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微生物发酵过程与发酵概况

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一 发酵

1微生物发酵过程与发酵概况

发酵技术的特点

1在发酵设备中一次完成。

2反应条件温和,能耗少,设备简单。

3原料来源广泛。

4易产生高分子化合物，并能进行特定修饰。

5严格注意防止杂菌污染。

发酵过程类别

根据对氧的需要：

厌氧发酵和好氧发酵

根据培养基物理性状

液体发酵和固体发酵

根据发酵设备

敞口发酵、密闭发酵、浅盘发酵和深层发酵

革兰氏染色法

初染：结晶紫染色

滴加结晶紫染液于涂片上，染1分钟，水洗，甩干。

媒染：碘液媒染

碘液，1分钟后水洗，甩干。

脱色：乙醇脱色

加95％酒精数滴于涂片上，约30秒钟，水洗，甩干。

复染：番红复染

复染1分钟后，水洗，待干油镜镜检。

革兰阳性菌(G＋)：细胞壁化学成分以肽聚糖为主,其次是磷壁酸。包括金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌和双歧杆菌等。

革兰阴性菌(G－)：细胞壁中肽聚糖含量较低，不含磷壁酸，脂类和蛋白质含量较高。包括大肠杆菌、醋酸杆菌和假单胞菌等。

发酵培养基

初级代谢产物：

菌体对数生长期形成的产物，是细胞自身生长所必需的。包括氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸和糖类等。

次级代谢产物：

在菌体生长缓慢或停止生长时即稳定期所合成的一些具有特定功能的产物。包括抗生素、生物碱、细菌毒素、植物生长因子等。

培养基的类型

１．按培养基成分

天然培养基、合成培养基和半合成培养基 2．按培养基的物理状态

固体培养基、半固体培养基和液体培养基

3．按培养基的用途

孢子培养基、种子培养基和发酵培养基

二 细胞工程

细胞培养基本知识与基本技术

 无菌操作

动物细胞培养基本条件、基本技术

基本操作技术

1洗涤2培养基 3灭菌 4接 种

细胞株：原代培养细胞传至10代左右就不容易传下去，

细胞系：细胞株传到50左右不能再继续传代

pH 值

动物细胞合适的pH值一般在7.2-7.4，低于6.8或高于7.6时都对细胞产生不利的影响，严重时可导致细胞退变或死亡。

其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。

维生素参与构成各种酶的活性基团的成分，与细胞代谢活动紧密相关。

动物细胞培养方法，细胞生长周期、细胞冻存与复苏

体外培养细胞基本技术

体外培养特点

1营养条件苛刻

2适应性差, 敏感

3培养时间长，易污染

冻存和复苏的原则：慢冻快融

细胞生长周期 1、潜伏期2、指数增生期3、停滞期4、衰退期

细胞大规模培养方法

细胞类型: 悬浮培养和贴壁培养

大规模培养中细胞的培养方式

贴壁培养

悬浮培养

固定化培养

制备方法很多，包括吸附法、共价贴附法、离子/共价交联法、包埋法、微囊法

深层培养可分为四种：

分批式、流加式、连续式和灌注式

流加培养中的关键技术是基础培养基和流加浓缩的营养培养基。通常进行流加的时间多在指数生长后期，细胞在进入衰退期之前，添加高浓度的营养物质。

1诱导细胞融合的方法

病毒诱导融合

化学诱导融合

电诱导融合

激光诱导融合

3细胞融合技术步骤

干细胞定义，干细胞特点与培养

干细胞定义是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，是重建、修复病损或衰老组织、器官功能的理想种子细胞

特点

（1）具有分裂成其他细胞的可能性。

（2）干细胞能无限的增殖分裂。

（3）干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态。

（4）干细胞通过两种方式生长 ，一种是对称分裂--形成两个相同的干细胞，另一种是非对称分裂--由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分配，使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端成为功能专一的分化细胞；另一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来。分化细胞的数目受分化前干细胞的数目和分裂次数控制。

