2016年武汉大学885分子生物学考研真题（C卷）（回忆版）及详解
一、名词解释题
1．Northern blot
答：Northern blot中文名称是Northern杂交，是指一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，类似于DNA印迹法的操作程序。
通过northern blot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。
2．RNase H
答：RNase H，即Ribonuclease H，中文名称为核糖核酸酶H，是一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA。
RNase H不能水解单链或双链DNA 或RNA中的磷酸二酯键，但是可以特异性消化DNA-RNA杂合链中的RNA，常用于cDNA 第二链的合成
3．methyl trans-ferase
答：methyl trans-ferase中文名称是甲基转移酶，是指以S-腺苷蛋氨酸、甜菜碱和二甲基噻亭作为甲基的供体，把氨基、羟基、硫氢基甲基化。
结合在四氢叶酸上的活性C1单位被还原而生成甲基，通过5-甲基四氢叶酸转甲基酶与同型半胱氨酸被甲基化而生成蛋氨酸。
这种酶是以钴胺酰胺作为辅酶的。
4．frameshift mutation
答：frameshift mutation中文名称是移码突变，是指由于插入或缺失非3的倍数个的
核苷酸，从而导致蛋白质三联体密码子的阅读框发生移动，随着转译成不正常的氨基酸的突变。
这种突变通常会导致多肽链上一系列的氨基酸发生变化，严重影响后续蛋白质或酶的结构和功能。
5．Ubiquitination modification
答：Ubiquitination modification中文名称是去泛素化修饰，它是泛素化的逆过程，是指去除掉泛素（一类低分子量的蛋白质）分子，且在一系列特殊的酶作用下对靶蛋白进行的特异性修饰。
去泛素化修饰和去磷酸化，去乙酰化类似，都是去除蛋白质修饰的过程。
去泛素化功能的主要行使者是去泛素化酶。
二、简答题
1．RNA editing是什么？作用机制是什么？
答：（1）RNA editing的定义
RNA editing的中文名称为RNA的编辑，是指通过插入、删除或取代一些核苷酸残基，导致DNA所编码的遗传信息改变的一种mRNA前体加工的方式。
（2）介导RNA编辑的机制
①位点特异性脱氨基作用
载脂蛋白mRNA中的C→U，谷氨酸受体蛋白mRNA中的A→I，都属于脱氨基作用的结果。
分别由胞嘧啶和腺嘌呤脱氨酶所催化，发生在带有具催化作用的脱氨酶亚基的复合体中，有附加的RNA结合区能帮助识别所编辑的特异性靶位点。
②引导RNA指导的尿嘧啶插入或删除
指导RNA与被编辑区及其周围部分核酸序列有相当程度的互补性，并且存在一些未能
配对的腺嘌呤，形成缺口，为插入尿嘧啶提供模板，反应完成后，指导RNA从mRNA上解离下来，而mRNA则被用做翻译的模板。
2．简述大肠杆菌乳糖操纵子的作用机制。
答:（1）乳糖操纵子的基本结构
乳糖操纵子上依次排列着：
①启动子。
②操纵基因。
不编码任何蛋白质，是另一位点上调节基因I所编码的阻遏蛋白的结合部位，使操纵子受阻遏而处于关闭状态。
③结构基因。
lacZ、lacY、lacA，分别编码β-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷透性酶和β-半乳糖苷转乙酰基酶。
（2）乳糖操纵子的调控过程
①乳糖的负控诱导
a．乳糖不存在时，阻遏蛋白结合到操纵区，阻碍RNA聚合酶与lac启动子区的结合，下游结构基因无法转录。
b．乳糖存在时，乳糖与阻遏蛋白的变构位点结合，阻遏蛋白构象改变，失去活性而不与操纵区结合，下游基因能正常转录，产生相应的酶，使大肠杆菌能利用乳糖。
乳糖耗尽，诱导物异构乳糖减少，失去诱导物的阻遏蛋白会重新特异性结合lac操纵区，阻止基因转录。
②葡萄糖效应（降解物阻遏效应）
当葡萄糖与乳糖同时存在，大肠杆菌在耗尽外源葡萄糖之前不会诱发lac操纵子。
原因
是葡萄糖的降解产物能降低细胞内cAMP含量，使cAMP-CAP复合物的形成减少，影响其与启动区结合，导致下游结构基因的转录无法进行，使得乳糖无法被利用。
3．简述原核细胞转录终止机制。
