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植物细胞染色体标本的制作与观察-教案第一篇：植物细胞染色体标本的制作与观察-教案植物细胞染色体标本的制作与观察1.实验背景与原理染色体的研究在生物进化、发育、遗传和变异中都有十分重要的作用。
因此，染色体标本的制备技术是遗传学、细胞生物学、染色体工程、分类学等众多学科的基本实验技术。
物种细胞内染色体数目、形态、长度等信息的总和根据实验的观察和测量绘制成的模式图称为核型（karyotype）。
核型分析在物种亲缘鉴定，染色体变异分析，杂种分析，细胞分裂过程分析，孤雌生殖等研究中均有重要的作用。
染色体标本的常规制片方法有切片法、涂片法、压片法、滴片法（空气干燥法）等。
压片法操作简单，是常用的植物染色体标本制备的方法。
不过，该法在制备中要注意避免压片所造成的染色体的扭曲、变形和丢失的现象。
染色体制备的重要环节如下：（1）取材：应取分生旺盛的组织或细胞。
在植物中通常取根尖，在分裂高峰时取材，可得到大量分裂相细胞。
而在动物细胞中通常选取骨髓等分裂活跃的细胞，或是植物血球凝集素等刺激下的淋巴细胞，也可选取分裂旺盛的体外培养的癌细胞或转化细胞等。
（2）预处理：使用秋水仙胺等药品破坏纺锤体形成，不但可得到大量分裂相细胞，而且可使染色体缩短变粗，有利于观察。
（3）固定：渗透力强的固定液将细胞迅速杀死，蛋白质沉淀，并可尽量保持细胞原有状态。
（4）解离或低渗：植物细胞要除去细胞间的果胶层，并使细胞壁软化，从而使细胞得以膨胀，为染色体的分散提供了空间。
常用解离方法有酸解法和酶解法。
动物细胞无细胞壁，通常不需解离，而是用低渗液使细胞膨胀。
（5）染色体分散：通过压片、滴片等机械力量使染色体分散, 有利于观察。
2.实验目的（1）掌握常规压片技术制作植物染色体标本的一般方法。
（2）了解显微镜下常规显色的植物细胞染色体的形态特点,熟练掌握显微镜的使用。
（3）理解染色体与生命遗传的意义及染色体核型检查的应用。
3.实验材料与试剂（1）材料：市售大蒜、洋葱。
实验2 植物染色体压片法
一、实验原理
植物根尖的分生细胞的有丝分裂，每天都有分裂高峰时间，此时把根尖固定，经过染色和压片，再置放在显微镜下观察，可以看到大量处于有丝分裂各时期的细胞和染色体。
二、实验目的
通过实验，掌握根尖染色体压片法。
三、实验材料
小麦的种子。
四、实验步骤
（1）催芽：5-20粒种子放入培养皿（铺两层滤纸），有一薄层水。
室温下浸种24h左右。
（2）低温预处理：待种子刚萌发时（露白），放入4℃冰箱处理1-2天（一般为1天，24～36h也可）。
（3）生根：将培养皿中的水吸干。
种子腹沟朝下。
放入25℃培养箱中17～20h，不光照。
一般在头一天的早上10点左右放，第二天10点左右取根。
一天中取根较好的时间在早上10点左右，下午4点左右。
（4）取材：当根生长到0.5-2cm时，取根尖0.5cm左右，放入盛水试管中（取根时速度尽量快）。
（5）预处理：在1-4℃下，离体处理24-36小时，最好放在冰浴中，置4℃冰箱。
（6）固定：用卡诺氏Ⅰ（C arnoy’sⅠ）固定液，无水乙醇或95%乙醇：冰乙酸(体积比)=3：1，固定2—7天，4℃冰箱中存放或冰浴中。