胚胎干细胞培养过程中的关键是维持胚胎干细胞的未分化状态。

胚胎干细胞的培养：

将分离得到的内细胞团接种于具分化抑制条件的培养体系中进行培养，待细胞生长形成集落后，进行传代，经多次传代，直至成系。

三 基因工程

根据酶的功能、大小和反应条件及切割ＤＮＡ的特点

Ⅰ型限制性内切酶

Ⅱ型限制性内切酶

Ⅲ型限制性内切酶

DNA连接酶能催化双链DNA片段紧靠在一起的3’-OH末端和5’-P末端之间形成磷酸二酯键，使两末端链接。

影响DNA连接酶活性的因素

① 连接反应的温度

② T4 DNA连接酶的用量

③ 提高外源片断与载体浓度比值（10～20倍）

PCR直接扩增目的基因

从基因组中扩增 适合扩增原核生物基因。

真核生物基因组含有内含子！

从mRNA中扩增: RT-PCR 适合扩增真核生物基因。原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。

生物技术：是指人们以现代生命科学为基础，结合其他学科的科学原理，采用先进的工程技术手段，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的。

转基因技术是指利用基因工程技术，将某些生物的基因转移到其他物种中，改造生物的遗传物质，使遗传物质得到改造的生物在性状、营养和消费品质等方面向人类需要的目标转变

1、微生物发酵产物有哪几种类型?

发酵类型

１．微生物菌体发酵

２．微生物酶发酵

３．微生物代谢产物发酵

４．微生物的转化发酵

５．生物工程细胞发酵

2、发酵培养基由哪些成分组成？

（1）碳源

分为有机碳源和无机碳源两类。

常用的碳源有糖蜜，淀粉、葡萄糖、蔗糖和乳糖等

（2）氮源

分为有机氮源和无机氮源

（3）水（4）无机盐是微生物生命活动所不可缺少的物质。

（5）生长因子

3、掌握菌种选育基本原理及步骤。

菌种选育

1诱变育种

指选择合适的诱变因素处理微生物，诱变基因发生突变，然后根据育种目标，运用合适的筛选方法从变异体中获得符合要求的突变菌株。

2杂交育种

指两个基因型不同的菌株通过接合使遗传物质重新组合，再从中分离、筛选出具有新性状的菌株。 标记菌株的选择→异核体的形成→杂合二倍体的形成→重组体的转化→重组体遗传性状的分析

3原生质体融合

细胞融合技术：通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合

4基因工程 重组DNA

发酵类型

微生物 菌体 发酵、微生物 酶 发酵、

微生物 代谢产物 发酵、

微生物 转化 发酵、

生物工程细胞 发酵。

抗生素中70％以上由 放线菌

生产，产物有链霉素、金霉素、红霉素和庆大霉素等。

碳源 分为有机碳源和无机碳源两类。

异养微生物 自养微生物

下列哪种不是工业生产上通常使用的碳源物质 A 淀粉B 花生饼粉C 葡萄糖D 糊精

生理酸性物质有哪些

A 豆制品B 肉类C 牛奶 D 蔬菜E 谷物

2体外动物细胞培养需哪些条件？

体外培养细胞基本条件

 合适的细胞培养基

 优质血清

 无菌无毒的培养环境

 恒定的培养温度

 合适的气体环境

什么是细胞融合技术？如何筛选？

细胞融合技术：通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合

单克隆抗体的生产步骤 1用抗原免疫小鼠，使其产生抗体

2将小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合

3在选择培养基中对细胞进行筛选，筛选出杂交瘤细胞。

4将杂交瘤细胞在体外培养

5将该细胞群扩大培养

6将扩大培养的细胞进行体外培养最终分离提取单克隆抗体或将其注入小鼠腹腔内进行体内培养最后从小鼠腹水中提取单克隆抗体

融合细胞筛选方法

1基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选

2基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选

3由温度敏感突变型细胞组成的杂种细胞的筛选

4应用荧光激活细胞分选仪进行杂种细胞的筛选

干细胞定义是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，是重建、修复病损或衰老组织、器官功能的理想种子细胞

