南开大学 基因操作原理 第五章

《基因操作原理》课程教学大纲课程编码：13019课程名称：基因操作原理课程英文名称：Princeples of Gene Manipulation先修课程：生物化学、遗传学、分子生物学等适用专业：生物技术生物科学总学时：56 讲课学时56 实验学时0 实习学时0总学分：3.5一、课程性质、地位和任务“基因操作原理”是伴随着生物学尤其是分子生物学的飞速发展而兴起的一门新学科。

重点介绍基因操作中的工具酶及其种类、活性和用途；质粒载体、λ噬菌体载体和表达载体等的基本构成、种类和用途；重组DNA导入细菌和真核细胞的方法；DNA、RNA和蛋白质的分离及检测技术；定点诱变技术； PCR技术原理及其应用；cDNA文库和基因组文库的构建；分子杂交原理和技术； DNA序列分析的原理，通过Internet进行序列分析处理以及数据的获取。

本门课程开设的指导思想在于使学生在掌握一般生物学以及分子生物学知识的基础上，掌握DNA重组，转移、表达和检测等技术的基本概念和基本原理，为日后从事基因工程和分子生物学研究打下技术操作方面的理论基础。

”分子克隆技术”是与本课程配套的实验课程。

二、课程基本要求能对以基因克隆和表达为主线的基因操作自行设计技术路线，要求学生随着科学研究和技术的发展，及时掌握新的知识和方法。

本课程涉及到生物学的一些重要课程，如：普通生物学、生物化学、微生物学、遗传学和分子生物学，因此要学生选修这些课程之后，再选修本课程。

如果能做到理论与实验并至，将能巩固所学知识。

重点要求学生掌握在核酸水平上进行研究的基本方法。

三、教学内容及安排绪论：基因操作的理论基础（2学时）本章重点与难点: 掌握与基因操作有关的基本概念0.1基因的概念0.1.1 什么是基因0.1.2基因与其产物的共线性及非共线性0.1.3 基因的重叠与可变性0.2基因的结构组成0.2.1启动子0.2.2 SD序列0.2.3 转录终止区0.2.4 其它0.3基因克隆的通用策略0.3.1 基本步骤0.3.2 亚克隆第1章基因操作工具酶 (10学时)本章重点与难点:要求掌握和了解限制酶与常用工具酶的种类\活性和用途, 让学生知道“基因操作原理”是靠什么“工具”来完成的。

第4章基因操作的主要技术原理基因操作的方法包括:大分子DNA的提取、DNA分子的切割和连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、DNA序列分析、基因的人工合成、基因定点突变、PCR扩增等。

DNA分子的切割和连接是基因操作的核心技术。

一、核酸的分离和纯化技术核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中它们都是以与蛋白质结合的状态存在。

DNA：真核生物染色体DNA——双链线性；真核生物的细胞器DNA——双链环状；原核生物的核区DNA、质粒——双链环状。

RNA：RNA分子在大多数生物体内均是单链线性分子。

一般生物体基因组DNA大小为107-8bp。

DNA提取的目的（1）可用PCR从基因组中扩增基因；（2）作RAPD分析，区别两种物种之间的亲缘关系；（3）作Southern分析，检测是否转入基因；探测同源的基因；（4）作酶切图谱，用于DNA测序。

（一）总DNA的提取DNA在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0。

14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。

总DNA：一般来说是指基因组DNA ，即细胞核内的染色体DNA分子。

核DNA分子呈极不对称的线性结构，一条染色体为一个DNA分子。

其长度与直径的比例极不对称性，使其对极械力十分敏感。

分离纯化中DNA分子的断裂是很难避免的。

尽可能保持DNA分子的完整性是DNA分离技术的关键。

（1）有效制备大分子DNA的方法主要考虑两个原则：①防止和抑制内源DNase对DNA的降解；DNase 以Mg2+、Mn2+为辅助因子，只要加入一定的螯合剂，如EDTA（乙二胺四乙酸钠）、柠檬酸便可。

