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基因工程总结一．概念(1)原理：。
(2)优点：与杂交育种相比，；与诱变育种相比，。
（3）基因工程成功的原因：①成功拼接的原因：②成功表达的原因：二．基本工具1、两种酶：(1)：作用特点：。
(2)：E ·coli DNA 连接酶与T 4 DNA 连接酶的区别：2、一种运载体（1）条件：①；②；③具有特殊的标记基因（作用：）（2）种类：最常用；其他动植物病毒、三、操作程序(1)：方法：①：不知道脱氧核苷酸序列②：已知目的基因两端一小段序列，便于③利用化学方法人工合成：知道全部序列，且基因比较小。
这种方法不需要模板。
(2)——基因工程的核心基因表达载体的组成：(3)生物种类常用方法受体细胞将目的基因插入到Ti 植物动物受精卵将含有目的基因的表＋微生物原核细胞Ca 2处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA 分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA 分子质粒的T-DNA 上→农达载体提纯→取卵转化过程杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞染(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得色体的DNA 上→表达具有新性状的动物(4)①目的基因是否插入到转基因生物的染色体DNA 上：②是否转录：③是否翻译：④个体水平鉴定：抗虫、抗病接种实验易错点说明：1、切割目的基因和运载体的要求：用限制酶。
目的是：。
同种的含义是：同一种或相同两种，即单酶切或双酶切。
选择双酶切的原因是。
2、工具≠工具酶；运载体≠质粒。
3、启动子≠起始密码子，终止子≠终止密码子起始密码子和终止密码子位于mRNA上，分别控制翻译过程的启动和终止。
启动子：。
终止子：一段有特殊结构的DNA短片段，位于基因的尾端，作用是使转录过程停止。
4、基因探针的要求：①单链②有③5、农杆菌转化法中的“2”次导入：第一次：将含有目的基因的T—DNA的质粒导入农杆菌；第二次（非人工操作）：将含有目的基因的T—DNA导入受体细胞并整合到植物细胞的染色体DNA上。
6、转化：。
名词解释测序酶：是经修饰过的T7噬菌体DNA聚合酶，是采用缺失的方法，从外切核酸酶结构域中除去28个氨基酸，这样使得T7DNA聚合酶完全失去了3~-5~外切酶活性，只有5~-3~聚合酶活性，而且聚合能力很强，测序时常用此酶。
与klenow相比优点是：是双脱氧链终止法对长片段进行测序的理想用酶。
限制性核酸内切酶：是一类能识别和切割双链DNA分子中特定碱基系列的核酸水解酶。
限制-修饰系统中的限制和修饰作用：限制-修饰系统中的限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；而生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用，在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是限制-修饰系统中的修饰作用。
载体(vector): 在基因操作中携带外源基因进入受体细胞的工具。
克隆载体：主要用于扩增或保存DNA片段，是最简单的载体。
主要有：质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体、人工染色体（YAC和BAC）。
YAC（酵母人工染色体）：是利用酿酒酵母的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。
BAC（细菌人工染色体）：是基于大肠杆菌（E.coli）的F质粒构建的高通量低拷贝的质粒载体。
表达载体是可携带外源基因进入宿主细胞进行复制并进行转录、翻译的载体。
病毒表达载体：是以病毒基因组序列为基础，插入必要的表达元件所构建成的真核基因转移工具。
Ti质粒：是在根癌农杆菌中发现的可决定冠瘿病（即可诱发寄主植物产生冠瘿瘤）的质粒。
大小在200kb左右。
粘粒载体：由人工构建的、大小一般在 5~7kb左右、含有λDNA的cos序列和质粒复制子的一类特殊的质粒载体。
一元载体：含目的DNA的中间表达载体与改造后的受体（Ti质粒）通过同源重组所产生的一种复合型载体。
双元载体：是指由两个分别含有T-DNA和vir区的相容性突变Ti质粒构成的系统。
基因工程的原理与应用知识点总结基因工程是一门综合性学科，通过改变生物体的遗传信息从而实现对其性状的控制。