（7）转入70%乙醇中保存（-20℃可长期保存）。
第（8）可以不要：（8）根尖处理：将根尖从保存液（70%乙醇）中取出，清水冲洗，加入1N盐酸适量，65℃水浴7-8分钟，取出清水冲洗，
放入锡夫试剂，20分钟后观察（制片观察）。
实验一植物根尖染色体压片法一、实验目的1. 学习并掌握根尖处理、染色、压片及制片观察的方法；2. 观察有丝分裂各时期染色体的形态变化，了解有丝分裂全过程。
二、实验原理高等植物有丝分裂主要发生在根尖、茎尖生长点及幼叶等器官的分生组织（分生区），其中根尖是最常用的材料：1. 根尖取材容易，操作和鉴定也比其它组织方便；2. 采用实验室内种子萌发后所长出的幼嫩根尖，不受植物生长季节的限制，并且可以大量获得；3. 对于某些珍贵而稀少的实验材料，取用自然条件下生长植株的根尖，比取用茎尖、花器等对材料的伤害要小得多；4. 采用实验室内种子发根，切取根尖后的种苗通常还可以进行正常种植，利于后续研究进行。
三、实验材料•大蒜（Aillum sativum 2n=16）四、实验器具和药品1. 用具：染色板，载玻片，盖玻片，指管，温度计，试剂瓶，滴瓶，镊子，解剖针，毛边纸。
2. 药品：无水酒精，70%酒精，冰醋酸，对二氯苯或秋水仙素，醋酸钠，碱性品红，石炭酸，甲醛，山梨醇，纤维素酶，果胶酶，中性树胶或油派胶（Euparal），二甲苯。
五、实验说明1.根尖由于取材方便，是观察植物染色体最常用的材料，有些植物种子难以发芽，或仅有植株而无种子，也可以用茎尖作为材料。
2. 植物细胞分裂周期的长短不尽相同，通常在十到几十小时之间，温度明显地影响分裂周期，对于一个不太熟悉的实验材料，最好在特定温度下长根，掌握有丝分裂高峰期，以便得到更多的有丝分裂的细胞。
3. 有丝分裂期在整个细胞周期中所占的时间相对较短，有丝分裂制片的主要目的是进行染色体鉴定，希望观察到更多分裂相，尤其是分裂中期相，通常要对材料进行不同的预处理。
（预处理的目的是降低细胞质的粘度，使染色体缩短分散，防止纺锤体形成，让更多的细胞处于分裂中期，一般在分裂高峰前，把根尖放到药剂中处理3-4小时。
常用的药剂，如秋水仙素、对二氯苯、8-羟基喹啉等。
）4.植物细胞的细胞壁对细胞形态和结构起支撑和保护作用，分生组织的细胞壁将分生细胞结合成一个整体，因此在压片之前需要采用适当方法软化或部分分解细胞壁使细胞间易于分离，称为解离。
实验一根尖分生组织的有丝分裂实验一、实验目的学习植物根尖压片方法的基本技术。
熟悉细胞有丝分裂各个时期的形态特征及染色体的变化，了解不同解离液对根尖解离的效果，并学会染色体简易压片的制片技术。
二、实验原理有丝分裂是体细胞分裂的主要方式，一般发生在植物根尖或茎尖的分生组织中。
在有丝分裂时，细胞核与细胞质有很大的变化，但以细胞核内染色体的变化最为明显，而且是有规律地进行。
各种生物染色体在数目上和形态上是相对恒定的，并随科属种的不同而具有一定的特征。
在有丝分裂过程中，每个染色体能复制一份，然后分配到两个子细胞中，所以两个子细胞与母细胞所含的染色体在数目、形态和性质上都是相同的。
在细胞遗传学研究中，人们常常需要了解某一物种的染色体数目，而最有效的方法就是观察细胞有丝分裂的中期，这样能得到较为准确的结果。
