实验一蛋白质的两性电离及等电点测定

蛋白质等电点测定实验报告蛋白质等电点测定蛋白质等电点测定及性质实验一、目的：了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。

初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。

二、原理：固体颗粒在液体中为什么能够带电？当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电表面附近的液体中必有与固体表面电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。

在界面上带电表面和反离子形成了双电层的结构。

在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。

对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。

最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来Stern又提出了Stern模型。

根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用（例如范德华力）而和表面紧密结合，构成吸附层（或称紧密层、斯特恩层）。

其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的扩散层（或称滑移面）。

由于带电表面的吸引作用，在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。

离表面越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。

紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体表面上。

其余反离子则构成扩散层。

滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。

滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。

固体颗粒带电量的大小及测量方式？ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。

ζ电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高表明胶粒带电越多，扩散层越厚。

一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。

对于蛋白质分子来说：蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1～100微米。

蛋白质的两性反应和等电点测定一、实验目的1.熟悉蛋白质的沉淀反应、颜色反应和两性反应及其机理。

2.掌握蛋白质等电点的测定方法及其原理。

3.掌握蛋白质电荷的测定方法及其机理。

二、实验原理(一)蛋白质的沉淀反应原理蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如—NH3+，—COO-，—SH，—CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。

水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。

因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。

蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集沉淀。

蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。

当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。

蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀：1.加盐类如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称盐析。

盐析法是分离制备蛋白质的常用方法，不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，因此调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法叫做分段盐析。

但中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去或降低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。

2.加有机溶剂如酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀作用。

若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。

3.重金属盐如氯化汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化铁等。

这是因为蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与这些重金属的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。

4.某些酸类如苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。

等电点聚焦测蛋白质等电点一．实验目的1.了解蛋白质的两性解离性质和等电点聚焦的原理；2. 学习测定蛋白质等电点的方法并掌握圆盘电泳技术。

二．实验原理等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，IEF实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。

在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是这种分子的pI。

聚焦在等电点的分子也会不断地扩散。

一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。

因此，这些分子总是处于不断地扩散和抗扩散的平衡之中，在pI处得以“聚焦”。

三．实验步骤1.凝胶制备按表1的比例配制4ml工作胶液，在真空干燥器中抽气10min。

每组4管，每管加胶液1.8ml。

混匀后立即注入到已准备好的凝胶管中，胶液加至离管顶部1cm 处，在胶面上再覆盖3mm厚的水层，应注意不要让水破坏胶的表面，室温下放置20～30min即可聚合。

表1 凝胶工作液配比凝胶母液（丙烯酰胺30%：甲叉双丙烯1ml酰胺0.8%）10%过硫酸铵0.02ml水 2.68ml载体两性电解液0.15ml蛋白样品液0.1ml,0.05mlTEMED 0.02ml2.电泳吸去凝胶柱表面上的水层，将凝胶管垂直固定于圆盘电泳槽中。

于电泳槽下槽加入0.2％的500ml硫酸作正极；上槽加入0.5％的800ml乙醇胺作负极打开电源，将电压恒定为300V，因为聚焦过程是电阻不断加大的过程，故聚焦电泳过程中，电流将不断下降，降至稳定时，即表明聚焦已完成，继续电泳约30min后，停止电泳，全程约需3h。