基因工程的原理主要涉及基因的克隆、表达、转导和编辑等方面，其应用领域广泛，涉及医学、农业、环境保护等多个领域。
本文将对基因工程的原理与应用进行知识点总结。
一、基因工程的原理1. 基因克隆基因克隆是指通过将感兴趣的DNA片段插入载体DNA中，通过细菌等宿主生长和复制，从而得到大量目标DNA的过程。
基因克隆主要包括DNA片段的选择、DNA片段的连接、载体的选择和DNA的转化等步骤。
2. 基因表达基因表达是指将目标基因导入到宿主生物体中，并使其在宿主中进行转录和翻译，最终产生目标蛋白质。
基因表达的关键是选择合适的宿主和启动子，并通过适当的调控技术提高目标基因的表达水平。
3. 基因转导基因转导是指将外源基因导入到目标细胞中，并使其被细胞所接受和表达。
基因转导有多种方法，包括病毒载体介导的转导、基因枪介导的转导和电穿孔介导的转导等。
4. 基因编辑基因编辑是指通过人为方式改变生物体的基因组成，从而改变其遗传特性。
常用的基因编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、TALEN系统和ZFN系统等。
二、基因工程的应用1. 医学应用基因工程在医学领域的应用非常广泛，包括基因诊断、基因治疗和基因药物等。
例如，利用基因工程技术可以检测某些遗传病的基因突变，从而进行早期诊断和治疗。
此外，基因工程还可以用于生产重组蛋白、疫苗和抗体等医学用品。
2. 农业应用基因工程在农业领域的应用主要包括转基因作物和转基因动物的育种。
通过向植物和动物导入外源基因，可以使其具备抗虫、抗病、抗旱和提高产量等特性。
转基因作物和转基因动物在农业生产中有着重要的应用价值。
3. 环境保护应用基因工程在环境保护领域也发挥着重要作用。
例如，利用基因工程技术可以构建具有高效降解能力的微生物菌株，用于处理工业废水和有机废弃物。
此外，基因工程还可以用于保护濒危物种和恢复生态系统等方面。
第一章基因工程的分子生物学基础1、基因工程（遗传工程、基因操作、重组DNA技术等）：细胞外用各种方法产生的核酸分子插入载体分子中，形成遗传物质的新组合，最终整合掺入到本来不含这些核酸分子的宿主生物中，并进行复制繁衍。
基因工程诞生的理论基础：①DNA双螺旋模型；②基因是可以转移的；③操作子模型的建立；④遗传密码子的破译。
基因工程的技术基础：①工具酶（DNA连接酶、内切酶、反转录酶）；②PCR 技术；③载体技术；基因转移技术。
2、DNA复制：①两条互补的反向平行的DNA单链之间由众多氢键连接（G-C、A-T）形成稳定DNA双链分子；②DNA合成的起始需要引物提供3，羟基，DNA聚合酶按照5→3方向合成DNA。
3、限制性内切酶：I类酶II类酶III类酶酶分子三亚基双功能内切酶与甲基化酶分离二亚基双功能识别位点二分非对称序列4-8bp序列，回文结构5-7bp非对称序列切割位点距识别位点1000bp 在识别位点中或靠识别位点在识别位点下游24-26bp限制性反应与甲基化反应互斥分开反应同时竟争限制作用需要需要不需要限制酶剪切：黏性末端：指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。
（①5’突出的黏性末端；②3’突出的黏性末端。
）③平末端：两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，形成的DNA片段具有平末端。
产生黏性末端的酶：a、同尾酶：一组来源不同识别序列各异的，但能够切割形成相同粘性末端的核酸内切限制酶。
b、同裂酶：有一些来源不同的限制性内切酶能识别并切割相同的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。
4、连接酶：能够催化两条双链DNA链之间形成5′，3′磷酸二酯键的酶①E. coli DNA 连接酶（只连接粘末端）利用NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）作为能量供体，主要来源于原核生物。
②T4 DNA连接酶（粘末端和平末端）利用ATP作为能量供体，主要来源于真核生物，T4噬菌体也属于此类。
在基因工程的实验中主要用T4 DNA连接酶。
5、核酸的分离纯化：通过各种方法将生物材料破碎，释放DNA（RNA）至溶液中，去除杂质（如用苯酚萃取蛋白质），再用乙醇沉淀核酸，通过离心，分离纯化核酸，最后用低浓度盐溶液溶解核酸。
细菌DNA的提取：细菌培养物的生长和收集→细胞提取物的制备→从细胞提取物中纯化DNA→DNA取样的浓缩→DNA浓度的测量（A260/A280=1.8）。