三、实验材料百合根尖四、实验器具和药品试剂显微镜、培养箱、恒温水浴锅、镊子、解剖针、刀片、载玻片、盖玻片、滴瓶、切片架、吸水纸、铅笔卡诺氏固定液、改良苯酚品红染色液（见附录：实验试剂的配制）、醋酸洋红、1N HCl、45%乙酸、1/15乙酸+95%乙醇混合液。
五、实验方法和步骤（一）材料准备选取生长旺盛的百合（种植2月左右），冲洗球根，选择嫩白色新根作为实验材料，进行预处理。
（二）预处理为了有利于对有丝分裂中染色体的观察和计数，在固定之前应用理化因素进行预处理，这样可以改变细胞质的粘度，抑制或破坏纺锤丝的形成，促使染色体缩短和分散等。
低温处理将百合根尖，浸入冰水混合物中，放置到4℃冰箱中处理48小时。
（三）解离目的是使分生组织细胞之间的果胶质层解掉，并使细胞壁软化，便于压片。
解离的时间视根尖的粗细老嫩不同而有差异。
将根尖放入解离液中（1N HCl、45%乙酸、1/15乙酸 +95%乙醇混合液），在60℃水浴锅中水浴3、5、8、10分钟，观察解离效果，看根尖是否酥软。
（四）压片待根尖酥软后，用镊子取出，将放入盛有清水的玻璃皿中漂洗3遍。
实验一植物染色体制备和观察
一、实验目的
1．学习植物染色体制片技术；
2．通过观察染色体在有丝分裂过程中，了解染色体的动态变化；
二、实验准备
（按每实验小组2人准备）
1．仪器
显微镜1台、水浴锅（大组合用一）、冰箱1、培养箱1、干燥箱1
2．器械（均放在小磁盘内）
镊子2、解剖针2、剪子2、50ml烧杯1、吸管1、玻片架1
3．药品（4人一套）
醋酸洋红、1mol HCl、二甲苯（通用）[均分装在60ml滴瓶]、蒸馏水10L（通用）4．耗材
载玻片4、盖玻片6、滤纸2、擦镜纸1本（通用）、
5．材料
洋葱或大蒜根尖（预先生根、固定、低温保存）
三、实验原理
温盐酸处理根尖的作用：
1．可破坏植物细胞间的连接物质，使细胞分散；
2．可破坏细胞壁，使根尖细胞软化，有利于压片；
3．使DNA潜在的醛基得以暴露，能被碱性染料染色，使整条染色体能均匀着色。
四、实验步骤
大蒜生根1cm→9:00固定→第二天9:00保存于75%酒精4℃→取根尖→水洗→1mol HCl 60℃处理8min→水洗→取一根尖置于干净载玻片上→取分生区→夹碎→滴染液1d染色→8min（搅拌至碎）→盖盖玻片→轻敲分散→覆盖滤纸→带液速压→吸去多余染液→观察→高倍镜下绘图
五、作业
1．温盐酸处理根尖的作用是什么？
2．绘图：间期、前期、中期、后期、末期实景图。
实验一植物染色体压片技术一、实验原理:植物染色体压片技术是利用化学或物理的方法,将具有分裂能力的细胞保持原有的分裂状态,并对其染色体进行染色,压片后观察它的染色体分裂的一种方法。
二、实验目的:植物染色体压片技术是细胞遗传学和细胞分类学等研究中应用最为普遍的基本技术,是其他新技术所不能完全取代的,是从事染色体研究的工作者首先应该掌握的一项基本的实验方法。
三、材料的制备:黑麦根尖(2n=14根尖材料的制备:1.浸泡:大、油、壳→浸泡24h(23~25℃;小、裸的不浸泡。
2. 发根:将材料放入具有团粒结构条件的土壤中培养(锯木屑、土壤、砾石、麦杆、谷草;最适温度(23~32℃;培养24h→再放入0~4℃冰处理1~7天。
目的:(1使分裂速度减慢,根尖长度整齐一致;(2调节工作时间。
