1-1 免疫血清制备及效价测定-1

抗原与免疫血清的制备××××××××××抗体是机体接受抗原刺激后产生的一种具有免疫特异性的球蛋白。

在免疫学实践中，为制备抗体常以抗原性物质（细菌、病毒、类毒素、血清及其他蛋白质）给动物注射。

经过一定时间后，动物血清中可以产生大量的特异性抗体。

这种含有特异性抗体的血清称为免疫血清或者抗血清。

免疫血清的制备是一项常用的免疫学技术，高效价，高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂（如用于制备免疫标记抗体等），也可供特异性免疫治疗用[1]。

免疫血清的效价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。

如以免疫原性强的抗原刺激高应答性的机体，常可获得高效价的免疫血清。

而使用免疫原性弱的抗原免疫时，则需同时加用佐剂以增强抗原的免疫原性。

免疫血清的特异性主要取决于免疫用抗原的纯度。

因此，如欲获得高特异性的免疫血清，必须予先纯化抗原。

此外，抗原的剂量、免疫途径及注射抗原的时间间隔等，也是影响免疫血清效价的重要因素应予重视。

在本实验中采用ELISA法和凝集反应的原理来测定免疫血清的效价：ELISA测定的原理是利用标记技术将酶标记到抗体（抗原）上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗体（抗原）发生特异性反应。

在遇到相应的酶底物时，酶能高效、专一催化、分解底物，生成有颜色的产物。

根据颜色的深、浅、可以判断待检物中有无特异的抗原（抗体）以及量的大小。

该方法可对待检样品进行定性和定量分析；同时具有微量、特异、高效、经济、简便等优点，因此是一种广泛应用于生物和医学领域的微量测定技术。

凝集反应是一种经典的抗原抗体反应，也是高等医学院校学生免疫学实验的重要内容之一，它是指可溶性抗原及其相应抗体在一定条件下出现肉眼可见的沉淀物的现象[2]。

凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类。

前者可利用已知抗血清鉴定未知细菌，优点是极端快速，为诊断肠道传染病时鉴定病人标本中肠道细菌的重要手段；后者是一种定量法，现已发展成微量滴定凝集法，它可利用已知抗原测定人体内抗体的水平(效价)，也是诊断肠道传染病的重要方法。

抗体制备技术的发展及其医学应用抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白。

它是能与相应抗原特异的结合、产生各种免疫效应（生理效应）的球蛋白。

国际卫生组织将具有抗体活性及化学结构与抗体相似的一类蛋白统一命名为免疫球蛋白，它与抗体都是指同一类蛋白质。

抗体的2条重链和2条轻链根据氨基酸序列变化程度分为V区和C区，其抗原结合特异性主要由V区中高度变异的超变区决定，3 个超变区共同形成1个抗原决定簇互补的表面，故又称为互补决定区( comp lementarity determining region，CDR)。

常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。

一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。

即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。

因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody，PcAb），简称多抗。

多克隆抗体是由多克隆B细胞群产生的、针对多种抗原决定簇的混合抗体。

因为天然抗原是由多种抗原分子组成的，每种抗原分子又含有许多抗原决定簇，每一种抗原决定簇可激活相应的B细胞克隆，进而分化、成熟并合成相应的抗体。

由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。

因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。

随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。

1 抗体的发展抗体的研究过程经历了免疫血清学研究、单克隆抗体研究和基因工程抗体研究3个不同阶段。

1.1 免疫血清学研究阶段免疫动物产生的抗体是多种抗体的混合物，所以早期制备的抗体是多克隆抗体. 多克隆抗体是人类有目的地利用抗体的第1步，其在生物医学等方面的应用已有上百年的发展历史. 但多克隆抗体具有不均一性，特异性差且动物抗体注入人体会产生严重的过敏反应等特性，限制了其在疾病诊断和治疗中的应用。