3核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶。

核糖核酸酶:专门水解断裂RNA分子

脱氧核糖核酸酶:特异水解断裂DNA分子

核酸外切酶：从核酸分子的末端开始，一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链；

核酸内切酶：从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段。

质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位。

PCR技术的基本原理

PCR类似于DNA的天然复制过程，将待扩增的DNA片段和与其两侧互补的两端寡聚核苷酸引物，经变性，退火和延伸等若干循环后，DNA扩增倍数可达2n倍.

（1）DNA模板变性 (90～95℃)

双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。

（2）DNA模板与引物复性 (37～60℃) 引物: 人工合成的单链DNA小片断，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5’端相同。

（3）DNA链的延伸 (70～75℃)

DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。

特点

1. 高度敏感性

理论上一条模板链，32次循环就可合成约109条。

2. 高度特异性

① 专门合成的DNA引物

② 延伸过程是在高温下进行，避免一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA，提高了反应的特异性。

3. 操作简便

对模板的纯度要求低。不需要纯化，甚至可以直接用细菌，已固定或包埋的组织切片用作模板 。

4. 适用广泛

（4）化学合成法

质粒载体必备的基本条件

（1）具有复制起点（ORI）

（2）具有抗菌素抗性基因

（3）若干限制性内切酶的单一识别位点

（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数

自然界存在两种类型的核酸：DNA

和 RNA 它们的基本组成单位核苷酸。

核苷酸由磷酸基团 、戊糖和 戊糖 组成。

基因工程中常用的工具酶有那些？分别起什么作用？

限制性内切酶：用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片段

DNA甲基化酶：用于DNA分子的甲基化

核酸连接酶：用于DNA和RNA的连接

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微生物学中的发酵过程和微生物检测技术

微生物学中的发酵过程和微生物检测技术

微生物学中的发酵过程和微生物检测技术

微生物学是研究微观生物（包括细菌、真菌、病毒等）的科学，其广泛应用于生物制药、食品、医疗、环保和农业等领域。其中，发酵技术是微生物学的一个重要分支，可用于酿造酒类、酱油、醋、味精、乳制品等产品的生产。在发酵过程中，微生物菌种通过代谢产生有用的代谢产物，同时也会产生一些有害的物质，这些过程常常需要进行微生物检测来保证产品质量和安全。

一、发酵过程

发酵是一种生物发生氧化还原反应的过程，在此过程中，微生物细胞针对不同的营养物质进行代谢，从而产生有用的代谢产物，如酸、酒精等。发酵技术是各行各业中非常重要的工艺之一，如酒类工业、食品工业、生物工程等等。

在发酵的过程中，各种微生物的生长都需要一个能够供养生长所需要的营养物质，其中包括光能、空气、水和矿物质（氮、磷、钾、钙等）。对于不同的微生物类型而言，他们针对不同的营养物质进行代谢，产生的有机物质也有明显的差别。

例如制酒时，果汁中的葡萄糖和葡萄糖酸被酵母菌（一类产生酒精的真菌）代谢，产生的乙醇达到一定浓度时便会停止生长，称为发酵停滞期。而在这个过程中，酵母会消耗掉果汁中的许多氧化还原位点，从而降低发酵反应性质（碳酸根和其他离子等等）。因此，如果要调节酒的品质和口感，需要在特定的发酵过程中使用不同的酵母菌，或者增加其他微生物（如醋酸菌）、产生改善性能的添加剂。

二、微生物检测技术

随着生产流程的逐渐自动化，微生物检测技术的重要性逐渐凸显出来。在食品、医疗和生物工程等领域，微生物的污染可能对产品的质量和安全带来严重影响。此外，发酵过程中，常常需要对微生物进行定量和定种，以便生产工艺的精密控制。

