基因工程2目标基因分离

基因工程绪论1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。

作动词：基因的分离和重组的过程。

2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。

供体、受体和载体是基因工程的三大要素。

3、基因工程诞生的基础三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。

以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。

三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。

2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。

5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。

6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。

7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。

8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。

9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。

10、RNAH降解与DNA杂交的RNA，用于cDNA文库建立时除去RNA以进行第二链的合成。

基因克隆的基本过程
基因克隆是运用分子遗传学技术来搜索和复制一个特定DNA片段的一种技术。

它通常
出现在生物技术领域，用来寻找一些有价值的 ORF （开放读码框）序列或特定的基因，
为生物的治疗和克隆细胞过程提供有益的信息。

克隆基因的基本过程包括以下步骤：
（1）分离目标基因：这步骤的目的是把目标基因的片段从细胞DNA中分离出来。

有
很多不同的方法可以达到这一目的，例如酶切和PCR（聚合酶链反应）。

（2）子宫2524h基因克隆。

把分离出来的DNA片段放入“质粒”当中，它是一种特
殊的DNA，可以被细菌识别。

然后把质粒放入到细菌，细菌会将这些DNA片段当作自己的
基因，并将这些基因嵌入到自己的DNA序列之中。

（3）转入和测序步骤。

把细菌克隆到多种媒介中，让它们繁殖，形成不同的克隆细
胞群。

然后把克隆细胞放入实验室，进行DNA测序，验证是否得到了想要的特定DNA序列。

（4）应用阶段：通过以上步骤得到的特定DNA序列，可以开发可以给人体带来益处
的基因工程制剂，以实现基因治疗的目的。

基因克隆的过程是相对复杂的，但它也成为了生物技术领域提供有效和有用的信息的
重要工具，帮助研究人员更好地了解和处理DNA序列，从而更好地促进生物学研究的进步。

简述基因工程的含义和基本操作步骤基因工程是通过对生物体的遗传物质进行人为改变和调控，以获得新的性状或功能的一种技术。

基因工程是现代生物技术的重要组成部分，利用DNA重组技术和基因编辑技术，可以在基因水平上改变生物体的遗传性状，进而实现种种应用。

基因工程的基本操作步骤如下：1.目标基因的克隆:首先，需要确定需要改变的目标基因，并将其从原有的生物体中克隆出来。

常用的克隆方法包括PCR技术、限制酶切和连接、质粒克隆等。

2.重组质粒构建:将目标基因插入载体中，形成重组质粒。

常用的载体包括质粒、噬菌体和人工染色体等。

3.质粒转化:将重组质粒导入宿主细胞中，使宿主细胞获得目标基因。

常用的转化方法包括化学转化、电穿孔和嗜热菌转化等。

4.选择与筛选:利用特定标记或抗性基因，对转化细胞进行筛选，筛选出带有目标基因的细胞进行进一步培养和研究。

5.培养与表达:对获得目标基因的细胞进行培养，利用适当的诱导条件（如添加特定诱导剂、调节培养温度等），使目标基因在细胞中表达出来。

6.分离与纯化:通过适当的分离和纯化技术，将目标基因表达产物纯化出来。

常用的方法包括离心、凝胶过滤、层析等。

7.特性鉴定与功能分析:对目标基因表达产物进行特性鉴定和功能分析，确认其结构和功能。

常用的方法包括Western blot、PCR、酶活性测定、功能性实验等。

8.应用与开发:在确认目标基因的结构和功能后，可以根据需要进行应用和开发。

基因工程的应用领域非常广泛，包括生物农业、医药、环境保护等。

基因工程的应用非常广泛，以下列举几个常见的应用领域：1.农业领域:利用基因工程技术改良作物，使其具有抗病虫害、耐逆境和提高产量等优点。

常见的基因工程作物包括转基因水稻、玉米和大豆等。

