人脐带MSC培养基使用方法

人脐血间充质干细胞治疗肝纤维化的研究进展【中图分类号】r329 【文献标识码】a 【文章编号】1004-7484（2012）13-0068-02研究发现，具多向分化潜能的间充质干细胞（mesenchymal stem cells，mscs），脐带间充质干细胞具有无限增殖和多项分化潜能，可以向肝细胞分化，能在体外自我增殖，并可以定向分化为内、中、外3 个胚层来源的多种细胞，如骨、软骨、脂肪、神经及类肝细胞等，有望用于肝脏疾病的治疗。

脐带来源广泛，无伦理道德方面的争议。

如果能够利用易于获得的mscs在体内外定向分化为肝前体细胞，则可做为肝细胞移植的一个主要来源。

不过脐血中的间充质干细胞含量很少，如何分离纯化？如何使其较长时间保持干细胞特性？如何诱导其向肝细胞分化？据研究表明，人脐血间充质干细胞能够贴壁生长，而体外培养的贴壁细胞是一个异质细胞群，可能含有多种细胞成分。

一般呈现类纤维细胞形态，并可分裂增生，且同时具有间皮细胞标志的贴壁细胞，如cd44+ 细胞，可以初步判断为是mscs。

之前，报道hucmscs可采用密度梯度离心法结合直接贴壁法分离获得，并可冷冻保存；复苏后在肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子4 的联合诱导下，能定向分化为表达ck8&18，并合成白蛋白和糖原的类肝细胞，类肝细胞可能具有诱导人脐血间充质干细胞向肝系细胞定向分化的作用。

脐血中存在mscs， ucbmsc 形态与mscs相似，倍增时间为48 h ，传代后形态基本无变化； ucbms c 不表达cd34及cd45，强表达cd44及cd166 ，与mscs的表面抗原特性一致，是脐血中区别于造血干细胞的一群处于未分化状态的非定向干祖细胞。

本研究先通过对hucmscs 的体外培养，对hucmscs进行纯化、扩增和鉴定；初步掌握hucmscs分离、培养及冻存的技术和方法，探索有效诱导hucmscs 分化为肝前体细胞的途径；然后，将诱导和未诱导的hucmscs在体外与人肝星状细胞（hsc）共培养，为下一步研究其在体内通过不同途径移植到肝纤维化鼠体内，以观察其对肝功能的修复情况及对肝纤维化进程的影响奠定基础。

酶消化法培养：
1.在250mL烧杯中，使用生理盐水充分洗涤脐带3次；
2.将脐带剪成约3cm的小段；
3.将脐带纵向剖开；
4.剥离3根血管；
5.剩余华通胶部分用生理盐水充分洗涤脐带3次；
6.剩余华通胶部分剪碎至约1mm3大小；
7.加入1mg/mL的II型胶原酶液（3cm脐带加入30mL酶液），37℃消化2小时；
8.2500rpm离心10min，弃上清；
9.沉淀加入30mL0.25%胰蛋白酶液，37℃消化20min；
10.将吸管头部去除，注意无菌，充分吹打消化体系
11.体系2500rpm离心10min，弃上清，
12.体系2000rpm离心10min，弃上清；
13.离心后的组织块移入175cm2培养瓶中，并使其均匀分布；
14.滤入适量完全培养基；
15.5天后换液
组织块培养：
1.在250mL烧杯中，使用生理盐水充分洗涤脐带3次；
2.将脐带剪成约3cm的小段；
3.将脐带纵向剖开；
4.剥离3根血管；
5.剩余华通胶部分用生理盐水充分洗涤3次；
6.剩余华通胶部分剪碎至约1mm3大小；
7.将组织块移入（0.5g/瓶）175cm2培养瓶中，并使其均匀分布；
8.缓慢翻转培养瓶，滤入适量完全培养基；
9.小心将倒置的培养瓶放入培养箱中；
10.细胞贴壁2-3小时后，小心翻转培养瓶，注意不要冲起组织块；
11.5天后换液；。

人脐带间充质干细胞操作规范一、人脐带间充质干细胞的分离和培养1.准备4~5个培养皿，打开放在超净台中，将消毒过的平剪×1，弯剪×2，有齿镊子×4，放入超净台，紫外照射30 min，通风10 XXX;2.在1#、3#和4#号培养皿倒入25 ml生理盐水，在2#培养皿倒入25 ml酒精;3.将盛放脐带的器皿用酒精消毒外表面后放入超净台，用弯嘴钳取出脐带放入1#培养皿，清洗残留血渍，用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血。