实验报告
10.选择波长630nm，将酶标板置于载板台上，开始扫描，测定OD值。

结果如下所示：
思考题：
1.查阅资料，了解共有哪些类型的ELISA实验，以及本实验中所用ELISA属于哪一类？答：本实验中所用ELISA属于间接法ELISA。

①直接ELISA
原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原及杂质。

加酶标抗体进行孵育。

固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。

彻底洗涤未结合的酶标抗体。

此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。

加底物反应。

直接法主要用于测定抗原。

②间接法ELISA
原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。

洗涤除去未结合的抗原及杂质。

加入特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。

经洗涤后，加酶标二抗。

固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。

洗涤后，加底物显色。

③双抗夹心法ELISA
原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗原。

将特异。

免疫血清的制备及效价测定制备免疫血清的传统方法是将抗原注入动物体内，由动物体内 B 细胞增殖分化成浆细胞产生抗体。

由于抗原分子（完全抗原）具有多种抗原决定簇，每一种抗原决定簇可以激活具有相应抗原受体的 B 细胞系产生该决定簇的抗体，因此用抗原免疫机体获得的免疫血清一般均为多克隆抗体。

制备的免疫血清的质量（特异性、亲和力及效价高低）受多种因素的影响，主要包括抗原的性质、免疫动物的种类及状态、免疫剂量、免疫途径及免疫方案（加强免疫次数，间隔时间，佐剂的使用等）等。

因此要获得高质量的免疫血清需先通过预实验摸索确定最佳免疫方法。

测定免疫血清中抗体效价的方法很多，如凝集实验，沉淀实验、溶血实验， ELISA 等均可用于对抗体效价的测定。

第一部分、免疫血清的制备我们要制备的是多克隆抗体----抗IgG抗体的制备。

Ig是免疫球蛋白，对异种动物而言，是良好的抗原物质。

可以刺激异种动物产生抗Ig血清，经适当提取后，产生抗Ig抗体，又叫第二抗体或抗抗体。

在多数的间接标记反应中，均需制备抗Ig抗体。

【实验材料】1．动物IgG（兔源的，购买）2．弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂3．青霉素和链霉素4．实验动物： BALB/c小鼠5．无菌 1ml 注射器6. 生理盐水，酒精棉等【实验步骤】1. 免疫程序：40 ug+弗氏佐剂+青霉素1 000U/ml、链霉素1 000μg/ml+生理盐水混悬液背部皮下多点注射，隔10天加强免疫2次，腹腔注射20ug+不完全弗氏佐剂，一周后收血清。

一般在末次免疫结束后的第7 天,自鼠尾取少量血,分离血清,采用间接法ELISA 分析血清中抗体的效价，达到效价即可收取。

2. 获得免疫血清：小鼠摘眼球取血,收入小试管中,3000转/分离心5分钟,上清即为免疫血清。

第二部分、免疫血清质量评价一、 效价测定抗体效价测定方法很多，本实验采用琼脂扩散法，ELISA法—）、琼脂扩散法1.操作步骤（具体见附注）⑴ 做琼脂板，打梅花孔。

免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类免疫荧光技术的几种实验方法及其分类1、免疫标记法及其分类1）荧光免疫法：原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。

底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min内得出结果。

结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。

该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。

以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。

除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。

洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。

最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。

传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。

2）放射免疫法放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。

然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。

RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng／ml水平。

但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。

近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。

3）酶联免疫法(ELISA)ELISA法有竞争法和夹心法两种。

竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L 板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg／L，线性范围达1 000ug／L。

夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r＝0.92)。

ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。

实验报告实验名称多克隆抗体的制备一（抗血清制备）实验日期院系专业班级姓名学号一、实验目的了解免疫的原理，掌握免疫方法和抗血清的制备技术。

二、实验器材试剂：酒精棉球、NDV灭活油乳剂疫苗、麻醉剂器材：兔笼、注射器、剃毛剪、手术刀、止血钳、手术剪（组织剪、眼科剪）、动脉夹、眼科剪、动脉导管、纱布、棉线、细线、培养箱、冰箱、结扎细线、离心机、温箱三、实验原理1.机体的特异性免疫反应是指机体受抗原物质刺激后产体液免疫和细胞免疫的过程。