目前，微生物检测技术主要包括菌落计数法、酶透彻法、基因测序法等。菌落计数法是目前最常见的检测方法之一，该方法通过培养微生物菌落的方式来直接计数微生物数量，检测的结果准确性较好。酶透彻法则是利用特殊的酶进行检测微生物菌褶，可以检测到不同类型的微生物。基因测序法是通过分析微生物的DNA/RNA来分析其型别，需要使用先进的仪器和高水平的技术人员。

微生物发酵工艺

微生物发酵工艺

第六章 微生物发酵制药工艺

6.1 微生物发酵与制药

6.2 微生物生长与生产的关系

6.3 微生物生产菌种建立 6.4 发酵培养基制备

6.4 发酵培养基制备

• 概念（medium） 供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要

的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。

• 培养基的组成和比例是否恰当，直接影响微生 物的生长、生产和工艺选择、产品质量和产量。

6.4.1 培养基的成分

碳源

氮源 无机盐 水 生长因子

前体与促进剂

消泡剂

1、碳源(carbon sources)

概念：

构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质。 作用： 为正常生理活动和过程提供能量来源，为细胞物 质和代谢产物的合成提供碳骨架。

碳源种类

糖类：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜

脂肪：豆油、棉籽油和猪油 醇类：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇 蛋白类：蛋白胨、酵母膏 速效碳源：糖类、有机酸

迟效碳源：酪蛋白水解产生的脂肪酸

2、氮源（nitrogen sources）

概念： 构成微生物细胞和代谢产物中氮素的营养物质。

作用：为生长和代谢主要提供氮素来源。 种类：无机氮源、有机氮源

有机氮源

几乎所有微生物 都能利用有机氮 源

黄豆饼粉、花生饼粉

棉籽饼粉、玉米浆、蛋 白\胨、酵母粉、尿素

无机氮源

氨水、铵盐和硝酸盐等。氨盐比硝酸盐更快被利用。

工业应用：主要氮源或辅助氮源；调节pH值 生理酸性物质：代谢后能产生酸性残留物质。

（NH4）2SO4利用后，产生硫酸

生理碱性物质：代谢后能产生碱性残留物质。 硝酸钠利用后，产生氢氧化钠。

3、无机盐和微量元素

• 概念：组成生理活性物质或具有生理调节作用矿物质

• 作用方式：低浓度起促进作用，高浓度起抑制作用。 • 种类：盐离子

磷、硫、钾、钠、镁、钙，常常添加

铁、锌、铜、钼、钴、锰、氯，一般不加。

4、水

菌体细胞的主要成分。

营养传递的介质。 良好导体，调节细胞生长环境温度。 培养基的主要成分之一。

微生物发酵工艺的流程

微生物发酵工艺的流程

微生物发酵工艺的流程

微生物发酵工艺是一种利用微生物介导的发酵过程，将原料转化为有用产物的技术。它广泛应用于食品、饮料、药品、化妆品、生物燃料等产业。微生物发酵的流程可以概括为以下几个步骤：选择合适的微生物菌种、培养菌种、发酵培养基的制备、发酵过程中的控制和管理、及产物的提取与分离纯化。

首先，选择合适的微生物菌种是微生物发酵工艺的第一步。根据工艺的要求和产物的需要，选择具有理想发酵性能的菌种。常用的微生物菌种包括酵母、乳酸菌、醋酸菌、酱油菌等。菌种的选择主要考虑产物的特性、发酵条件、菌种的稳定性、耐受性以及生产的经济性等因素。

其次，培养菌种是发酵工艺的关键环节。通常使用液体或固体培养基来培养菌种。液体培养是最常见的方法，通过加入适量的营养物质（碳源、氮源、无机盐等）和调整好的pH值、温度和氧气条件等，促使微生物菌种生长繁殖。固体培养则涉及将营养物质包裹在固体载体中，例如琼脂、玉米粉等。培养时间因物种的不同而异，一般需要在合适的温度和条件下培养一定时间。