再将材料从冰箱中取出又放回最适温度条件下培养1~2天;待根尖长度为1.5~2Cm即可处理。
3. 愈伤材料的制备:(适合春、夏两季用刀片将树杆割去保护组织露出伤口,用75﹪乙醇消毒包裹一天,再用50~75ppm赤霉素处理;几天后长出白色幼嫩的愈伤组织即可固定。
四、预处理:1. 方法:(化学和物理两种(1 化学方法:(适合所有生物a. 秋水仙素0.05~0.2﹪(白色粉末,易溶于水的巨毒药品;b. 0.002M 8-羟基喹啉(淡黄色晶体,用少量的乙醇溶解再稀释,对禾本科植物的随体表现很清楚;C.а-溴萘饱和液(淡黄色的乳浊液,易溶于乙醇和苯;难溶于水,100ml水中倒入1~2滴剧烈的振动5分钟;(以上abc三种药剂在15~18℃温度下处理3~5hd. 对二氯苯饱和液(淡黄色的晶体,难溶于水;具有强烈的腐蚀性,只能处理1~1.5h。
(2 物理方法:(适合禾本科作物,本次实验所采用冰水混合物在0~4℃温度下处理24h。
预处理的目的破坏或抑制纺锤体形成;增加中期图象,改变细胞质的粘度,使染色体缩短变粗,易于染色体的显带及研究。
五、固定:卡诺氏Ⅰ 3︰1 (乙醇︰醋酸;卡诺氏Ⅱ 6︰3︰1 (5︰3︰2(乙醇︰氯仿︰醋酸;固定的目的利用药剂迅速杀死正在分裂的细胞,使之保持细胞中的染色体处于被固定前的原有状态。
实验一植物染色体压片技术
一、实验原理：
植物染色体压片技术是利用化学或物理的方法，将具有分裂能力的细胞保持原有的分裂状态，并对其染色体进行染色，压片后观察它的染色体分裂的一种方法。
二、实验目的：
植物染色体压片技术是细胞遗传学和细胞分类学等研究中应用最为普遍的基本技术，是其他新技术所不能完全取代的，是从事染色体研究的工作者首先应该掌握的一项基本的实验方法。
三、材料的制备：
黑麦根尖(2n=14)
根尖材料的制备：
1.浸泡：大、油、壳→浸泡24h(23~25℃)；小、裸的不浸泡。
2. 发根：将材料放入具有团粒结构条件的土壤中培养（锯木屑、土壤、砾石、麦杆、谷草)；最适温度(23~32℃)；培养24h→再放入0~4℃冰处理1~7天。
目的:(1)使分裂速度减慢，根尖长度整齐一致；
(2)调节工作时间。
再将材料从冰箱中取出又放回最适温度条件下培养1~2天；待根尖长度为1.5~2Cm即可处理。
3. 愈伤材料的制备：(适合春、夏两季)用刀片将树杆割去保护组织露出伤口，用75﹪乙醇消毒包裹一天，再用50~75ppm赤霉素处理；几天后长出白色幼嫩的愈伤组织即可固定。
四、预处理：
1. 方法：(化学和物理两种)
(1) 化学方法：(适合所有生物)
a. 秋水仙素0.05~0.2﹪(白色粉末，易溶于水的巨毒药品)；
b. 0.002M 8-羟基喹啉(淡黄色晶体，用少量的乙醇溶解再稀释，
对禾本科植物的随体表现很清楚)；
C.а-溴萘饱和液(淡黄色的乳浊液，易溶于乙醇和苯；难溶于水，
100ml水中倒入1~2滴剧烈的振动5分钟)；
（以上abc三种药剂在15~18℃温度下处理3~5h）
d. 对二氯苯饱和液(淡黄色的晶体，难溶于水；具有强烈的腐蚀
性，只能处理1~1.5h)。
(2) 物理方法：(适合禾本科作物，本次实验所采用)
冰水混合物在0~4℃温度下处理24h。
预处理的目的破坏或抑制纺锤体形成；增加中期图象，改变细胞质的粘度，使染色体缩短变粗，易于染色体的显带及研究。