一种抗原能否引发抗体反应，一方面取决于抗原分子表面有无特异性的化学结构——抗原决定簇，另一方面取决于机体有无相应的免疫活性细胞。

2.将具有免疫原性的物质注入健康动物体内后，抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。

抗原进入机体经过一定的潜伏期，抗体效价逐步上升，达到高峰后，能维持一短暂的时期，以后又逐渐下降，但当第二次接触相同的抗原时，抗体的上升较前次为快，高峰时的效价也比前次为高。

抗体持续的时间也较长，此也称为再次反应。

待动物血清中存在大量抗体时，采集动物血液，分离析出血清，便得到所需的抗血清（免疫血清或抗体）。

3.由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体。

4.多克隆抗体的制备是一个复杂的过程，为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。

对于免疫原性较弱的可溶性抗原（如蛋白质类抗原）要加入佐剂，以增强免疫性。

3. 放37度温箱温浴，是为了让血液内纤维蛋白原收缩，降低血清和红细胞的粘连，从而使使血清更容易与红细胞分离，不易产生溶血现象。

4. 在4℃冰箱内放置使血清析出，低温有利于稳定抗体等蛋白质的结构，防止其变性而丧失功能。

免疫学实验抗血清的制备及其效价测定班级：生物技术1401小组：11姓名：2016年11月抗血清的制备及免疫小鼠效价检测摘要：本试验以牛血清白蛋白为抗原，对小鼠和家兔进行免疫，以制备高效价抗血清。

采用多次中程免疫使产生免疫应答小鼠的血清中抗体达到实验所需的要求，然后采集小鼠血液，从中分离出血清，从而获得抗血清。

利用间接ELISA 方法测得抗血清效价。

关键词：抗血清；间接法ELISA ；抗体效价前言：用具有抗原性的物质（牛血清白蛋白BSA ）注入到健康小鼠的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。

抗体主要存在于血清中，经三次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集小鼠血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。

酶联免疫吸附实验（ELISA ）是一种新型的免疫测定技术，利用间接ELISA 法，将抗原BSA 包被在酶标板上，加入待测的抗体，再加相应的二抗，生成复合物后再加入底物显色，借助仪器测得的光吸收值计算抗体效价。

材料与方法：实验主线：实验材料：包被缓冲液（0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液）、10ug/ml 抗原（牛血清白蛋白）、0.01M PBS 溶液、5%（w/v ）脱脂奶粉、PBST 洗涤液（含0.05%Tween 20的0.01M 的PBS ）、2M H2SO4、待测抗体、HRP 标记的羊抗小鼠IgG （二抗）、底物溶液TMB 、健康小鼠酶标板、酶标仪、保鲜膜、排枪、离心管、玻璃棒、烧杯、离心机、恒温箱动物免疫抗血清的采集与分离中程免疫3次间隔一周间接法ELISA 测定抗血清的效多克隆抗体实验内容与方法：一．动物的免疫：1.1实验动物的选择选择实验动物应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体等因素。

选择与抗原亲缘关系远的动物，尤其在制备抗免疫球蛋白（Ig）抗体时；根据抗体的需要量选择动物，制备一抗常用动物为小鼠和家兔，制备二抗常用动物为羊和马；常用青壮年期的雄性动物。

免疫球蛋白IgG的提取-1一、目的及要求了解和掌握免疫球蛋白的提取方法。

二、概念抗体是在抗原物质刺激下，人或脊椎动物免疫系统的浆细胞产生的，能与抗原发生特异性反应的免疫球蛋白，主要存在于人和动物的血清及其体液中。

三、免疫血清的制备（一）动物的选择实验室常用的动物是家兔和羊，有时也用豚鼠或鸡，大量制备商品性抗血清时，可采用马、牛等大动物。

对动物的基本要求是：1、与抗原物质的种属关系越远越好；2、发育成熟、健壮、体重合乎规定，如家兔要求体重在2～3Kg以上；3、最好为成年雄性动物，如用雌性动物，则不得用怀孕者。

