单个细胞，降解问题也就可以彻底解决了。

液氮碾磨就是最有效的这样一种办法。

但是，液氮碾磨方法非常麻烦，如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。

这样就产生了退而求其次的方法：匀浆器。

RNA提取及注意事项快速的操作，低温环境，少量取上清主要是抽提之后吸取上清时要特别小心，只要不把蛋白层吸出来就不会有RNase污染。

分子克隆第二版343页,上关于提取R NA所用的玻璃容器的处理方法,是用前180度干烤8小时或更长时间;另一种方法是0.1%的depc 水浸泡(37度2小时),然后灭菌水淋洗数次,100度干烤15分钟,然后高压灭菌除去depc.我们实验室一直是用170度考4小时,且不准离人,不准过夜,可能是怕烤箱长时间高温,线路老化会发生危险吧提取RNA所用的枪头，EP管。

直接高压烘干即可。

如果用0.1％DEPC处理，要在DEPC配置后振摇1小时后再浸泡枪头，EP管方有效。

我做的都是将枪头泡在配制好的depc中，摇振过夜，然后倒掉depc注意要到干净，再高压，为了防止仍残留液体可120度干烤一会A.对于提取RNA来说,我认为关键的一点在于实验器材的准备.包括从最初的标本的制备,保存,以及之后的试剂的准备,匀浆器,镊子,tip头的去除RNase处理,尤其是去除RNase的DEPC处理步骤B.您在处死大鼠前,先准备好干净的冻存管(用1.5ml的Ep管也可以,就是后面您在从液氮中取出的时候容易爆,您的注意安全),然后将去除的骨骼肌立即用干净的剪刀分成半颗到一颗黄豆大小,装入冻存管后立即投入液氮保存.个人认为在这里使用装标本的管子没必要用DEPC 处理C.在提取RNA之前,将试剂(TRIzol)和器械(tip头,镊子,匀浆器)都准备好D.从液氮取出标本后,立即转移进入事先加入TRIzol的匀浆器内(最好置冰上操作),立即匀浆,一直到标本完全碾磨碎,这个时候TRIzol液体成浑浊状,而且匀浆器的壁上没有太多的黏附组织,然后将TRIzol转出,继续后续的步骤.1 Rnase是一种蛋白酶，能够降解RNA。

2我们的手上皮肤上有很多，应该是对我们的身体起保护作用。

保护不被RNA病毒感染？或者什么的。

RNA提取一般步骤总结RNA提取原理：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。

但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。

RNA提取的一般步骤所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。

但其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。

RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。

第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。

实验步骤：破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。

1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。

2、分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。

3、沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。

4、洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。

5、融解RNA一般使用TE。

6、保存RNA应该尽量低温。

为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。

从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。

另外，长度大于4kb 的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。

RNA提取一般步骤总结RNA提取原理：通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，再经过沉淀，洗涤，晾干，最后溶解。

但是由于RNA酶无处不在，随时可能将RNA降解，所以实验中有很多地方需要注意，稍有疏忽就会前功尽弃。

RNA提取的一般步骤所有RNA的提取过程中都有五个关键点，即：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。

但其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。

RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸，再用氯化锂将RNA沉淀出来；直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相。

第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失，目前该方法的使用频率已很低。

实验步骤：破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA。

1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行，可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎组织，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。

2、分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂，加入少量异戊醇，经过此步，离心，RNA一般分布于上层，与蛋白层分开。

3、沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或异丙醇。

4、洗涤RNA使用70％乙醇洗涤，有时，为避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能过于干燥，否则不易溶解。

5、融解RNA一般使用TE。

6、保存RNA应该尽量低温。

为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。

从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。

另外，长度大于4kb 的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。

RNA提取准备工作与注意事项一、枪头和EP管等的消毒灭菌1、用去离子水配制0.1%（千分之一）的DEPC（剧毒物），须在通风橱中小心使用，避光，密闭4℃保存;DEPC水是用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压消毒的MiliQ纯水。

经检测不含RNase、DNase和proteinase。

2、将枪头和EP管放入0.1%的DEPC内，保证枪头和EP管内都充满0.1%的DEP,3、避光、静置、过夜（12-24 h）4、装枪头和EP管的盒子不需要用DEPC浸泡，将枪头或者EP管内的DEPC 水大致去除干后，装起，包好5、121摄氏度，30min6、180摄氏度，干燥数个钟头（至少3小时以上）。

注意：a、处理DEPC时需要戴乳胶手套、口罩！b、或者不用DEPC消毒，130℃，90min高压灭菌（许多实验室高温灭菌两次）二、RNA提取注意事项1、组织RNA 抽提失败的两大现象是：RNA 降解和组织内杂质的残留。