五、固定：
卡诺氏Ⅰ 3︰1 (乙醇︰醋酸);
卡诺氏Ⅱ 6︰3︰1 （5︰3︰2）(乙醇︰氯仿︰醋酸);
固定的目的利用药剂迅速杀死正在分裂的细胞，使之保持细胞中的染色体处于被固定前的原有状态。
六、保存：
冲洗置换，从95﹪~70﹪的乙醇梯度置换；每次置换需停留
20~30min,目的是将固定液中的醋酸从材料中置换掉，最后将材料保存在70﹪的乙醇中备用。
七、解离：(酸解、酶解)
1、1mol/HCl 在60℃水浴中处理5~10min；
2、0.2mol/HCl 在25℃水浴中处理1~1.5h；
3、酶解纤维素酶＋果胶酶。
解离的目的使胞间层的果胶类物质解体，利于细胞分散，有助于压片；同时解离也可适当清除部分细胞质，使细胞质背景趋于透明化，
便于观察染色体。
常用的解离方法主要有酸解法和酶解法。
八、染色：
1、0.5﹪的醋酸洋红，5~30min；
2锡夫试剂、减性品红、石炭酸品红。
染色的目的是为了更好的鉴别染色体。
本次实验用的染料是0.5﹪的醋酸洋红。
九、制片：
制得10张分裂相好的片子，保存在片盒内，以备显带实验所用。
十、揭片：
将制片在未干燥之前，在－176℃液氮中冷冻50~70秒，取出后迅速地揭片。
实验二植物染色体去壁、低渗、火焰
干燥制片技术
一、实验原理：
用此法可以显著提高染色体的分散程度和平衡性，可以减少染色体的变形、断裂等现象，也可以减轻细胞质对染色体的覆盖。
使染色体各组成部分——长臂、短臂、着丝粒、随体、染色单体等都显示得比较清楚，有利于染色体测量和显带的分析。
此法也很简单，首先用酶解法去除植物细胞壁，再利用热胀冷缩的原理，将植物细胞在冰片上用火焰烧烤，用力甩片能使细胞膜破裂，不需要特殊设备，同时也省去了繁杂的压片手续，显著提高了制片的效率。
二、实验目的：
学习植物染色体标本制备去臂、低渗法的技术，为染色体显带实验提供了优良的标本。
三、实验步骤：
１、分生组织材料的制备：需要量大，方法与第一次实验相同。
(对于不容易压片技术的材料可用该种方法。
比如小染色体或多染色体、以及机械组织含量高的和木本植物的根尖等。
而比较珍稀的材料或容易制作的材料可不用此法)。
2、常规处理：分为活体材料和离体材料两类。
本实验采用离体材
料，用物理的方法进行预处理。
（方法与上次实验相同）。
(活体处理：前低渗：加入0.075mkcl前低渗液，在25℃下处理30分钟。
作用：让kcl渗入到细胞中，细胞浓度加大，细胞内的水分渗透出来，便于后面实验步骤的药剂顺利进入细胞。
后面的实验步骤与离体材料的相同)。
3、解离：将根放在0.2MHCL中，在25℃下浸泡1h。
作用：以软化细胞壁，去除细胞壁之间的果胶质。
4、前低渗：用自来水冲洗材料，再用25℃的蒸馏水浸泡0.5h 作用：可置换出细胞内的HCL，使细胞充分吸水。
染色体在细胞内处于游离状态，在制片时便于染色体分散。
5、酶解去壁：倒掉蒸馏水，加入2％的纤维素酶与果胶酶的混合液，在35-37℃下处理1h。
作用：对细胞壁所含的纤维素、半纤维素和果胶质进行消化。
6后低渗：用镊子夹住根部抖落分生区，将其它部分丢弃，收集分生区组织，转入指形管，沉淀10min后吸出酶液，加蒸馏水浸泡0.5h。
作用：可置换出酶液。
使细胞充分吸水膨胀，染色体游离在细胞质中，制片时便于染色体分散，是关键步骤。