2.医学领域:基因工程技术可以用于生产重组蛋白药物、疫苗和基因治疗等。

同时，也有助于研究和发现与疾病相关的基因。

3.环境保护:基因工程技术可以用于修复污染物、处理有害废物，提高生物降解能力等。

第1篇一、实验目的本实验旨在通过分子生物学技术，学习并掌握目的基因的分离方法，包括基因组DNA提取、目的基因的克隆、扩增和鉴定等步骤。

通过实验，使学生熟悉实验原理、操作步骤和注意事项，提高学生的动手能力和实验技能。

二、实验原理目的基因分离是指从生物基因组中提取出特定的基因片段，并进行克隆、扩增和鉴定。

实验步骤主要包括以下几部分：1. 基因组DNA提取：利用各种方法从生物组织中提取出基因组DNA。

2. 目的基因的克隆：利用PCR技术扩增目的基因，并克隆到载体上。

3. 目的基因的鉴定：通过限制性内切酶酶切、DNA测序等方法对克隆的目的基因进行鉴定。

4. 目的基因的表达：将目的基因导入宿主细胞，进行表达和功能验证。

三、实验材料与试剂1. 实验材料：大肠杆菌、质粒载体、目的基因DNA模板等。

2. 试剂：DNA提取试剂盒、PCR试剂、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA测序试剂盒等。

四、实验步骤1. 基因组DNA提取（1）取适量生物组织，按照DNA提取试剂盒说明书进行操作。

（2）提取的基因组DNA用琼脂糖凝胶电泳检测，确保DNA提取质量。

2. 目的基因的克隆（1）设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因。

（2）按照PCR试剂盒说明书进行PCR扩增，获得目的基因。

（3）将PCR产物与载体连接，转化大肠杆菌。

（4）通过蓝白斑筛选，获得阳性克隆。

3. 目的基因的鉴定（1）对阳性克隆进行酶切鉴定，验证目的基因是否成功克隆。

（2）对阳性克隆进行DNA测序，确定目的基因序列。

4. 目的基因的表达（1）将目的基因克隆到表达载体上，构建表达系统。

（2）将表达载体导入宿主细胞，进行目的基因的表达。

（3）检测目的基因的表达产物，验证目的基因的功能。

五、实验结果与分析1. 基因组DNA提取：提取的基因组DNA在琼脂糖凝胶电泳中呈现清晰的主带，说明DNA提取成功。

2. 目的基因的克隆：通过PCR扩增，获得目的基因片段，大小与预期相符。

第十章目的基因的分离吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所第十章目的基因的分离一、引言1．基因分离技术发展简介2．基因分离技术迅猛发展的客观要求3．目的基因的分离二、分离克隆基因的若干主要方法1．应用核酸探针分离克隆的目的基因2．应用差别杂交法或扣除杂交法分离克隆的目的基因3．低丰度mRNA之cDNA末端的快速扩增RACE法4．根据蛋白质家族的保守序列鉴定新的相关基因5．通过表达载体分离特异的cDNA三、应用mRNA差别显示技术分离目的基因1．引言2．mRNA差别显示原理3．mRNA差别显示实验过程及其局限性四、DNA标签法分离目的基因1．原理2．转位子标签法3．T-DNA标签法五、酵终双杂交与单杂交体系1．酵母双杂交体系2．酵母单杂交体系3．酵母三杂交体系第十章目的基因的分离一、引言1．基因分离技术发展简介*1.在上个世纪70年代中期已经具备了分离基因的能力这主要是取决于当时重组DNA技术的发展水平，特别是发展出了安全的寄主菌株和克隆载体：第一个安全的大肠杆菌寄主菌株——X1776品系的诞生第一批安全适用的克隆载体pM19和pBR322的问世在上述这两个条件的基础上，分子生物学家成功地克隆出第一批基因。

*2.在上个世纪70年代末期克隆基因分离的能力明显提高这主要应归功于基因克隆策略的改变。

由于发展出了改良的寄主菌株和克隆载体，人们提出了先克隆cDNA再分离目的基因的新策略。

*3.在上世纪80年代克隆基因分离技术得到了进一步的提高20世纪80年代之后，由于如下技术的进步，使人们分离克隆基因的能力得到进一步提高，这些技术主要有如下几项：a.寡核苷酸合成技术的改良；b.操作RNA和DNA的酶学方法的进步；c.PCR技术的发展与应用；*4.目前科学家们已经掌握了先进的分离克隆基因的能力就目前的能力而言，可以说几乎任何期望克隆和分离的目的基因都是有可能被分离出来的。

其主要原因是：a.技术的进一步发展；b.基因组全测序工作的迅速进展与成功；c.未知产物的发育调节基因分离技术的发明，例如mRNA差别显示技术基因定位克隆技术DNA标签技术等2．基因分离技术迅猛发展的客观要求近年来基因分离技术的迅猛发展，特别是产物未知的发育调节基因分离技术的发展尤为迅速，已发展出了基因定位克隆技术、mRNA差别显示技术、DNA标签法分离目的基因的技术(包括T-DNA标签法和转座子标签法)、以及酵母双杂交和单杂交技术。