②尽量减少对溶液中DNA的机械剪切力。

动作轻柔、减少涡旋、使用大口吸管。

（2）DNA提取的主要操作过程（3）DNA提取的主要问题及解决方法：①DNA沉淀呈棕色，很难酶切或扩增；多酚、单宁、色素等氧化所致。

1.试述交换值、连锁强度和基因间距离三者的关系答案要点：交换值与连锁强度成反比，与基因间的距离成正比。

即交换值越大，基因间的距离越大，连锁强度越小；反之，交换值越小，基因间的距离越小，连锁强度越大。

2.试述独立遗传与连锁遗传的表现特征及细胞学基础答案要点：独立遗传的表现特征：如两对分别具有完全显隐性关系的相对性状表现为独立遗传且没有相互作用时，具有相对性状差异的纯合亲本杂交产生表现亲本显性性状的F1代，F1自交产生四种表现类型F2代，亲本型：重组型：重组型：亲本型＝9:3:3:1。

如果n对独立基因，则F2表型比例为(3/4+1/4)3展开式的各项系数。

独立遗传的西剥削基础是控制两对或n对性状的等位基因分别位于不同的染色体上，在减数分裂形成配子时，每对等位基因均等分离，不同对的等位基因间自由组合。

连锁遗传的表现特征：如果两对相对性状表现为不完全连锁遗传，那么将这两对具有相对性状差异的纯合亲本进行杂交，其F1代表现其亲本的显性性状，F1自交F2具有四种表现型：亲本型、重组型、重组型和亲本型，但其比例不符合9:3:3:1，亲本组合的实际数多于该比例的理论数，重组型的实际数则少于理论数。

连锁遗传的细胞学基础是控制两对相对性状的基因位于同一同源染色体上形成两个非等位基因，在减数分裂形成配子的过程中，非姐妹染色单体间可发生交换而引起非等位基因间的重组，从而打破原有的连锁关系而产生新的重组类型。

3.大麦中，带壳（N）对裸粒（n）、散穗（L）对密穗（l）为显性。

现以带壳、散穗与裸粒、密穗的纯种杂交，F1表现如何？让F1与双隐性纯合体侧交，其后代为：带壳、散穗201株，裸粒、散穗18株，带壳、密穗20株，裸粒、密穗203株。

试问，这两对基因是否连锁？交换值是多少？要使F2出现纯合的裸粒散穗20株，至少要种多少株？答案要点：F1表型为带壳散穗，基因型为NnLl。

F1与双隐性纯合体测交后代大大偏离1:1:1:1的比例，说明N和L两基因连锁，交换值为（18+20）/（18+20+201+203）= 8.6%。

简答题:1.puc19蓝白筛的原理2.简述pcr的原理和标准热循环3.给定真核质粒(1)确定是真核表达载体还是原核表达载体(2)是否需要对准读码框(3)载体上的f1 ori，pUC ori，Sv40 ori 的作用分别是什么实验设计题A蛋白在正常293T细胞中不表达，但在干扰素的作用下能让293T细胞大量表达A蛋白。

A 蛋白基因序列已知，但不能直接合成。

构建原核表达载体（带有His tag和T7promotor）使A蛋白在大肠杆菌中进行表达，同时获得A蛋白。

现代生物技术发展对微生物发酵工程的影响答:1、阐述一下现代生物技术都有哪些？现代生物技术有基因工程，细胞工程，合成生物学，生物信息学，基因组学、蛋白质组学、蛋白质工程等。

2、突出重点强调：其中基因工程和细胞工程是生物技术的主导领域和热点领域，常常是发酵工程和酶工程的基础。

3、重点强调的优点：传统的发酵工程利用天然微生物进行发酵生产初级代谢产物和次级代谢产物，由于生物技术的出现和日益革新，发酵工程所涉及的范围得到扩大，生产技术得到改造，因而发酵生产能力和控制水平大为提高。

