黄酮3-羟化酶(F3H)的生物信息学分析李萍;王若曦;王欢【摘要】通过生物信息学分析方法,对已经在GenBank上注册的青稞( Hordeum vulgare)、高粱( Sorghum bicolor)、小麦( Triticum aestivum)、玉米( Zea mays)、洋葱( Allium cepa)、花烛( Anthurium andraeanum)和美丽百合( Lilium specio-sum)等7种单子叶植物的F3H核酸以及相应氨基酸序列进行研究,并对其组成成分、理化性质、信号肽、亚细胞定位、跨膜结构、蛋白质二级、三级结构、结构域以及分子进化等方面进行分析与预测. 研究结果表明,除玉米F3 H蛋白定位于过氧化物酶体外,其他植物F3 H均定位于细胞质基质内;所有植物F3 H均为不含信号肽的非分泌型蛋白,且没有跨膜区域的亲水性蛋白;α-螺旋和无规则卷曲是F3 H的主要二级结构元件,而延伸链则散布于整个蛋白中;F3H拥有一个2OG-Fell Oxy super family和一个PLNO3176 super family保守结构域;所构建的F3H系统发育进化关系与形态学上物种发育关系基本吻合.%In this paper, F3H, sequences from Hordeum vulgare, Sorghum bicolor, Triticum aestivum, Zea mays, Allium cepa, An-thurium andraeanum and Lilium speciosum, which were registered in GenBank, were analyzed and predicted by toolsof bioinformatics in the following aspects:composition, physical and chemical properties, signal peptide,protein subcellular localization, transmembrane helices in proteins, structure of protein, conserved domain and phylogeny. The results demonstrated Zea mays F3H lies in peroxisome and F3H from other plants locate in cell matrix;F3H is a non-secretory protein without signal peptide and hydrophilic protein without transmembrane area;α-helix and random coil are primary secondarystructural components of F3H and extending chain spread in the whole protein;F3H contains a conserved 2OG-Fell Oxy super family domain and a conserved PLNO3176 super family domain; F3H phylogeny is in consistent with morphological species phylogeny in general.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2015(032)006【总页数】5页(P25-29)【关键词】黄酮3-羟化酶;青稞等;生物信息学【作者】李萍;王若曦;王欢【作者单位】西南交通大学生命科学与工程学院,成都610031;西南交通大学生命科学与工程学院,成都610031;西南交通大学生命科学与工程学院,成都610031【正文语种】中文【中图分类】Q943.2类黄酮在植物的生长、发育、繁殖和对多种压力的反应上有多样的功能[1]。
黄酮3-羟化酶(Flavanone-3-hydroxylase，F3H)是黄酮类化合物代谢途径上的关键酶之一[2]，属于依赖型2-酮戊二酸的双加氧酶(2-ODD)家族，代谢反应需要2-酮戊二酸、分子氧、铁和抗坏血酸，作用是催化柚皮素C3位羟基化，生成二氢山奈素(dhiydorkaempeforl，DHK)，而 DHK是黄酮和异黄酮合成的重要中间产物[3]。
F3H基因的cDNA最初从金鱼草(Antirrhinum majus)中克隆得到，现已在多种植物中克隆，如苹果(Malus)、紫花苜蓿(Medicago sativa)等[4]。
由于F3H的作用底物是柚皮素，因此F3H调控着黄酮与花青素苷产物的合成，是整个黄酮类化合物代谢途径的中枢位点[5]。
在不同植物或组织中，F3H具有底物特异性。
研究表明，F3H在大多数物种中仅以单拷贝形式存在[6-7]。
此外， F3H 基因在进化上也十分保守[8]。
本课题拟选择单子叶植物纲多种植物的F3H核苷酸序列以及对应的氨基酸序列作为生物信息学分析的目标序列，分析其结构、功能、进化关系和差异性，以期为深入研究F3H家族蛋白的酶学特性和黄酮化合物生物合成的分子机理提供理论依据。
