cck8实验原理

CCK8的说明书大家一定要认真阅读，里面很多细节的问题都有提到。而且说明书里提供的一些关于各种细胞的种板数都很有参考价值，因为那是反复验证过的最佳数值。但无论如何，做这个试验一定要摸条件。你就算再懒，这个懒不得，否则你都只是在做无用功。以下言论全部以细胞毒性试验为前提，如果你做的是促进细胞生长的药物的药效实验那就另当别论了。

摸条件包括1、种板数；2、种板后细胞的贴壁生长时间；3、加药后的孵育时间；4、cck8试剂加入量；5、cck8试剂加入后细胞孵育时间。看起来很多，其实这就是一个实验。而且都是种的空白板，也就是不加药物，只加细胞和CCK8。

1、种板数：这个要查文献，看你所用细胞别人有无做过，把范围大致找出。记住还要参考说明书，这个很重要。然后稀释一系列浓度种板。首先你要观察多长时间细胞可贴壁完全，一般贴壁生长24小时。然后还有在你的实验时间内，不同细胞数下孔内生长情况。比如我拟定考察4天的时间，那么在4天内，细胞是刚好铺满还是堆积生长？因为每块板都会设置对照孔，也就是含有细胞的培养基+CCK8，这个数值是板上的最大数值，CCK8试验最佳OD值在1.0附近，所以这个最大数值最好能控制在1.0左右。我的实验经验是不要让细胞长满，一旦长满了很难去判断是否堆积生长了，对药物能否顺利进入细胞有影响此为其一，其二生长不均匀易导致孔间OD值数据偏差大，而且OD值也很大。

2、贴壁生长的时间我一般就直接让它贴壁长24h了，这个时间细胞已经贴壁完全，而且这样设置时间对自己安排实验时间也方便。没人愿意大半夜爬起来做实验吧。

3、加药后的孵育时间，我的实验摸了3个时间，24h，48h，72h。然后根据数据的稳定性（RSD）、OD值的范围（1.0左右）这些来选择最好的时间。太长了就没有必要了，细胞呆在孔里几天不换液结果可想而知了。

4、CCK8试剂加入量，说明书中明确写出建议加入量为培养基体积的10%。这里有一个问题：假设我要孔内是200微升的体系，即细胞悬液+药液+CCK8=200微升呢，还是细胞悬液+药液=200微升，cck8不算在体系内呢。关于这一点文献报道不一致。本人最终采用的是后者。

CCK8 实验

1、在 96 孔板中配置 100μ l 的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养

24小时（ 37℃， 5% CO2）。

2、向培养板加入 10μl 不同浓度的 待测物质 。

3、将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如： 6、 12、24 或 48 小时）。

4、向每孔加入 10μl CCK8 溶液 （注意不要在孔中生成气泡，它们 会影响

OD 值的读数）。

5、将培养板在培养箱内孵育 1-4 小时。

6、用酶标仪测定在 450nm 处的吸光度。

7、若暂时不测定 OD 值，可以向每孔中加入 10μl 0.1M 的 HCL 溶 液或者

1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。 24 小时内测定，吸光度不会发生变化。

PS：1% w/v SDS 溶液配制方法：

组份浓度： 10% （W/V）SDS 配制量： 100ml 配制方法：

1. 称量 10g高纯度的 SDS置于 100-200ml 烧杯中，加入约 80ml 的去 离子水， 68℃加入溶解

2. 滴加浓盐酸调节 pH值至 7.2

3. 将溶液定容至 100ml 后，室温保存。

注意：如果待测物质 有氧化性或还原性的话， 可在加 CCK8 之前更换 新鲜培养基（除去培养基， 并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的 培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更 换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 活力计算：