制备发酵培养基是微生物发酵的另一个重要步骤。发酵培养基中的成分主要包括碳源、氮源、无机盐、微量元素和调节剂等。对于不同的微生物菌种，营养需求略有不同。因此，根据具体的工艺要求，需要调节发酵培养基的成分，并且经过消毒，以避免污染物对发酵过程的干扰。

发酵过程的控制和管理是微生物发酵工艺中的核心环节。在发酵过程中，温度、pH值、氧气供应和搅拌等参数需要被精确控制。这些参数的控制对于发酵过程中微生物的生长、代谢和产物生成都至关重要。温度过高或者过低，pH值偏高或者偏低，氧气供应不足或者过多，都可能导致微生物生长受阻、代谢途径受限，从而影响产物的生成和产量的提高。此外，还需要注意发酵过程中的消毒工作，以防止细菌、真菌和病毒的污染。

最后，产物的提取与分离纯化是微生物发酵工艺的最后一步。发酵过程中合成的产物通常是复杂的混合物，需要经过提取和分离纯化才能得到所需的目标产物。常见的分离纯化方法包括离心、过滤、蒸馏、结晶、萃取、层析等。这些方法可以使产物与其他组分分离，达到纯化产物，使其达到工业生产所需的标准。

九、应用发酵微生物的历史

九、应用发酵微生物的历史

九、应用发酵微生物的历史

在人类的饮食生活中，有意识的引进和活用发酵生成物以及自然界的酶的最早的历史，也是构筑人类史上最为优秀，文明的古代的东方中心---美索不达米亚（Mesopotamia）的地方，在距今6000年前已经繁荣起来了，是当时的由苏美尔（Sumer）人构筑的文化，所谓苏美尔文化，在当时是已具有高度的水平了，以小麦为主食，从而形成了麦食文化，但从它的遗迹的发掘中可以清楚地发现那时已经酿制了麦酒，并有较为广泛的酿造遗迹。

麦子发芽的时候，在其胚芽部的组织中存在有糖化酶（Amylase），由于有了水分和适当的温度而活化起来，将淀粉质的胚乳部连续的分解变成水溶性糖分，从而成为胚芽部的生长点细胞分裂增殖的营养源，并提供了能源，从而开始发育起来。由于这个活性化了的糖化酶的糖化作用，生成了葡萄糖等糖分，并以此为培养基，用啤酒酵母接种，使之繁殖，便生产出高级麦酒。这样的方法，也就是现代啤酒的制造方法。可以说是苏美尔人酿造的。这就是为了健康而受到欢迎的古代麦酒，也是现代啤酒的生产原型。

将这麦酒用干溜法进行蒸馏所生产的就是现代欧洲人喜欢酿造的威士忌酒。

世界各地有着各种各样用酵母菌酿造酒的独特方法，酿造着各种各样的酒。但酵母菌不仅仅使用于酿造酒上，在麦食文化地带平常的小麦为原料做主食的。从美索不达米亚地方向东西扩展，到中国的西域新疆维吾尔地区。再发展到帕米尔高原，巴基斯坦、印度等广大的区域。都吃着用小麦粉做成抻得薄薄的一种为比萨的食物。这也是利用酵母使之发酵来加强营养而想出来的办法。

欧美地区的主食面包，可以推断也是在这个潮流中发展形成的食品。这是将酵母菌有意的放在小麦粉中，让它积极地繁殖，再利用由其生理反应所产生的碳酸气的发泡性，用慢火去烘烤就松暄地膨涨起来在而成的食品，由于酵母的繁殖增多了面包中的营养，并具有由酶的反应酿造出的糖分和氨基酸的独特风味，同时酵母菌还产生了大量的维生素B群，加上分泌的其它一些有用成分一起大大的提高了它的综合营养，可以认为这是较高水平的体现了一种生活的智慧。