1.1 基因序列从PDB数据库选取7种单子叶植物黄酮3-羟化酶(F3H)氨基酸序列作为研究对象(见表1)。
下载其氨基酸序列以及其对应的核苷酸序列，并以FASTA格式保存。
1.2 序列分析方法和所用软件通过在线软件(见表2 )对 F3H 进行理化性质、信号肽、跨膜结构域、亲/疏水性、二级结构、保守结构域、三级结构进行预测和分析，并使用MEGA 5.0软件来进行进化分析，构建进化树。
2.1 F3H理化性质分析结果2.1.1 单子叶植物F3H核苷酸序列分析从表3中不难看出，大部分单子叶植物F3H基因均包含5′/3′非编码区(untranslated region，UTR)和一个开放阅读框，仅小麦和美丽百合不存在5′/3′非编码区。
由于不同植物的基因全长不同，所以UTR长度存在差异。
单子叶植物F3H的开放阅读框在1 100 bp～1 200 bp，且ORF的终止密码子均为TGA。
2.1.2 单子叶植物F3H氨基酸序列理化性质分析结果利用Expasy软件包中ProtParam在线工具对F3H蛋白理化性质进行分析[9]，结果发现蛋白质理化性质差异不大，主要有以下几个特点：7个物种F3H氨基酸序列长度在360～400 bp，分子质量在40～45 ku；单子叶植物黄酮3-羟化酶的等电点理论值为5.5；7个物种中，Ala、Leu、Lys和Val残基比例较重，并且都不含Pyl和Sec；7个物种中，有6个F3H蛋白质不稳定性指数大于40，为不稳定蛋白，仅在花烛种中，黄酮3-羟化酶蛋白质不稳定性指数为36.47，是稳定蛋白。
2.2 信号肽、亚细胞定位和跨膜结构、亲/疏水性分析结果2.2.1 蛋白质信号肽分析使用SignalP 3.0 Server服务器预测信号肽，分别用神经网络(NN)和隐马尔科夫(HMM)模型完成预测。
7种单子叶植物F3H信号肽分析结果表明F3H均不含有信号肽，且属于非分泌蛋白。
2.2.2 蛋白质亚细胞定位运用WoLF PSORT的kNN算法对F3H进行亚细胞定位。
除玉米外另外6种单子叶植物黄酮3-羟化酶均定位于胞质溶胶中(见表4)。
2.2.3 蛋白质跨膜区预测和亲/疏水性分析TMHMM返回7个物种跨膜区预测结果，以青稞为例(图1)，其余6个物种结果相似：预测结果表明：青稞F3H位于inside的可能性为0，位于outside可能性为0.9，总的结果(粗线)显示F3H位于outside，表明青稞F3H蛋白没有跨膜区域。
其余6种单子叶植物F3H蛋白质跨膜区域预测结果相似，说明F3H蛋白没有跨膜区域。
Expasy数据库提供的ProtScale工具分别对7种单子叶植物中黄酮3-羟化酶的疏水性进行分析，采用其中的Kyte & Doolittle Scale方法构建疏水性图谱(以青稞为例，图2 )。
疏水性图谱中正值表示疏水性，负值表示亲水性。
对亲/疏水性氨基酸分布的观察可以间接反映蛋白质二级结构折叠情况[10]。
氨基端和羧基端多表现出亲水性，而中心区域则表现出高度疏水性，但总体上仍是亲水性程度更大，与理化性质分析时得到GRAVY为负值中描述的一致。
其余6个物种亲/疏水性分析结果见表5。
2.3 蛋白质结构与功能预测结果2.3.1 蛋白质二级结构预测GOR算法返回的7种单子叶植物的黄酮3-羟化酶的二级结构预测结果(见表6)。
不同单子叶植物F3H蛋白二级结构的构成比例基本一致。
在F3H二级结构中，无规则卷曲和α-螺旋约占85%，延伸链仅占15%左右。
原因可能是羧基末端富含脯氨酸，限制蛋白质形成规则α-螺旋和β-折叠结构，因此多表现为无规则卷曲结构。
从蛋白质总体结构来看，F3H蛋白无转角结构，无规则卷曲和α-螺旋是F3H主要二级结构元件，而延伸链则散布于整个蛋白质中。
2.3.2 蛋白质功能结构域预测在NCBI的CDD(Conserved Domain Database)数据库中搜索，进行蛋白质功能结构域的预测，结果如下，见表7。
用CDD分析不同单子叶植物F3H功能结构域，发现包含一个2OG-Fell_Oxy 蛋白超家族，即含有2-酮戊二酸的双加氧结构域，说明该蛋白能在含二价铁离子和氧分子的情况下催化柚皮素生成二氢堪非醇(DHK)，这与黄酮3-羟化酶功能相符。
CDD分析结果同时表明，F3H含有一个PLN03176蛋白质超家族，该蛋白超家族暂时没有正式命名，但其功能与黄酮3-羟化酶相关。
2.3.3 蛋白质三级结构预测在SWISS-MODLE服务器[11]上预测不同单子叶植物黄酮3-羟化酶三级结构。
过程大致如下：模板查寻、序列比对、目标模型的创建和结构的优化[12]。
找到模板，模板选择标准：序列同源性、氨基酸残基完整性及模板晶体的精度[13]。
通过Verify 3 D 评价至少80%氨基酸残基的评分大于0[14]，表明预测结果合理性评价良好。
预测结构图，见图3。
2.4 序列比对与进化树构建2.4.1 蛋白质序列比对对7种单子叶植物F3H蛋白质序列进行序列比对，比对结果见图4。
不同植物中F3H氨基酸序列在很多区域具有较高相似性，90～310区域是高度保守的，这与蛋白质功能结构域预测结果2OG-FeII_Oxy superfamily位置相同，可见重要结构域的氨基酸序列组成具有较高同源性。
2.4.2 进化树构建根据不同植物F3H蛋白质序列多序列比对结果，结合临近连接法，用MEGA5.0构建进化树[15](图5 )。