（二）抗原的种类、质量要求及用量1、抗原的种类抗原是决定所制备免疫血清特异性的关键，在免疫前必须进行鉴定。

制备免疫血清的抗原可以分为以下三类：1）微生物抗原：如细菌、病毒、立克次氏体、螺旋体、真菌等；2）组织抗原：主要是各种蛋白质或蛋白质复合物，如各种酶类、激素、结缔组织成分、血浆蛋白、肿瘤组织等；3）免疫球蛋白抗原：这种抗原在免疫荧光和免疫酶技术中应用最广；2、抗原的纯度抗原纯度要高，应用病原微生物时，应选择抗原性强、稳定和标准的菌株或毒株。

细菌性抗原应避免有培养基成分，培养病毒的组织尽量采用与被免疫动物同种的组织，培养用的生长液也应避免含有抗原性强的物质，用Hank ′s氏液等为好。

3、抗原的用量抗原量过小，不能有效地刺激机体产生抗体；抗原量过大，也影响抗体的产生，所以抗原量要适当。

抗原用量视抗原种类、剂型和注射途径而异。

采用弗氏佐剂，剂量较小，一次注射剂量以1mg/kg体重为宜，不加佐剂的剂量要大10倍以上。

静脉注射剂量要小些，以免引起动物死亡。

（三）免疫的途径与方法免疫途径应是多种多样的，如静脉、腹腔、肌肉、皮内、皮下和淋巴结等，但肌肉和皮内两种途径较少应用。

目前一般倾向于小剂量、多点、多途径的方法，但具体应视抗原的生物学特性和理化特性来决定。

酶、毒素等生物活性抗原，一般不宜采用静脉注射。

项目一免疫血清的制备与提纯一、免疫血清的制备(Preparation of antiserum)【实验原理】将适当的免疫原物质注入动物体内，经一段时间动物血清中可出现大量特异性抗体，这种含抗体的血清称为抗血清(或免疫血清)。

它在血清学检测中有广泛应用。

理想的抗血清的产生主要取决于抗原的纯度和免疫原性，以及动物的应签性。

同时免疫接种时的免疫途径、抗原剂量、有无佐剂、注射次数及间隔时间等因素均可影响抗血清的质量。

制备的抗血清可直接用于某些实验，也可从中提取特异性抗体或某一组分。

下面介绍几种常用的免疫血清制备方法，免疫动物均选用家兔，这是因为：(1)其产生的血清量足够实验应用并容易驯养；(2)为采血、注射用耳血管很容易找到；(3)用兔子作免疫接种的资料较多，可方便利用；(4)能产生高效价抗体，并且可用常用的沉淀反应、凝集反应或溶血、溶菌反应等试验方法进行鉴定。

【试剂和器材】1．免疫动物2～3kg健康雄性家兔。

2．免疫原绵羊红细胞(SRBC)、OX19变形杆菌、人IgG(SPA菌体吸附)、正常人混合血清、牛血清白蛋白(BSA)、聚丙烯酰胺凝胶分离的蛋白质抗原。

3．佐剂完全和不完全福氏(Freund)佐剂。

4．其它试剂生理盐水、70%酒精等。

5．器材注射器及针头、棉球、三角烧瓶、玻璃珠、试管、吸管、柯氏瓶(扁瓶)、Luer-lock(双联)注射器、止血钳、手术剪、手术刀等，以上器材均应高压灭菌或消毒后使用；离心机、液体旋转混合器、温箱、水浴箱、冰箱等。

【步骤和方法】(一)溶血素的制备1．制备抗原取脱纤维羊血或用阿氏(Alsever)液保存的绵羊红细胞(采血方法见附录常用实验动物采血方法)，用生理盐水洗３次，每次加2～3倍生理盐水，离心2000r/min 10min，弃上清。

最后一次按压积用生理盐水配成10%SRBC悬液，放４℃保存备用。

2．免疫动物家兔耳缘静脉注射10%SRBC悬液1ml，间隔3天，连续7次，末次免疫后2周，由耳静脉取血1ml(取血方法见附录常用实验动物采血方法)，分离血清，测定溶血素效价(见补体结合试验)，当效价≥1:2000则可放血收集血清，此法效价可达1:6000~1:10000。

免疫血清的制备【实验原理】将适量目的抗原经合适途径注射动物，刺激动物发生免疫应答，产生特异性抗体。

抗体存在于血清中，含有目的抗体的血清称为免疫血清。

高效价、高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂（如用于制备免疫标记抗体等），也可供特异性免疫治疗用。