4.将脐带转移至2#培养皿，完全浸泡，计时1 XXX;5.将脐带转移至3#培养皿，用平剪剪成3 cm左右的小段，清洗脐带内的积血(如果积血较多，可再次转入另一加盐水的培养皿);6.用有齿镊子分离2根动脉和1根静脉，剥离华尔通氏胶，放入4#培养皿。

7.将剥离的胶体转移至50 ml离心管中，2000 rpm离心5 min。

8.弃上清液，将胶体倒入干净的培养皿中，用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中;9.以0.5 ml/瓶的量将胶体构造块接种至T75培养瓶，每瓶插手4 ml脐带有血清培养液(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/mlbFGF)，水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀;10.第2天观察是否有污染，每3天换一次液，并观察细胞爬出情况(过程中须注意平稳地拿放培养瓶，避免组织块发生移动);11.培养14天左右，倒去上清培养液，加心理盐水(3 ml/瓶)洗濯，用0.25%胰酶(2 ml/瓶)消化下爬出细胞及构造块，并用上清培养液(1 ml/瓶)终止消化;12.收集细胞及组织块悬液，2000 rpm离心5 min;13.弃上清液，插手适当心理盐水混匀，用70 μm滤网过滤去除构造块，即得到P0代脐带间充质干细胞;614.细胞计数，按10/瓶接种，每瓶插手10 ml脐带无血清培养液UltraCULTURE + 2% XXX 1% Glutamine + 1% MEM NAA)，每3天换一次液。

实验室常用实验方法-人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养___培养的步骤如下：1.将15-20cm长的新生儿脐带放入无菌的PBS溶液中储存，注意储存时间不要超过规定时间。

2.使用钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌的PBS溶液冲洗3-5次，将污血冲洗干净为止。

3.使用手术钳夹紧脐带下端，加入15ml的胶原酶（1mg/ml）室温下消化15-20分钟，并不时上下摇动脐带。

4.消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50ml无菌离心管中，用无菌的PBS溶液冲洗脐带2-3次。

5.将收集液离心（2000转/分）3分钟，倒去上清，加入10mlM199培养基（加入10U/ml的bFGF），用弯管吹散细胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，37℃培养。

6.在每个培养瓶中加入3-4ml无菌的1%的明胶溶液，摇匀使得明胶溶液完全铺满瓶底，放入37℃孵育，最少2小时，用前将明胶溶液倒了即可，明胶包被有利于细胞贴壁。

7.培养24小时后，倒掉培养基，并用无菌的PBS溶液清洗2-3次，洗掉红细胞和死细胞，加入10ml新鲜的M199培养基。

8.每2天换一次培养基（每次换掉2/3的培养基）。

9.一般培养5-7天，细胞可长满至80-90%单层，这时可以传代。

10.倒掉培养基，用无菌的PBS溶液清洗2-3次，加入2-3ml消化液（0.25%胰酶+0.1%EDTA）消化细胞，在显微镜下观察，一旦细胞变圆，即加入2-3倍的有血清的DMEM培养基终止反应。

11.使用弯管将细胞吹打下来，并将所消化的细胞转移到一个50ml无菌离心管中，2000转/分，离心3分钟。

12.倒掉上清，加入10ml新鲜培基，一般一瓶细胞可传代3-4瓶。

以后照此传代培养。

13.一般传代2-3代（培养了20天左右）用于做各种实验效果最好。

脐带间充质干细胞制备原理一、概述脐带间充质干细胞（Wharton's jelly mesenchymal stem cells，WJ-MSCs）是一种来源于新生儿脐带的干细胞。