7、固定：吸去蒸馏水，加3︰1的甲醇固定液，静置15min。
作用：置换出细胞内的水分，便于燃烧。
(甲醇固定液作用有：①具有一定的脆性，甩片时容易使细胞膜破裂。
2能改善染色，有助于以后实验时的吉姆萨染色)。
8、制备悬浮液：吸去上清液，以1︰10的比例加入新鲜的固定液(即一份细胞，10份固定液)，用吸管不停的吸放以捣碎组织，制成均匀的细胞悬液。
9、标本片制备：将冷冻的载玻片斜放30-45°角，点上酒精灯，吸2-3滴细胞悬液在该片上，加热烧烤，此时用力甩片，制作10张标本片。
实验三植物染色体Giemsa—C带技术
一、实验原理：
染色体显带技术是借助于特殊的处理程序，使染色体显现出深浅不同的染色带。
染色带的数目、部位、宽窄与浓淡具有相对的稳定性。
从而在以往染色体形态特征（长度、着丝粒位置、臂比、随体等）以外又增添了一类新的标志。
染色体分带技术能有效地鉴别染色体，研究染色体的结构与功能。
C一带是植物吉姆萨分带的一种类型，是染色体经过C一带程序处理，使染色体着丝粒两侧出现带纹，故名C一带。
二、实验目的：
掌握植物染色体吉姆萨分带技术和方法。
三、实验步骤：
1、制片：选取前两次实验(压片法、去壁低渗法)制备的片子各
10张。
2、干燥：两种方法⑴自然干燥松树、洋葱15天，(不超过3
过月)；禾本科作物2—15天。
⑵无水乙醇干燥只需要1—12
小时即可。
(目的：①染色体具有后熟的作用；②去除染色体上
的蛋白质；③使材料凝固在片子上)。
本实验采用自然干燥方法。
3、酸处理：两种方法⑴用45%醋酸在时温下处理1—1.5 h；
⑵用0.2MHCl，在时温下处理1—1.5 h，或25℃下处理10—
12min；（处理完毕用，用30℃的蒸馏水过一次）作用：①去除制片上的杂质和染色体上的蛋白质；②破坏细胞质；③使第一次染色褪色。
④与染色体上的DNA或某些减基结合，使染色体上不同程度减基脱落，有助于程度不同的显带。
应选用⑵种方法。
(酸处理是变性的过程。
应注意控制时间，如果处理恰倒好处感觉染色体饱满，带纹丰富；如果处理不够，染色体上的色差不明显，观察不到带纹；如果处理过度，染色体很薄，带纹也不丰富)。
4、减处理：两种方法⑴强减NaOH、KOH；室温处理，不得超过20秒；(大约15秒) ⑵弱减 Ba(OH)2饱和溶液，在25℃下处理10-12min。
减处理也是使染色体变性的过程，作用是与染色体上的DNA减基结合，消化DNA。
处理完毕不能直接倒去减液，以防止Ba(OH)2与空气中CO2结合生成的碳酸钡薄膜覆盖在制片材料的表面，影响后续工作的正常进行，所以必须用流动的自来水冲洗，以去除表面的薄膜以及水中的沉淀物,冲洗完毕用30℃蒸馏水漂洗浸泡几分钟，置换出减液。
5、盐处理：用2×SSC盐溶液(0.3MNaCl+0.03MNaC6H5O72H2O)，在60℃下处理1.5h。
盐处理是使染色体复性的过程，作用(1)调节PH值；(2)修饰DNA上的减性基团和酸性基团。
1.5h后倒去盐溶液，加入30℃蒸馏水浸泡几分钟，置换出盐溶液。
6、染色：取吉姆萨母液(1％浓度)10-15ml,用磷酸缓冲液(PH6.8-7.2)稀释至1000ml（比较新鲜的母液15ml,氧化1年
以上的母液10ml）。
在25℃下染色80min。