关于降解问题，首先看一下为什么从培养细胞中抽提RNA 不容易降解。

现有的RNA 抽提试剂，都含有快速抑制Rnase 的成分。

在培养细胞中加入裂解液，简单的混匀，即可使所有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻底裂解。

细胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的Rnase，所以RNA 得以保持完整。

也就是说，培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触，所以其RNA 不容易被降解；反过来讲，组织中的RNA 之所以容易被降解，是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致。

因此，假定有一种办法，在抑制RNA 活性的同时能使组织变成单个细胞，降解问题也就可以彻底解决了。

液氮碾磨就是最有效的这样一种办法。

但是，液氮碾磨方法非常麻烦，如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。

这样就产生了退而求其次的方法：匀浆器。

匀浆器方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制Rnase 活性这个问题，而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的Rnase 降解RNA 的速度快。

RNA提取准备工作及注意事项一、准备工作：1.设计实验方案：根据研究对象的不同，设计合适的实验方案，例如提取样品的数量、提取方法的选择等。

2.购买试剂和设备：准备好所需的试剂和设备，如RNA提取试剂盒、离心机、冷冻离心管等。

3.设置实验环境：确保提取RNA的工作环境干净、无菌，避免外部污染对实验结果的影响。

4.消毒操作台、仪器和试剂：使用漂白水或酒精将操作台、仪器和试剂进行消毒，以保证实验的无菌性。

5. 准备辅助试剂：根据实验方案的需要，准备好辅助试剂，如裂解缓冲液、RNase抑制剂、维生素C等。

二、注意事项：1. 避免RNA的降解：RNA容易受到核酸酶的降解，因此在处理样品时需注意使用RNase抑制剂，并避免RNA接触空气、水等容易污染的环境。

2.样品的采集和储存：样品的采集和储存条件对RNA的质量有很大影响，应注意快速采集样品并冷冻保存，避免样品的长时间存放和频繁冻融。

3. 避免污染：在整个提取过程中，应注意避免污染，使用专门的无菌、无DNase的耗材，并严格遵守实验室操作规范。

4.快速操作：RNA提取过程中，所有步骤都要迅速进行，尽量减少RNA长时间暴露在空气中，避免RNA的降解和污染。

5.质控检测：在提取过程中，可通过紫外吸收检测RNA的浓度和完整性，也可用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的降解情况。

三、RNA提取的流程：1.样品裂解：将样品经过细胞裂解液处理，使DNA和RNA被释放出来。

2.分离RNA：经过离心将细胞碎片、核糖体、DNA等物质和RNA分离开来。

3.去除DNA：通过DNA酶的作用将DNA分解掉，使提取的物质中只含有RNA。

4. RNA稳定化：加入RNase抑制剂，防止RNA被降解。

5.沉淀RNA：将RNA进行萃取，并用酒精沉淀将RNA从提取溶液中分离出来。

6. 清洗和溶解：通过洗涤剂和酒精去除杂质，并用RNase-free水将RNA溶解。

7.浓缩RNA：将溶解的RNA进行浓缩，以便后续实验使用。

一、枪头和EP管等的消毒灭菌1、用去离子水配制0.1%（千分之一）的DEPC（剧毒物），须在通风橱中小心使用，避光，密闭4℃保存;DEPC水是用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压消毒的MiliQ 纯水。

经检测不含RNase、DNase和proteinase。

2、将枪头和EP管放入0.1%的DEPC内，保证枪头和EP管内都充满0.1%的DEP,3、避光、静置、过夜（12-24 h）4、装枪头和EP管的盒子不需要用DEPC浸泡，将枪头或者EP管内的DEPC 水大致去除干后，装起，包好5、121摄氏度，30min6、180摄氏度，干燥数个钟头（至少3小时以上）。

注意：a、处理DEPC时需要戴乳胶手套、口罩！b、或者不用DEPC消毒，130℃，90min高压灭菌（许多实验室高温灭菌两次）二、RNA提取注意事项1、组织RNA 抽提失败的两大现象是：RNA 降解和组织内杂质的残留。

关于降解问题，首先看一下为什么从培养细胞中抽提RNA 不容易降解。

现有的RNA 抽提试剂，都含有快速抑制Rnase 的成分。

在培养细胞中加入裂解液，简单的混匀，即可使所有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻底裂解。

细胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的Rnase，所以RNA 得以保持完整。

也就是说，培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触，所以其RNA 不容易被降解；反过来讲，组织中的RNA 之所以容易被降解，是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致。