答：转录的终止阶段是指当RNA链延伸到转录终止位点时，RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键，RNA-DNA杂合物分离，转录泡瓦解，DNA恢复成双链状态，RNA聚合酶和RNA链都被从模板上释放出来的过程。
原核细胞转录终止机制分为不依赖于ρ因子的终止和依赖于ρ因子的终止。
（1）不依赖于ρ因子的终止
终止子，又称内在终止子，是指不依赖ρ因子终止反应的、模板DNA上存在的终止转录的特殊信号。
作用机制：
①终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区，其转录产生的RNA容易形成发夹结构；在终止位点前面有一段由4～8个A组成的序列，转录产物的3＇端为寡U。
②在新生RNA中出现发夹结构会导致RNA聚合酶的暂停，破坏RNA-DNA杂合链5＇端的正常结构。
寡U的存在使杂合链的3＇端部分出现不稳定的rU·dA区域，两者共同作用使RNA从三元复合物中解离出来。
（2）依赖于ρ因子的终止
有些终止位点的DNA序列缺乏共性，而且不能形成强的发夹结构，因而不能诱导转录的自发终止。
大肠杆菌ρ因子能使RNA聚合酶在DNA模板上准确地终止转录。
RNA合成起始以后，ρ因子即附着在新生的RNA链5＇端，利用ATP水解产生的能量，沿着5＇→3＇方向朝转录泡靠近；当RNA聚合酶移动到终止子而暂停时，ρ因子到达RNA的3＇－OH 端，追上并取代暂停在终止位点上的RNA聚合酶，其RNA-DNA解螺旋活性使转录产物
RNA从模板DNA上释放，随后，转录复合物解体，完成转录过程。
4．简述核酸酶保护踪迹法的实验原理？
答：核酸酶保护踪迹法是近十年发展起来的一种全新的mRNA定量分析方法。
其基本原理是将标记的特异RNA探针（32P或生物素）与待测的RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针按碱基互补的原则与目的基因特异性结合，形成双链RNA；未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸，而待测目的基因与特异RNA 探针结合后形成双链RNA，免受RNA酶的消化，故该方法命名为RNA酶保护踪迹法。
（1）对于32P标记的探针，杂交双链进行变性聚丙酰胺凝胶电泳，用放射自显影或磷屏成像系统检测被保护的探针的信号。
（2）对于生物素标记的探针，杂交双链经过变性聚丙酰胺凝胶电泳后电转移至尼龙膜，采用链霉亲和素-辣根过氧化物酶和化学发光底物与膜上biotin标记的探针结合，X射线胶片或化学发光图像分析仪检测杂交信号。
5．设计实验，研究特异性mRNA在细胞中的水平情况。
答：（1）实验原理
为了研究特异性mRNA在细胞中的水平情况，先对细胞中总RNA进行提取，然后通过Northern印记分析确定mRNA水平情况。
（2）实验步骤
①细胞传代、冻存及复苏
a．传代培养：将细胞在37℃水汽饱和并含有5%CO2培养箱培养，细胞每隔3～4天传代培养一次。
b．冻存：细胞培养3～4天后，3000g离心5min，弃上清液，加入适量的新鲜培养基，用滴管反复吹打，将细胞液移至冻存管中，再加入DMSO使终浓度为10%。
置于-70℃过夜，次日放入液氮中保存。
c．复苏：从液氮中取出冻存细胞，置于37～42℃水浴中并剧烈震荡使细胞快速融化，将细胞悬液移入8～10ml培养基培养一天后换新鲜培养基，以后按常规进行细胞传代。
②细胞总RNA抽提
a．每106个细胞加0.2ml RNA Trizol变性液，用吸管反复吹吸使溶液均匀，RNA溶解。
b．每1ml样品中加0.2ml氯仿，用力振摇15s，置冰浴15min。
c．4℃、12000g离心10min，用75%乙醇洗两次，室温自然干燥，最后溶于DEPC 水中。
③制备探针
④Northern印记分析
a．每个样品取25～30μgRNA进行电泳。
b．电泳完毕，凝胶经EB染色后紫外灯下观察电泳结果。
c．将胶块倒置于水平玻板上，胶下有纸桥与20XSSC相连，胶上依次覆盖尼龙膜、Whatmann3MM滤纸、普通新华滤纸或吸水纸及500g重物。
室温下转移24～48h。
d．转移完毕，检查尼龙膜及胶上EB染料分布情况，判断转移效率，用滤纸吸去多余水分，室温晾干，80℃烘烤2h。
⑤杂交、洗膜及放射自显影
⑥统计分析
以细胞种类和辐照时间为协变量，对mRNA水平情况进行协方差分析。