免疫血清的制备是一项常用的免疫学实验技术。

制备方法因抗原的性质不同而异，下面以制备家兔抗人IgG免疫血清为例作具体说明。

【材料与仪器】1.健康成年家兔，雄性，体重2～3kg。

2.灭菌生理盐水、纯化人IgG（10mg／ml）、消毒酒精及碘酒、羊毛脂、石蜡油、活卡介苗（BCG）（75mg／ml）。

3.剪刀及镊子、注射器（2ml、50ml）、称量瓶（10ml）、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶（200ml）、手术器械一套、血管夹、黑丝线及塑料放血管、研钵。

【实验方法】（一）抗原及佐剂的制备1.弗氏不完全佐剂（FIA）的制备：称羊毛脂10g，逐滴加入优质石蜡油40ml，边滴边研磨，分装于疫苗瓶中（每瓶10ml），高压灭菌（55.21kPa20min）后保存备用。

2.弗氏完全佐剂乳化抗原（FCA－IgG）的制备：将FIA预温（60℃30min），吸取3ml于研钵中，逐滴加入活BCG（75mg／ml）0.5ml及纯化人IgG（2.4mg／ml）2.5ml，边滴入边研磨，直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上，以不散开为合格。

（二）免疫动物1.用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分兔毛，用酒精及碘酒消毒皮肤。

2.第一次免疫：用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂（FCA）乳化的抗原（人IgG）（简称FCA－IgG）液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。

3.第二次免疫：间隔10～14天后，于两侧腘窝及足蹊部肿大的淋巴结内注入FCA－IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。

如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧腘窝及足蹊部皮下。

4.间隔7～10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价（即试血）。

NDV抗血清制备及抗体效价测定摘要：抗血清（免疫血清），是指含有免疫蛋白的血清。

抗体效价指抗体的物理状态及其在体内的滞留时间，以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果。

关键词抗血清抗体效价免疫0、引言凡是能刺激机体产生抗体，并能与抗体发生特异性结合的物质被称为抗原。

当机体受抗原刺激后，会在体液中出现的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白，这个球蛋白则被称为免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）。

而含有Ig的血清称免疫血清，也叫抗体。

抗体效价则是指抗体的物理状态及其在体内的滞留时间。

将具有免疫原性的物质注入健康动物体内后，抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。

待动物血清中存在大量抗体时，采集动物血液，分离析出血清，便得到所需的抗血清。

由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇，可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌各种抗原决定簇的抗体，免疫血清中实际上是含有多种抗体的混合物，所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体（Polyclonal antibody，PcAb）。

1、实验仪器、材料和试剂1.1仪器2.5mL 和1mL 注射器，碘酒，75％酒精棉球，镊子、剪刀、止血钳及各种手术剪，250mL 无菌三角瓶，10mL无菌小烧杯，50mL 无菌尖底离心管，1ml、200μL和10μL移液枪和tips，家兔固定槽，家兔解剖台，棉线，温箱，离心机，96孔聚苯乙烯酶标板，酶标仪，洗板机、电泳仪，垂直电泳槽，电转膜仪，水平摇床，无菌培养皿，凝胶成像系统。

1.2材料家兔，小鼠1.3试剂鸡新城疫病毒Ulster 2C 株灭活疫苗，0.01M PBS（pH7.2），包被液——0.01M碳酸盐缓冲液，洗涤液——0.01M PBST，封闭液——含1％牛血清白蛋白（BSA）的PBST，酶标二抗，四甲基联苯胺（3,3’,5, 5’-Tetramethylbenzidine, TMB）显色液和1M H2SO4、SDS-PAGE相关试剂、Western blotting相关试剂。

抗原与免疫血清的制备××××××××××抗体是机体接受抗原刺激后产生的一种具有免疫特异性的球蛋白。

在免疫学实践中，为制备抗体常以抗原性物质（细菌、病毒、类毒素、血清及其他蛋白质）给动物注射。

经过一定时间后，动物血清中可以产生大量的特异性抗体。

这种含有特异性抗体的血清称为免疫血清或者抗血清。

免疫血清的制备是一项常用的免疫学技术，高效价，高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂（如用于制备免疫标记抗体等），也可供特异性免疫治疗用[1]。