凝胶电泳：（弱碱性条件）根据DNA或RNA 分子的大小，形状和拓扑结构，将DNA和RNA进行分离的技术。
6、链终止法测序，技术路线与要求：制备单链模板→将单链模板与一小段引物退火→加入DNA多聚酶，4种脱氧核苷酸，分别加入少量4种双脱氧核苷酸→将4种反应产物分别在4条泳道电泳→根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列。
7、Southern印迹（DNA印迹）：(1) 提取组织中的DNA，并用内切酶消化，进行琼脂糖凝胶电泳；(2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上；(3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点；(4) 让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针；(5) 通过显影检查目的DNA所在的位置，以及信号的强度。
应用：限制性片段长度多态性；确定基因组中基因的拷贝数。
Northern(RNA)印迹：检测基因的表达。
Western (蛋白质)印迹：把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。
（蛋白表达量的检测，组织特异性蛋白定位的检测等）8、实验：鉴定特定基因转录物的转录起点：（通过核酸酶处理来研究DNA-RNA（RNA-RNA）杂交物）a、确定转录起始的位置（首先将可能的包含转录起始点以及上游的DNA克隆进入载体，获得单链的DNA片段；加入转录物，进行温育，退火，杂交；用S1核酸酶降解单链部分，获得RNA-DNA杂合双链；通过碱变性，降解RNA；检测被RNA保护的DNA片段的长度；判断所克隆的DNA片段中转录起始点的位置。
）b、通过引物延伸来研究转录物，确定转录起始点（获知转录物的部分序列；设计引物；通过反转录对引物延伸；对产物进行检测；确定转录的起始点位置。
）第二章原核生物分子克隆的宿主和载体系统1、E. coli K12 的生物学：①革兰氏阴性细菌；②没有核膜和染色体；③一个环状双链DNA分子，有一个复制起点；④细胞中能维持质粒DNA的复制；⑤生活周期较短，20min分裂一次；⑥能在发酵罐中高密度生长；⑦能在平板上培养出单克隆。
2、乳糖操纵子利用β-半乳糖苷酶及其基因；β-半乳糖苷酶能分解乳糖的类似物X-gal形成蓝色物质，可用此反应来检测细胞中β-半乳糖苷酶的活性。
3、X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷）①当细菌不携带质粒时，在抗生素培养基上无法生长；②当有质粒时，（1）多克隆位点MCS无外源片段插入，ɑ+w=完整lacZ；（2）MCS有外源片段插入（ɑ无功能，不能与ɑ互补，故不能分解X-gal），形成白色菌斑。
4、质粒的生物学：共价闭环，双链DNA分子；具有复制原点，能独立进行复制，不依赖寄主的细胞复制周期；赋予寄主一些表型特征，如抗生素抗性；选择性标记。
拷贝数：①严谨型:少数拷贝存在于细胞中（1~几个）；②松弛型:多个拷贝存在于细胞中（≥10）。
严谨型与松弛型是相对的。
调节拷贝数的机理：A）反义RNA进行调控的机制：①在复制起点处，RNA II（长555个碱基）与质粒DNA形成RNA-DNA复合物，RNA酶H的降解RNA II ，露出3’自由羟基，质粒复制起始。
②如果RNA I和RNA II形成双链RNA螺旋，RNA酶H不能降解RNA II，复制不能进行。
③当质粒的浓度比较高的时，RNA I和RNA II形成双链RNA螺旋，使质粒的复制不能起始。
④当质粒的比较低时，RNA II与质粒DNA形成RNA-DNA复合物，RNA酶H降解RNA II 质粒复制起始。
⑤突变RNA I或去除Rop基因导致质粒的拷贝数增加。
B）关键蛋白与重复区域结合进行调控的机理：①复制原点区域含有3～7拷贝的长度为17～22bp的重复区域，R1、R2、R3等。
②复制原点附近有一个编码基因repA,编码RepA蛋白。
RepA是双功能的蛋白：与复制原点区域的重复序列结合，起始DNA的合成；与自身基因的启动子结合，抑制自身的转录。
5、不相容性：在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞系中稳定地共存的现象，称为质粒的不相容性，或称为不亲和性。
这样的两种质粒称为不亲和质粒。
原因：A 具有相同的复制调控机制；B 控制质粒分配的par元件相同,也会引起质粒的不相容。
6、克隆载体：是一种能携带外源DNA片段进入受体细胞，并在受体细胞中得到维持或表达的DNA分子。