与其他来源的干细胞相比，WJ-MSCs具有易于获取、无伦理争议、低免疫原性和多向分化潜能等优点，因此在临床应用中具有广泛的前景。

本文将就WJ-MSCs制备原理进行详细介绍。

二、脐带间充质干细胞的来源脐带是连接胎盘和新生儿的管道，其中包含了丰富的干细胞资源。

在脐带中，除了血液造血干细胞外，还存在着一种特殊类型的干细胞——脐带间充质干细胞。

这种干细胞主要存在于脐带Wharton's jelly （WJ）中，与周围组织隔离。

三、WJ-MSCs制备方法1. 脐带获取制备WJ-MSCs首先需要获取新生儿脐带组织。

通常情况下，在新生儿出生后不久即可进行采集。

采集过程中需要注意消毒和无菌操作。

2. 分离WJ组织将采集到的脐带组织进行分离，去除血管和外层膜等部分，得到WJ组织。

WJ组织是一种透明的胶状物质，通常呈现出白色或浅黄色。

3. 制备单细胞悬液将WJ组织切成小块，并加入胶原酶等消化酶进行消化。

消化后，用PBS等缓冲液洗涤多次，最后制备成单细胞悬液。

4. 培养和扩增将制备好的单细胞悬液接种在干细胞培养基中，并放置于37℃、5% CO2的培养箱内进行培养和扩增。

在培养过程中需要定期更换培养基，并对干细胞进行观察和评估。

5. 鉴定和纯化经过一段时间的培养，可以通过流式细胞术等方法对干细胞进行鉴定和纯化。

通常情况下，WJ-MSCs表达CD73、CD90、CD105等特征性标志物，并且不表达CD34、CD45等血液细胞特征性标志物。

6. 冻存经过纯化和鉴定后，WJ-MSCs可以进行冻存。

在冻存过程中需要使用特殊的冻存液，并在低温下保存。

四、WJ-MSCs的应用前景WJ-MSCs具有广泛的应用前景。

目前已经有多项临床试验显示，WJ-MSCs可以用于治疗多种疾病，如心血管疾病、神经系统疾病、肝脏疾病等。

不同培养基培养脐血间充质干细胞的比较作者：王丽娟来源：《赤峰学院学报·自然科学版》 2011年第7期王丽娟（赤峰学院医学院，内蒙古赤峰 024000）摘要：比较不同密度下DMEM-LG培养基、DMEM-HG培养基、IMDM培养基、α-MEM培养基培养脐血间充质干细胞的效果,发现应用IMDM培养基以2.0×106个细胞/ml的密度接种在培养瓶底可以完全铺层,而且加入碱性成纤维细胞因子可以显著加快脐血间充质干细胞的贴壁、伸展和铺层的速度.关键词：脐血间充质干细胞；培养基；生长过程中图分类号：R329 文献标识码：A 文章编号：1673-260X（2011）07-0037-02实验证明间充质干细胞（MSC）存在于身体的很多部位，骨髓和脐血是间充质干细胞的最主要来源.体外分离培养骨髓间充质干细胞已被广泛应用于各研究领域，而对人脐血中的MSC的研究尚处于起步阶段.在培养方面还没有统一的方法,培养的方案也各不相同.本试验分别应用DMEM-LG培养基、DMEM-HG培养基、IMDM培养基、α-MEM培养基对脐血单个核细胞进行培养，比较不同细胞密度下各种培养基培养脐血MSC的效果，并对培养出的脐血MSC的生长过程进行了研究.1 材料和方法1.1 脐血新鲜脐血由赤峰学院附属医院提供.在征得产妇同意后，无菌条件下采集新生儿脐血，用肝素抗凝.1.2 脐血MSC的分离和培养取血后12h内,用Ficoll-Hypaque分离液分离单个核细(MNC),并用PBS培养液洗涤3次,然后分别用含20%的胎牛血清(杭州四季青)和20μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的IMDM 完全培养基、含10%的胎牛血清和20μg/L的bFGF的DMEM-LG培养基、含10%的胎牛血清和20μg/L的bFGF的DMEM-HG培养基、含10%的胎牛血清和20μg/L的bFGF的α-MEM培养基调整细胞密度，每种培养基各自调整的密度分别为0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0×106/ml,种植于培养瓶中,然后于5%CO2、37℃、饱和湿度条件下培养.2 结果2.1 不同培养条件对脐血间充质干细胞的贴壁、生长的影响在使用同一批号血清的情况下，几种培养基培养脐血间充质干细胞的情况如下：DMEM-LG 培养基和DMEM－HG培养基有大量的细胞贴壁，但贴壁的细胞形状多样，有圆形、椭圆形、多角形等不规则形状，生长缓慢，随着培养天数的增加，贴壁的细胞都脱落下来.α-MEM培养基仅有少量的细胞贴壁，且贴壁的细胞是圆形或椭圆形，扁平的，几乎无生长，随着培养天数的增加，也都脱落下来.IMDM培养基培养出的细胞呈纤维状，形成克隆，并逐渐扩张.2.2 脐血间充质干细胞的最适接种密度细胞以不同密度接种于培养瓶中，并于倒置显微镜下进行观察.结果发现，在各个密度下，DMEM-LG培养基、DMEM－HG培养基和α-MEM培养基均没有完全铺层，20天后都脱落下来.而应用IMDE培养基，以0.6～0.9×106个细胞/ml的密度接种后，细胞贴壁稀疏甚至不贴,间距大,生长缓慢，随培养时间的延长,贴壁的细胞也都从瓶底脱落下来.以密度为2.0×106个细胞/ml接种时，细胞活性好，生长旺盛，形态为有规则的束状.密度在4×106/ml及其以上时，细胞生长拥挤，培养基消耗快，短时间内变黄，虽有大量细胞贴壁，但细胞贴壁不牢固.经过3次换液后，大部分贴壁细胞又都脱落下来.由此可见，最适合细胞贴壁的接种密度在2.0×106个细胞/ml左右.密度高于或低于2.0×106个细胞/ml，细胞不贴壁或贴壁状态不好.2.3 脐血间充质干细胞的生长过程脐血单个核细胞接种后，定期显微镜观察：24h可见细胞贴壁，最初细胞为圆形或不规则散在分布，有时与破骨细胞混杂存在.48h可见贴壁细胞增多，细胞周边开始伸出小突起，细胞呈条形或多角形（图A）.72h更多的细胞伸出突起，且细胞突起变长变大，折光性强，为类似成纤维细胞样的长梭形细胞，少数细胞可见微绒毛（图B）.1周可见成纤维细胞样的长梭形细胞更多，有的细胞开始接触（图C）.2周可见细胞集落融合成片，细胞排列有一定的方向性，呈漩涡状生长（图D）.3 讨论目前大量的研究已经证明脐血中存在间充质干细胞，本试验的结果也证明了这一结论.但是脐血中的MSC的量要小于骨髓中的MSC的量，而且也并不是每份脐带血中都能培养出间充质干细胞，培养条件各家实验室的报到也不尽相同.本实验在加入同一批次的胎牛血清和20μg/L的bFGF的条件下比较了DMEM-LG培养基、DMEM-HG培养基、IMDM培养基、α-MEM培养基培养脐血MSC的效果，发现IMDM培养基培养的细胞能够伸展且在培养瓶底部形成一层同源的纤维细胞层，可见本试验条件下IMDM培养基效果较好.不同的培养密度对细胞的生长也有影响，密度过低，细胞相互作用较少，联系少，细胞很难生长；密度过高，细胞过于拥挤，接触抑制，也很难生长，且培养基中的营养很快被消耗掉，为补充营养需频繁换液，细胞未牢固贴壁就掉下来，更不利于细胞的生长.本试验在贴壁较好的IMDM培养基的条件下2.0×106个细胞/ml是最适合细胞贴壁的接种密度.本试验培养基中加入了20μg/L的bFGF，从培养结果发现加入bFGF后比未加任何外源性生长因子[1]培养的脐血MSC贴壁要早，伸展的也要早，且能提前2周在培养瓶底完全铺层,这结果也与俞猛等报到的bFGF能够促进间充质干细胞的增殖的结果一致[2].这一试验对脐血MSC的培养条件进行了初步的研究，至于脐血MSC细胞间相互作用的机制及其分化、分化机制和分化后移植效果都有待于进一步研究.——————————参考文献：〔1〕王丽娟,张叶萍,王金福，等.脐血间充质干细胞的生物学特性及其对造血干/祖细胞体外扩增的支持作用.[J]中华血液学杂志,2005,26(2):65-68.〔2〕俞猛，夏仁云，高飙，等.bFGF和地塞米松对骨髓基质干细胞增殖与分化的影响[J].中国康复,2006,21(1):12-15.。

