western blot实验实验步骤

Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤

发布日期:2008-8-25 热门指数:4360

Western Blot(免疫印迹法)

主要包括以下4个基本步骤：

n 样品制备

n 电泳分离

n 蛋白的膜转移

n 免疫杂交与显色――蛋白检测

溶液和试剂

n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS)

n Modified RIPA buffer

Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM

n 1X SDS 样品缓冲液

62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于 25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝

n 转移缓冲液

25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇 (pH 8.3)

n 10X Tris缓冲盐 (TBS)

准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为 7.6

n 脱脂奶粉或BSA

n 甲醇

n TBS/T缓冲液

1X TBS, 0.1% Tween-20

n 封闭缓冲液（TBS/T） 1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA

n 一抗的稀释

1X TBS, 0.1% Tween-20 加 5% BSA (多抗)或 5%脱脂奶粉(单抗)

Note: 一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。

Western-blot实验操作步骤

Western blot实验步骤

一、 制备蛋白样品（单层贴壁细胞总蛋白提取）

1.倒掉细胞培养液,加3ml预冷的PBS洗涤细胞，重复两次，弃掉PBS后将细胞培养瓶置于冰上。

2.裂解液RIPA(强)1ml +PMSF10ul(100:1),两者混匀后加入培养瓶中裂解细胞，冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动。

3.裂解完后，用细胞刮将细胞刮于一侧（动作要快），转移至ep管中.

4.4度，12000rpm,离心5min.离心后取上清至新的ep管中，用于后续实验（-80保存）

常用蛋白收样：倒掉细胞培养基后，预冷PBS洗涤细胞2次，弃去，再加入1ml PBS，用细胞刮轻轻刮取细胞，转移至1.5ml ep管中，12000rpm，离心5min，尽量吸净上清，沉淀于-80保存，用于后续实验。 融化蛋白样品，加入RIPA+PMSF细胞裂解液（200ul/ep管），充分混匀，冰上裂解20min，4度离心，5min ，12000rpm，小心吸取上清至新的ep管中。

二、蛋白浓度测定(BCA法)

BCA(碧云天)蛋白浓度测定试剂盒灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul。

在50-2000ug/ml浓度范围内有较好的线性关系。

标准蛋白BSA浓度：5mg/ml (-20保存) ,完全溶解蛋白标准品，取10ul稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml(ug/ul)。蛋白样品在什么溶液中，

标准品也宜用什么溶液稀释。但为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。

1. 配置BCA工作液

A液 ： B液= 50 : 1 ，混匀 A液+B液=200ul (每个样本)

样本数量： 7个标准品 + N 个待测蛋白样本

2. 先将每孔加入200ul BCA工作液，再加入蛋白样本。（96孔板）,总体积为10ul.待测蛋白样本先10倍稀释。

Western bolt

一、实验目的

通过实验了解western blot技术的原理和操作。

二、实验原理

SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。 PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)，在胶体金试纸中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。NC膜是生物学试验中最重要的耗材之一。

第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。第二抗体是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。

化学发光HRP底物（辣根过氧化物酶底物，也常被称为ECL试剂）是目前Western blot检测中最为灵敏的试剂。显影液的A液主要成分为鲁米诺（Luminol）及发光增强剂，B液主要成分为过氧化物溶液。二抗上含有HRP（辣根过氧化物酶），可以催化A液和B液反应发光。

三、实验器材

1.电泳槽，胶板架子

2.转膜仪

westernblot电泳原理及步骤

一、概述

西方印迹（westernblot）是一种重要的蛋白质分析技术，广泛应用于分子生物学和生物化学研究中。它通过将待检蛋白质进行SDS-PAGE电泳分离，再转移到聚合物膜上，利用特异性抗原与抗体结合的原理，检测目标蛋白质的存在与表达水平。

二、原理

1.SDS-PAGE电泳分离

-准备样品：将待检蛋白质样品加入去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合，使蛋白质变性和解聚。

-加载样品：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel）孔上。

-电泳分离：将准备好的凝胶置于电泳槽中，通电使蛋白质在凝胶中由负极向正极运动分离。

2.转膜

-准备转膜装置：将PVDF或NC膜与吸水性纸张浸泡后，叠放在转膜装置中，并按压缩成一整体。

-预处理转膜：将转膜装置放入转渍缓冲液中浸泡，使其湿润。

-转移：将电泳完的凝胶与转膜装置层叠，加上固定层叠板，施加压力进行转膜。

3.免疫检测

-封闭：将转膜后的膜置于封闭液中，阻断非特异性结合位点，减少背景信号。

-孵育：将膜与目标蛋白对应的一抗抗体孵育，使其与目标蛋白特异性结合。 -洗涤：用洗涤缓冲液洗去非特异性结合的抗体。

-二抗检测：将膜与与一抗相应的辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。

-显示：加入发色底物，与酶催化反应，生成可视化的蛋白质带谱。

三、操作步骤

1.准备样品

-将待检蛋白质样品加入适量去离子水、蛋白质缓冲液和还原剂混合。

-完全溶解样品，可加热至95°C处理。

2.SDS-PAGE电泳分离

-准备分离凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适浓度的凝胶。

-加载样品：用自动吸管或微量注射器将样品均匀地加载到聚丙烯酰胺凝胶孔上。

-启动电泳：将准备好的凝胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，通电进行电泳。

3.转膜

-准备转膜装置：按照转膜装置的说明书操作，准备好转膜膜和膜瓶。

-预处理转膜：将PVDF或NC膜与吸水性纸张浸泡，并放入转膜缓冲液中浸泡片刻。