（通常由天然的质粒、噬菌体或动植物的病毒改造而成。
）7、质粒载体的三要素：（1）具有复制起点，在宿主细胞中能自主复制；（2）具有选择标记基因；（3）具有若干限制酶单一位点。
优化条件：具有较小的分子量和较高的拷贝数。
8、对野生λ噬菌体的改进：A、删除多余的限制性内切酶的位点；B 、切除一些非必需序列，增加载体的容量；C、设计阳性选择重组子的方法；D、设计可方便地通过转录作用制备外源插入DNA的RNA探针的载体；E、发展可以使插入的真核cDNA与β－半乳糖苷酶形成融合蛋白的载体。
λ噬菌体载体可分为：⑴插入型载体：只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。
⑵替换型载体：具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的λDNA区段可以被外源插入的DNA所取代。
体外包装：模拟λ噬菌体DNA分子在宿主细胞内发生的包装过程，将重组的λ噬菌体DNA分子包装成成熟的具有感染能力的λ噬菌体颗粒。
（必要性：λ噬菌体重组分子直接感染大肠杆菌的效率较低，而在试验过程中，因内切酶的处理，DNA的连接产生的有效分子等原因，使得转染效率更低）9、M13噬菌一般特点：①仅6407个核苷酸；②有双链环状，单链环状存在形式；③基因组采取滚环复制形式；④适合做载体；⑤具有比λ噬菌体更大的装载能力；⑥单链形式在某些实验过程很重要，如测序、体外突变等。
10、外源DNA和载体连接的方法：ⅰ（互补）黏性末端之间的链接；ⅱ平末端之间的链接；ⅲ将粘末端加到平末端分子上（同聚末端连接、人工接头、PCR产物的克隆连接）。
11、定向克隆：将外源DNA按正确的方向插入载体。
通常采用不同的内切酶分别处理载体和片段，使线性载体和片段的两段带有不同的粘性末端，通过载体与片段之间的连接，实现定向克隆。
12、实验：一个基因在E. coli 中的调节表达㈠构建原核表达载体（将外源片段与载体用相同的内切酶处理后，连接，形成重组分子，构建表达载体）；㈡纯化蛋白；㈢免疫家兔；㈣检测该蛋白质在花中的表达。
第三章基因文库的构建1、DNA基因文库: 用限制性内切酶酶切整个基因组DNA，把所得到的大量基因组DNA片段与载体连接，然后转化到细胞中去，让宿主菌长成克隆。
是某个生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体。
建立DNA/cDNA文库目的：①从复杂的基因组中分离单拷贝基因；②从来源复杂的总mRNA的cDNA文库中分离稀有的cDNA克隆。
用λ克隆载体构建基因组文库：（1）构建含多少重组子的库能覆盖一个选定的基因组：载体的装载能力，目标基因组的大小。
（2）保证目标基因包含在所构建的文库中：选择的载体装载量，所用的内切酶对基因组DNA的完全切割频率和不完全切割。
2、高容量载体构建基因组克隆优点：A、所需要的重组子少（即文库中包含的克隆数目较少）；B、目标基因相对比较完整。
3、亚克隆：对已经获得的目的DNA片段进程重新克隆，目的是对目的DNA进行进一步分析，或进行重组改造等。
过程：1）目的DNA片段和载体制备；2）目的DNA片段与载体相连；3）连接产物的转化；4)重组子的筛选。
对大片段的插入片段进行亚克隆的过程：a、首先确定该大片的限制酶酶切图谱，根据已知的酶谱进行定向克隆；b、鸟枪法进行随机克隆。
4、克隆DNA序列的体外诱变（1）随机诱变：在克隆化的基因序列中随机产生各种诱变。
（化学诱变、盒式诱变、随机缺失诱变等）（2）定点诱变：体外特异地改变目的DNA序列中某个碱基的技术称为定点诱变。
（PCR介导的定点诱变、寡核苷酸介导的诱变（如kunkel法））盒式突变，原理：利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中的相应序列。
优点：快速高效；无异源双链的形成；无需DNA聚合酶。
缺点:需要在目标序列的两侧具有限制性内切酶的位点。
Kunkel 法，原理过程：①当含目标DNA 插入载体并进入E.coli CJ236；②由于该菌体ung- dut- 突变，合成的DNA 上含有少量尿嘧啶（取代胸腺嘧啶）；③M13K07 辅助感染下，产生带U 的单链DNA ；④与引入诱变的引物复性；⑤在T7DNA polymerase 和ligase 作用下，以带U 的单链DNA 为模板合成一条新链，形成杂合双链（新生链中无U碱基）；⑥感染dut+ ung+ E.coli MV1190 后，在细胞分裂过程中，只有新合成的DNA 链才能起模板作用合成新的并引入了诱变位点的子代双链DNA 。