3.剥胶电泳结束后，取下凝胶管，用水洗去胶管两端的电极液，按照柱状电泳剥胶的方法取出胶条，以胶条的正极为“头”，负极为“尾”，正极端呈酸性，负极端呈碱性。

蛋白质两性性质及等电点的测定蛋白质是生物体中极其重要的有机化合物，是构成生物体的基本组成部分之一。

蛋白质具有很多种类和功能，不同的蛋白质在生物体内发挥着不同的作用。

蛋白质的性质也因其结构而异，其中包括两性性质和等电点。

本文将介绍蛋白质的两性性质及等电点的测定。

一、蛋白质的两性性质蛋白质是由多肽链组成的，其分子中含有氨基酸残基。

这些氨基酸残基中的羧基（-COOH）和氨基（-NH2）可以参与酸碱反应，所以蛋白质具有两性性质，能够在不同的pH值下呈现不同的电离状态。

1. 在低pH值下，蛋白质中的羧基处于质子化状态，成为正电荷，而氨基则不受质子化，保持中性。

因此，在低pH值时，蛋白质呈正电荷状态，称为阳离子。

2. 在高pH值下，蛋白质中的氨基受到氢离子的质子化，成为正电荷，而羧基则不受质子化，保持中性。

因此，在高pH值时，蛋白质呈负电荷状态，称为阴离子。

3. 在等电点附近，蛋白质的质子化和去质子化同时发生，羧基和氨基的质子化程度相等，呈中性状态。

此时，蛋白质没有净电荷，称为等电点。

由于蛋白质的两性性质，可以影响其溶解性、折叠构象和相互作用等特性，对其功能和生物学作用具有重要影响。

二、蛋白质等电点的测定等电点是蛋白质具有中性状态的pH值。

测定蛋白质的等电点可以帮助我们了解其溶解性、电动力学性质和酸碱加工过程中的变化。

常用的测定等电点的方法有以下几种：1. pH梯度电泳法：这是一种常用且广泛应用的测定等电点的方法。

在一个pH梯度上进行电泳，当蛋白质离子迁移速率和电场力相等时，达到等电点。

可以通过在梯度上观察蛋白质带的形成和移动情况来确定等电点。

2. 等电聚焦电泳法：这是一种利用电场作用下蛋白质在凝胶上垂直移动的方法，根据蛋白质在凝胶中的移动速率和电场力相等时的pH值来测定等电点。

3. 等电点电位计法：该方法利用等电点时蛋白质没有净电荷的特性，使用电位计测量蛋白质在不同pH值下的电位变化，找出没有净电荷时的pH值，即为等电点。

实验六蛋白质的性质（二）蛋白质的等电点测定和沉淀反应一、蛋白质等电点的测定（一）目的1、了解蛋白质的两性解离性质。

2、学习测定蛋白质等电点的一种方法。

（二）原理蛋白质是两性电解质，在溶液中存在下列平衡：蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。

当溶掖的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的PH值称为此蛋白质的等电点(p1)。

不同的蛋白质有其各自的等电点。

在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质来测定各种蛋白质的等电点。

最常用的方法是利用物质在达到等电点时溶解度最小的性质，测定蛋白质溶液的溶解度呈现最低时的溶液pH值，此时的pH倍即为该蛋白质的等电点。

本实验通过观察酪蛋白在不同pH溶液中的溶解度，来测定酪蛋白的等电点。

用醋酸与醋酸钠配制成各种不同PH值的缓冲液．然后向各缓冲溶液中加入酪蛋白，观察沉淀出现并测定酪蛋白的等电点。

（三）实验器材1、水浴锅。

2、温度计。

3、200mL锥形瓶。

4、100mL容量瓶。

5、移液管。

6、试管。

7、试管架。

8、研钵。

（四）材料与试剂1、0.5％酪蛋白醋酸钠溶液：取0.5g酪蛋白．加少量水在研钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质液移入200 mL锥形瓶内，并用少量40～50℃的温水洗涤研钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。

加入10 mLlmol/L醋酸钠溶液。

把锥形瓶放入50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。

将锥形瓶内的溶液全部移至100 mL容量瓶内，加水至到度，塞紧玻璃塞，混匀。

2、1mo1/L醋酸溶液。

3、0.1mo1/L醋酸溶液。

4、0.01mo1/L醋酸镕液.（五）操作方法2、。

静置20min后，再观察每支试管内溶液的混浊度，以—、＋、＋＋，＋＋＋符号表示沉淀的多少，根据观察结果，指出那一个pH是酪蛋白的等电点。

二、蛋白质的沉淀及变性（一）目的1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。

【精品】实验1：蛋白质的两性电离和等电点实验原理：蛋白质由多个氨基酸连接而成，每个氨基酸都有两个离子化的官能团：氨基(NH2)和羧基(COOH)。

当氨基酸中的氨基失去一个质子(H+)后，形成正离子；当羧基失去一个质子后，形成负离子。

因此，氨基酸可以被视为一个带有离子性的分子，它的离子化程度受pH 值的影响。

对于一个蛋白质分子而言，它的离子化程度与pH值有关，当pH值升高时，蛋白质分子中的氨基越来越少地被质子化，羧基越来越多地被离子化，所以整个蛋白质分子的电荷量逐渐变小，反之亦然。