基因工程技术已趋于成熟，所得工程菌已得到应用，并已开发不少产品投入市场，如胰岛素、干扰素等。

在氨基酸工程菌组建上也获得成功。

酶工程的固定化细胞发酵的优点在于简化生产工序、降低成本、节约原材料和能源、提高产量和收率以及改善环境污染的能力，在各领域中得到广泛应用。

4、其他新兴学科在这些技术中的辅助和应用：合成生物学的开创和发展，为微生物发酵工程中菌种的选育、构建提供了基础。

这一新兴学科主要建立在将有功能活性的生物功能性小部件拼凑在一起发挥功能利益最大化。

这在微生物发酵过程中的菌种培育和筛选阶段起到了极其巨大的作用。

虽然现在这一技术还未被广泛应用到实际工业生产中，但其潜在的商业价值可见一斑。

生物信息学是21世纪的新兴学科。

它是研究神武信息的采集、处理、存储、传播和分析等各方面学科。

随着生命科学和计算机科学的迅猛发展，两者的结合将揭示大量而复杂的生物数据所赋予的生物学奥秘。

基因操作的原理和过程基因操作（Genetic engineering）是一种利用基因技术对生物体的遗传物质进行修改和重组的技术手段。

通过基因操作，可以对生物的基因进行剪接、修饰或移除，并向生物中引入新的基因或基因片段，从而改变生物的遗传特征和表现形式。

基因操作在农业、医学、生物工程等领域都有广泛的应用，它不仅可以提高生物的抗病性、耐性和产量，还可以用于研究基因的功能和调控机制。

基因操作的原理是基于对生物体的基因组进行修改和优化，具体分为以下几个步骤：1. 选择目标基因：首先需要确定要操作的基因，可以是现有生物体中的某个基因，也可以是外源基因。

有时也会选择修改某个特定区域的基因片段。

2. 基因克隆和构建载体：利用分子生物学技术，将目标基因从生物体中分离提取。

然后，将目标基因插入到载体DNA中，构建成重组载体。

常用的载体包括质粒和病毒。

3. 转化目标细胞：将构建好的重组载体导入到目标细胞中。

可以通过多种途径实现细胞的转化，如化学转化、电转化、冷冻复苏等。

4. 基因表达和筛选：在转化成功后，目标基因会在细胞内进行表达，从而改变生物的遗传特征和表现形式。

为了筛选出表达目标基因的细胞，可以在重组载体中引入选择标记基因，如抗生素抗性基因。

5. 验证和分析：在筛选出表达目标基因的细胞后，需要对其进行验证和分析。

可以通过PCR、酶切、同源重组等技术手段来验证基因操作的结果，并进一步分析基因的功能。

基因操作的过程中有一些关键技术和工具，如PCR技术、限制性内切酶、连接酶、DNA测序等。

这些技术和工具的应用使得基因操作的过程更加高效、准确。

基因操作的应用领域广泛，涉及农业、医学、生物工程等多个领域。

在农业领域，基因操作可以用于改良农作物的品质和产量，提高抗病虫害的能力，延长保存期限等。

比如，通过引入抗病虫害基因，使植物对害虫和病毒的侵害产生免疫反应。

在医学领域，基因操作可以用于治疗遗传性疾病、癌症等疾病。

比如，通过修正患者的遗传突变，可以恢复正常的基因功能。

大肠杆菌受体优点：1、易转化；2、可使用多种易操作的载体，宿主范围较大缺点：1、缺少辅助功能的生化途径，这些有利于表型功能的研究，如芳香族的降解、抗生素的合成、致病性、孢子形成等在新宿主中克隆有3个先决条件：1、具有将目的基因导入受体的方法：转化、接合、电穿孔；2、目的基因在受体菌中能稳定存在：以复制子的形式或整合到基因组中、前质粒中；3、目的基因在表达时能被检测到目的基因的导入其他菌的转化特点：1、自然发生，转化能力是一个短暂现象2、在一些菌中，转化是独立序列进行的3、自然转化机制涉及到DNA双螺旋的断裂，并降解其中一条单链，使得另外一条能够进入宿主方法：感受态细胞的转化、原生质体的转化、电穿孔、质粒援救转化目的基因的稳定重组DNA分子通常以CCC的形式存在于质粒中，而后者主要取决于质粒的宿主范围（编码复制过程的蛋白质的数量），如S.aureus 的质粒和RSF1010均可在G+或G-中复制为了扩大宿主范围，通用方法为形成杂交质粒。