基因工程的基本操作程序的四个步骤英文回答：Gene engineering, also known as genetic engineering, is a scientific field that involves manipulating an organism's genes to achieve desired traits or characteristics. The basic operation procedures of gene engineering can be divided into four steps: identification of target gene, isolation of target gene, gene modification, and gene expression.The first step in gene engineering is theidentification of the target gene. This involvesidentifying the specific gene that is responsible for the desired trait or characteristic. Scientists use various techniques, such as DNA sequencing and gene mapping, to identify and locate the target gene within the organism's genome. For example, if researchers want to enhance the disease resistance of a crop, they would identify the gene that codes for disease resistance.Once the target gene has been identified, the next step is to isolate it from the organism's genome. This is done through a process called gene isolation. Scientists use enzymes, such as restriction enzymes, to cut the DNA at specific points and isolate the target gene. The isolated gene is then purified and prepared for further manipulation. For instance, if the target gene is responsible for producing a specific protein, scientists would isolate the gene coding for that protein.After the target gene has been isolated, the next stepis gene modification. This involves altering the targetgene to introduce desired changes or traits. Scientists can use various techniques, such as gene splicing or gene synthesis, to modify the gene. Gene splicing involvescutting the target gene and inserting new DNA sequences, while gene synthesis involves creating an entirely new gene from scratch. For example, if scientists want to create a genetically modified organism that produces a higher yieldof a particular crop, they would modify the target gene responsible for crop yield.The final step in gene engineering is gene expression. This step involves introducing the modified gene into the target organism and ensuring that it is expressed or activated. Scientists use techniques such as gene delivery systems or gene transfer to introduce the modified geneinto the organism's cells. Once inside the cells, the modified gene is integrated into the organism's genome and starts producing the desired trait or characteristic. For instance, if scientists have modified a gene to produce a specific enzyme in a bacteria, they would introduce the modified gene into the bacteria and ensure that the enzymeis expressed and produced.中文回答：基因工程，也被称为遗传工程，是一门涉及操纵生物体基因以实现所需特征或特性的科学领域。

目的基因的分离方法摘要：介绍了基因工程中分离所需目的基因的主要策略和最新进展。

总结了基因分离中的各种方法，主要有：直接酶切分离法，化学合成法，序列克隆法，功能克隆法，作图克隆法，表型差异克隆法，计算机辅助分离法等，并对其特点和适用范围进行了简单评述。

关键词：目的基因分离方法基因的分离方法都是根据基因的基本特性创建的，包括基因核苷酸顺序的特异性、基因在染色体上的位置特异性、基因编码的mRNA的特性和基因的差异表达等。

每种方法运用这些特性的一种或者多种，产生了各种各样的分离方法。

这些方法又相互之间组合，从而产生了可以在不同条件下有效分离目的基因的分离策略。

1 直接提取纯化此法只适用于分离多拷贝基因，而不适用于单拷贝基因。

并且所得到的目的基因纯度较低。

但是操作简单，对设备的依赖性很低，即使在很简陋的实验室里也能完成操作。

2 在体外用化学合成或酶促合成的方法取得目的基因通过对表达产物的分析和测序，可以预测目的基因的核苷酸序列，然后按照DNA碱基序列顺序，先合成DNA短片段，再通过DNA连接酶作用，将这些短片段依次连接成一个完整的基因。

人工合成基因的最大优点是能够根据需要合成突变基因，而且，所合成的是单基因，无其它有害基因，比较完整；缺点是只适用于较短的基因，操作比较难，费用也比较大。

目前这种方法主要用于PCR引物的合成，一些突变基因的合成等。

3 序列克隆——根据已知基因的序列克隆基因3．1 PCR扩增克隆当已知目的基因的序列时，通常采用PCR的方法来克隆基因。

基本原理和方法是：利用已知目的基因的序列，设计并合成一对寡核苷酸引物，提取所要从中分离基因的染色体DNA(RNA需要在逆转录酶的作用下合成cDNA的第1条链)，然后通过PCR反应来扩增特定的DNA片段。

扩增的片段经过纯化后，连接到合适的载体上，用酶切分析和序列分析测定所得到的重组子，并与已知基因的序列进行比较，来进行鉴定。

鉴定之后的DNA可以用于基因的表达。