当一个蛋白质分子的电荷量为0时，称之为该蛋白质的等电点(pI)。

实验步骤：1. 将pH计校准至标定点，即pH 4.0和pH 10.0。

2. 在烧杯中加入1 mL的Pepsin酶溶液，加入100 mL的pH 2.0的盐酸缓冲液。

4. 在两组烧杯中，加入0.02％的溴酚蓝指示剂。

5. 在烧杯中加入一小块鱼肉，加满盐酸缓冲液至50 mL。

7. 在两组烧杯中，用烧杯中的pH计调节 pH值，使溴酚蓝指示剂变色。

8. 记录此时的pH值，作为该物质的等电点(pI)。

实验结果和分析：鱼肉的等电点(pI)为4.3，毛发的等电点(pI)为5.9。

说明鱼肉中的氨基酸比毛发中的氨基酸更容易被质子化，因此，在低pH值下，鱼肉带有更多的正电荷。

反之，在高pH值下，毛发带有更多的负电荷。

实验中，采用溴酚蓝指示剂来检测溶液的pH值，其变色区间为pH 3.0~pH 5.0(黄色)和pH 6.0~pH 7.6(蓝色)。

因此，在调节pH值时，需注意溴酚蓝指示剂的变色范围，以免影响结果的准确性。

结论：蛋白质具有两性电离特性，其离子化程度受pH值的影响。

当一个蛋白质的电荷量为0时，称之为该蛋白质的等电点(pI)。

通过实验测定，可以了解不同蛋白质样品的两性电离特性和等电点。

实验一蛋白质的两性电离和等电点的测定仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 谢谢2第三章 实验内容实验一 蛋白质的两性电离和等电点的测定【目的】验证蛋白质的两性电离与等电点性质。

【原理】蛋白质由氨基酸组成。

蛋白质分子除两端游离的氨基和羧基可解离外，其侧链上的某些酸性基团或碱性基团，在一定的溶液pH 条件下，都可解离成带负电荷或带正电荷的基团。

因此，蛋白质具有两性解离性质。

当蛋白质溶液处于某一pH 时，蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势相等，既净电荷为零，成为兼性离子，此时溶液的pH 称为蛋白质的等电点（isoelectricpoint,pI ）。

蛋白质在等电点状态时溶解度最低，容易沉淀析出。

蛋白质在大于其等电点的pH 值溶液中带负电荷；在小于其等电点的pH 值溶液中则带正电荷。

蛋白质在等点电以外的PH 值溶液中，因分子带有同种电荷而相互排斥，不易沉淀。

本实验通过观察酪蛋白在不同pH 溶液中的溶解度来测定其等电点。

＞pI （pH ）pI （pH ）=pI ＜（pH ）PrNH 3+COO -PrNH 3+COOHPrNH 2COO -蛋白质解离成阳离子 蛋白质成兼性离子 蛋白质解离成阴离子【器材】试管、试管架、滴管、刻度吸管。

【试剂】1. 5g/L 酪蛋白醋酸钠溶液称取纯酪蛋白0.5g，加蒸馏水40ml及1.00mol/LNaOH溶液10.0ml，振荡使酪蛋白溶解，然后加入1.00mol/L醋酸溶液10ml，混匀后倒入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀。

2. 0.1g/L溴甲酚绿指示剂该指示剂变色范围为pH 3.8～5.4。

指示剂的酸色型为黄色，碱色型为蓝色。

3. 0.02mol/L HCl溶液4. 0.02mol/L HaOH溶液5. 1.00mol/L 醋酸溶液6. 0.10mol/L 醋酸溶液7. 0.01mol/L 醋酸溶液【操作】1.蛋白质的两性电离(1)取试管1支，加入5g/L酪蛋白醋酸钠溶液1ml，0.1g/L溴甲酚绿指示剂6～7滴，混匀后，观察并记录溶液的颜色。