细胞活力 *（％）=[A（加药）-A（空白）]/[A（0 加药） -A（空白） ] ×

100

A （加药）：具有细胞、 CCK8 溶液和药物溶液的孔的吸光度

A（空白）：具有培养基和 CCK8 溶液而没有细胞的孔的吸光度

A（0加药）：具有细胞、 CCK8 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度 *细胞活力：细胞增殖活力或细胞毒性活力

CCK-8 可以用于 细胞增殖 和毒性分析 。其基本原理为 :该试剂中含有

细胞增殖-毒性实验步骤

1、细胞复苏、细胞传代、细胞计数、细胞增殖-毒性实验步骤：

实验准备：用75%酒精擦生物安全柜台面2遍，紫外线消毒30分钟（枪、枪头、

15ml及50ml离心管、剪刀、封口膜、记号笔、打火机、酒精灯、培养瓶），复

温实验所需试剂[细胞培养液（DMEM、1640）、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、胰酶（0.25%

Trypsin-EDTA）、胎牛血清（FBS）、双抗]，所有的试剂、仪器放入生物安全柜前

要用酒精喷洒消毒。显微镜下看细胞生长状态，有无污染。

1）从液氮中取出细胞株,37-40℃温水迅速复苏，常规培养于含10%FBS、80U/ml

青霉素及0.08mg/ml链霉素的培养基中，放入３７℃、５％ＣＯ２、饱和湿度

的培养箱中培养，每２天换液１次。

2）倒去培养瓶内的培养液；

3）加入PBS2ml洗涤培养瓶内细胞2次；

4）加入胰酶500ul/0.5ml2～10min（具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是

否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）；

5）加入含10%FBS的培养液1～1.5ml[培养液：胰酶=（2～3）:1]中和胰酶；

6）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜；

7）将单细胞悬液吸入10～15ml离心管中，低速离心800rpm3分钟，倒去上清

液；

8）加入含10%FBS细胞培养液1～2ml吹打悬浮细胞至单细胞悬液；

9）吸取20ul细胞悬液（10ul细胞悬液+10ul台盼兰液：给坏死细胞染色，判断

细胞活力）至细胞计数板，进行细胞计数；

CCK-8实验：

10）在96孔板中，给每孔加100μL（约10000个细胞）的细胞悬液，每组设５

个复孔，将培养板放在培养箱预培养24-72小时（37℃，5%CO2），使细胞贴壁；

11）向培养板中加入100ul含药物培养基

12）将培养板在培养箱干预24、48、72ｈ后，每孔加入20ulCCK-8液，在培养

箱继续培养0.5-２ｈ，酶标仪检测450nm处吸光值（A），计算抑制率

CCK8细胞增殖实验

1.首先保证细胞消化下来后吹打成单细胞悬液，然后计数准确，接受每个孔前都将细胞悬液充分混匀。接种完成后，整个96孔板按十字形来回充分晃动，保证细胞接种后在每个孔中都平均分布，否则测定OD值时重复孔会出现大幅度波动，影响结果。

2. 消化细胞前先用PBS或者生理盐水清洗细胞1-2遍，再加入胰酶，晃动培养瓶/皿使胰酶充分覆盖细胞，然后去除全部的胰酶，将细胞放入培养箱孵育3-5min。待细胞边缘收缩至单个细胞后加入培养液吹打即可，很好吹打成单细胞悬液的。

3. 我试着回答下你的问题，CCK-8读值我想是独立于你条件培养之外的，意思就是你按照你的实验设计完成压力培养，比如你要培养48小时，那么你就等48小时结束后再加入CCK-8，那么CCK-8培养就不需要在压力条件下了，普通条件下就可以，贴壁细胞是要1－4小时，在这个时间段内你选择你认为最好的时间点测量，CCK-8公司技术专员建议CCK-8加入后培养液变黄，颜色变的最深的时间测量！

我的做法是：加入CCK-8后1－4个小时内每隔半小时测下OD值，对比下不同时间的颜色，数值，大概估计下最佳时间点，再做的时候应该就方便了！