因此，假定有一种办法，在抑制RNA 活性的同时能使组织变成单个细胞，降解问题也就可以彻底解决了。

液氮碾磨就是最有效的这样一种办法。

但是，液氮碾磨方法非常麻烦，如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。

这样就产生了退而求其次的方法：匀浆器。

匀浆器方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制Rnase 活性这个问题，而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的Rnase 降解RNA 的速度快。

大鼠肝脏组织总RNA提取实验前准备:1.试剂RNAprep pure Tissue Kit (TIANGEN)，无水乙醇，巯基乙醇，DEPC2．试验用具的处理去RNase处理：1〉配制0.1% DEPC 水（1000ml 水加1ml DEPC，用转子于通风橱内搅拌至完全溶解）。

2〉将需要用的枪头，枪头盒和EP管等浸泡入DEPC水中，过夜。

将枪头装入枪头盒中，120C灭菌30min。

60C烘干过夜。

3〉D EPC水于120C灭菌30min。

配制DNase I 工作液：取9ul DNase I 存储液放入新的RNase-Free的离心管中，加入71ul RDD溶液，轻柔混匀。

试验步骤1.准备碎冰以及液氮，将肝脏组织从-80C转移到液氮中。

2.称取10-20mg肝脏组织（注意称取组织的部位尽量相同、不含其它结缔组织成分）与RNase-Free的2ml EP管中。

3.加入300ul 裂解液，匀浆器匀浆（中号探头，最高速度），其间间歇性地将EP管置于冰上以防止组织裂解液过热。

4.匀浆后，将探头插入水中洗涤30s（开动状态下），转移到新的水中再次洗涤30s，然后与DEPC水中洗涤30s。

进行下一个样品的匀浆。

5.加入590ul RNase-Free ddH2O和10ul 蛋白酶K，混匀后56C处理15min。

6.13000rpm 离心3min，取800ul上清加入400ul无水乙醇（0.5倍体积），混匀。

将混匀液转入吸附柱中（吸附柱放在收集管中），13000rpm 离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

7.向吸附柱中央加入350ul去蛋白液，13000rpm 离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

8.向吸附柱中央加入80ul的DNase I 工作液，室温放置15min。

9.向吸附柱中央加入350ul去蛋白液，13000rpm 离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

10.向吸附柱中央加入500ul漂洗液，室温放置2min。

第一部分RNA 提取策略1、RNA降解的原因内源性RNAase是造成RNA降解的最重要原因，因为人体细胞自身就是几十分钟（20min？）mRNA被降解一轮，所以不管是组织还是细胞还是液体状样本在离开其中细胞的最佳生活状态后都应该尽快的被妥善的方法保存起来。

外源性RNA酶也是一个需要注意的因素，最常见的就是毛发尤其头发，灰尘，唾液，塑料手套这四个兄弟。

针对它们我们应该戴帽子，口罩，橡胶无菌手套，在清洁灰尘少的地方提取RNA。

我上面说了内源性RNAase污染才是关键，所以有些同志没有注意这些对外源性RNAase的防护RNA也提取的很出色。

但是如果你运气不太好的话外源性RNAase污染影响很大的。

2、样品的取材我们抽提RNA往往都是需要其mRNA，而mRNA的表达量和细胞或者组织的生长状态息息相关，我们取组织块应该避免取到坏死组织，而细胞我们应该在其处于生长旺盛的时期收集（贴壁细胞消化要迅速，离心要稍为快些，甚至可以不消化下来直接进入裂解步骤；此外还可以采取先震荡敲击培养瓶的方法使细胞和培养瓶的结合下降，然后用吸管吹打培养基地方法把细胞吹打下来，这样细胞的代谢不会明显的受到抑制。

注意在平时传代的时候就要注意观察细胞除了用胰酶消化下来以外是否还有其他比较简单的方法）（此外还可以把培养液倒掉后迅速的加入裂解试剂开始抽提ＲＮＡ）。

3、待提取样品保存方法这些保存方法温度从4度到零下196度不等，选择哪一种保存方法关键是要对这些保存方法的优缺点有清醒的认识。

根据你需要的RNA种类可以做简单的分类。

包括RNA病毒RNA ，mRNA（各种），rRNA 等其中最容易降解或者破坏的就是mRNA，最不容易损失的就是RNA病毒RNA （因为有蛋白壳保护）。

超低温保存：特指液氮保存不管组织还是细胞如果需要其中的mRNA必须在液氮中保存，-70度等方法都是错误的方法，在很短的时间内或许可以，但是长期是不可能的。

-20~~~-70摄氏度保存：RNA病毒的RNA 可以在这个温度段安全的保存。