蛋白质的两性反应实验报告一、实验目的1、了解蛋白质的两性解离性质。

2、掌握蛋白质两性反应的实验操作和现象观察。

二、实验原理蛋白质是由氨基酸组成的大分子化合物，其分子中同时含有可解离的酸性基团（如羧基 COOH）和碱性基团（如氨基 NH₂）。

在一定的pH 条件下，蛋白质会发生解离，使其分子带上正电荷或负电荷。

当溶液的 pH 达到某一特定值时，蛋白质所带的正电荷和负电荷数量相等，此时蛋白质的净电荷为零，这个 pH 值称为蛋白质的等电点（pI）。

在等电点以上的 pH 环境中，蛋白质解离成阴离子，带负电荷；在等电点以下的 pH 环境中，蛋白质解离成阳离子，带正电荷。

因此，通过调节溶液的 pH，可以观察到蛋白质的两性反应。

三、实验材料与设备1、实验材料鸡蛋清溶液04%酪蛋白乙酸钠溶液1%醋酸溶液01mol/L 盐酸溶液01mol/L 氢氧化钠溶液001%溴甲酚绿指示剂广泛 pH 试纸2、实验设备试管滴管移液管离心机四、实验步骤1、蛋白质的两性反应取 4 支试管，编号为 1、2、3、4。

向 1 号试管中加入 2mL 鸡蛋清溶液，滴加 2 滴 01mol/L 盐酸溶液，边加边振荡，观察溶液的变化。

向 2 号试管中加入 2mL 鸡蛋清溶液，滴加 2 滴 01mol/L 氢氧化钠溶液，边加边振荡，观察溶液的变化。

向 3 号试管中加入 2mL 04%酪蛋白乙酸钠溶液，滴加 2 滴 1%醋酸溶液，边加边振荡，观察溶液的变化。

向 4 号试管中加入 2mL 04%酪蛋白乙酸钠溶液，滴加 2 滴 01mol/L 氢氧化钠溶液，边加边振荡，观察溶液的变化。

2、蛋白质等电点的测定取 5 支试管，编号为 5、6、7、8、9。

向 5 号试管中加入 4mL 04%酪蛋白乙酸钠溶液。

向 6 号试管中加入 2mL 04%酪蛋白乙酸钠溶液和 2mL 01mol/L 盐酸溶液，摇匀。

向 7 号试管中加入 2mL 04%酪蛋白乙酸钠溶液和 2mL 01mol/L 氢氧化钠溶液，摇匀。

蛋⽩质的两性电离及等电点
（⼀）两性电离
蛋⽩质既含有能解离成带正电荷的氨基，⼜含有能解离成带负电荷的羧基，可以进⾏两性电离。

蛋⽩质在溶液中的游离状态受溶液pH值的影响，在酸性环境中，蛋⽩质分⼦电离成阳离⼦，在碱性环境中，则电离成阴离⼦，蛋⽩质在某⼀pH值的溶液中所带正、负电荷的量相等时，被称为兼性离⼦（两性离⼦）。

（⼆）等电点（pI）
蛋⽩质以兼性离⼦状态存在时溶液的pH值即为该蛋⽩质的等电点。

⾎浆的pH为7.4.⽽⾎浆中各种蛋⽩质的等电点都⼩于7.4.故在⾎浆中以阴离⼦形式存在。

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（三）电泳
蛋⽩质阴、阳离⼦在电场中分别向正、负电极移动。

这种带电荷的蛋⽩质，在电场中向电性相反的电极移动的现象称为蛋⽩质电泳。

电泳的速度与带电粒⼦电荷多少、分⼦的⼤⼩、形状以及电场强度等多种因素有关，故可⽤电泳法来分离纯化、鉴定和制备蛋⽩质。