一种msc分离培养方法
一种MSC（间充质干细胞）分离培养方法是通过贴壁培养法。

以下是具体步骤：
1. 材料准备：培养皿、細胞培养基、胎牛血清或其他血清替代物等。

2. 选择适当的组织来源：MSC可以从骨髓、脐带血、脂肪组织等多种组织来源中获得。

根据需要选择适当的来源。

3. 组织处理：将组织样本在消毒的条件下剪碎并悬浮在适量的培养基中。

可以使用酶消化组织来释放单个细胞。

4. 过滤：将细胞悬浮液通过0.2μm的滤膜过滤，以去除大的细胞残渣和杂质。

5. 细胞接种：将过滤后的细胞悬浮液加入到预先消毒的培养皿中。

在培养皿表面生成单层细胞。

6. 培养条件：将细胞培养在37C的恒温培养箱中，提供适当的湿度和含氧环境。

培养基中添加适当浓度的血清或血清替代物。

7. 细胞观察和维护：每天观察细胞的生长情况。

若细胞达到80%的密度，可进行细胞传代，将细胞分散至新的培养皿中进行进一步扩增培养。

8. 细胞收获：当细胞增长到需要的数量和状态时，可以通过一系列的细胞收获方法，如胶原酶消化、细胞刮取等方式进行细胞收获。

这种贴壁培养法能够获得纯化的MSC群体并且有助于维持MSC的干性和分化潜能。

在分离培养的过程中，需要注意细胞的无菌操作和细胞培养条件的优化，以获取高质量和可靠的MSC细胞群体。