免疫血清的效价高低取决于实验动物的免疫反应性及抗原的免疫原性。

如以免疫原性强的抗原刺激高应答性的机体，常可获得高效价的免疫血清。

而使用免疫原性弱的抗原免疫时，则需同时加用佐剂以增强抗原的免疫原性。

免疫血清的特异性主要取决于免疫用抗原的纯度。

因此，如欲获得高特异性的免疫血清，必须予先纯化抗原。

此外，抗原的剂量、免疫途径及注射抗原的时间间隔等，也是影响免疫血清效价的重要因素应予重视。

在本实验中采用ELISA法和凝集反应的原理来测定免疫血清的效价：ELISA测定的原理是利用标记技术将酶标记到抗体（抗原）上，使待检物中相应的抗原（抗体）与酶标记抗体（抗原）发生特异性反应。

在遇到相应的酶底物时，酶能高效、专一催化、分解底物，生成有颜色的产物。

根据颜色的深、浅、可以判断待检物中有无特异的抗原（抗体）以及量的大小。

该方法可对待检样品进行定性和定量分析；同时具有微量、特异、高效、经济、简便等优点，因此是一种广泛应用于生物和医学领域的微量测定技术。

凝集反应是一种经典的抗原抗体反应，也是高等医学院校学生免疫学实验的重要内容之一，它是指可溶性抗原及其相应抗体在一定条件下出现肉眼可见的沉淀物的现象[2]。

凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类。

前者可利用已知抗血清鉴定未知细菌，优点是极端快速，为诊断肠道传染病时鉴定病人标本中肠道细菌的重要手段；后者是一种定量法，现已发展成微量滴定凝集法，它可利用已知抗原测定人体内抗体的水平(效价)，也是诊断肠道传染病的重要方法。

抗血清制备及抗体效价测定李嘉玲（华中农业大学生命科学技术学院生物技术1002班）【摘要】目的利用小鼠制备牛血清白蛋白抗血清并测定其效价。

方法以牛血清白蛋白作为抗原，通过腹腔注射免疫雄性小鼠，从而制备抗血清，通过ELISA测定抗血清的效价。

结果抗血清的最高效价1／16000。

结论通过酶联免疫吸附方法可以准确的测定抗体的效价。

【关键词】小鼠酶联免疫吸附抗血清效价Antiserum Preparation And Antibody Titer Analysis 【Abstract】Objective the antiserum were prepared against the BSA and use ELISA to analysis titer of antiserum. Method use BSA as antigen,immunized male mice by intraperitoneal injection to get antiserum,then use ELISA to analysis titer of antiserum.Result ELISA text gave a BSA antibody titer of 1／16000. Conclusion ELISA is a good way to ananlysis the titer of antibody.【Key words】mice ELISA antiserum titer前言BSA，牛血清白蛋白，一种白色结晶或类似白色冷冻干燥粉末，在酶切反应缓冲液中加入BSA，可以对酶起保护作用。

本实验主要利用其对小鼠的抗原性质制备抗血清。

本实验采用的抗体效价测定方法是ELISA，该方法操作渐渐，价格低廉，可进行大批量实验。

且使用方便，无放射性危害，有较高的敏感性和特异性。

1.材料与方法1.1材料与仪器适用适龄、健壮的雄性小鼠完全弗氏佐剂BSA PBST HRP标记羊抗鼠IgG 0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液洗涤液底物溶液2MH SO酶标仪酶标板保鲜膜排枪241.2方法1.2.1抗原制备完全弗氏佐剂：石蜡油（3—6份）、羊毛脂（1份）、卡介苗（3—5mg/ml）配制方法：石蜡油+羊毛脂（溶化按比例吸取）+ 卡介苗→混合→分装→保存1.2.2免疫制备抗血清1.2.2.1免疫途径小鼠腹腔注射：以左手抓取小鼠，使腹部朝上，右手将注射针头于左（或右）下腹部刺入皮下，使针头向前推0.5~1.0cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓缓注入药液。