如大肠的pBR322和S.aureus或B.subtilis 的pC194、pUB110的混合穿梭质粒。

它的特点，人工构建、两种不同复制起点和选择标记，能在两种类群宿主中存在并复制。

它的优点是大肠能够成为克隆的中间宿主重组DNA的综合重组质粒进入宿主细胞后，通常会有以下结果：1）以稳定的质粒形式存在2）丢失3）通常整合到基因组中4）同源重组：代替经常是双链交换例子：构建了一个集合质粒：neomycin抗性基因和B.subtilis的amyE基因插入到pBR322中，将这个质粒转入B.subtilis，该质粒不能复制，但如果筛选为抗性而做，那么质粒的集合就在amyE处进行。

这一方法可用于构建单拷贝的外源基因的重组子。

G-中的clone经常以大肠作为中间体，因此所需质粒必须能。

分子生物学第五章作业1、哪些重要的科学发现和实验推动了DNA重组技术的产生及发展？答：近半个世纪来，分子生物学主要取得了三大成就：第一，20世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。

但事实上，DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。

其中，限制性内切核酸酶和DNA连接酶等工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。

DNA重组技术的产生及发展过程中比较重要的科学发现和实验如下：1957年A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。

1965年S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由"质粒"DNA所决定。

1967年年世界上有五个实验室几乎同时宣布发现了DNA连接酶。

1970 年H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。

H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。

1972-1973 年H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。

1978 年首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。

1981 年R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。

1982 年美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。

基因操作原理知识点总结基因操作是一种在生物体内对基因进行修改或操作的技术，它的出现为生物学、医学和农业等领域带来了革命性的变革。

通过基因操作技术，科学家们可以改变生物体的一些性状，使得其具有更好的抗病性、生长速度、产量等特性，从而为人类生活和生产带来了巨大的便利和利益。

在这篇文章中，我将从基因操作的原理、技术、应用和风险等方面进行详细的介绍和讨论。

基因操作的原则基因操作的基本原理是对生物体的基因进行修改或操作，使得其具有某些特定的性状。

这是通过DNA重组技术来实现的，DNA重组技术是一种利用酶的作用或化学方法，将DNA片段进行切割、粘接、合成等操作，从而实现对基因的改变或移植。

利用这一技术，科学家们可以将某种物种的基因转移到另一种物种中，或者通过改变某个基因的表达方式来使得生物体产生一些新的性状。

基因操作的技术基因操作技术主要包括DNA重组技术、基因克隆技术、基因敲除技术、基因编辑技术等。

其中，DNA重组技术是最基本的技术，它通过切割、粘接、重组DNA片段来改变基因的结构和表达方式；基因克隆技术是一种通过细胞培养和分裂来复制基因的方法，可以用于大规模生产具有某些特定性状的生物体；基因敲除技术是一种通过干扰某个基因的表达来观察该基因在生物体中的功能和作用；基因编辑技术是一种通过精确的操纵基因序列来实现对基因的改变和操作。

基因操作的应用基因操作技术在农业、医学、生物工程等领域都有着广泛的应用。

在农业领域，基因操作技术可以用来改良作物的产量、抗病性、品质等性状，从而为农业生产提供更多的选择和可能；在医学领域，基因操作技术可以用来治疗或预防一些遗传疾病，为人类健康带来更多的希望和机会；在生物工程领域，基因操作技术可以用来生产某些特定的物质或药物，从而为生产和生活提供更多的可能性。

基因操作的风险尽管基因操作技术为人类带来了巨大的利益和希望，但是它可能也会带来一些潜在的风险和问题。

其中，最主要的风险包括对环境的影响和对人类健康的影响。

生物化学相关的和DNA结构功能相关的不是重点，即前两章。

基因诊断，基因操作，经典遗传学试验，诱变，重组比较重要，即后几章。

最后几节课一定要好好听，不停很吃亏的：）答疑一定尽量去，应该会有收获的。

讲义上打星号的一定一定重点掌握，十之八九是考试内容。

题型：名词解释（3*10）问答（70）* 黄曲霉毒素,EMS 作用原理,以及它是否能诱导琥珀密码子无意突变回复为野生型? *ddNTP法测序的原理，步骤，以及如何排序*LAC 操纵子的IPOAYA几个基因表达的调控*顺式显性*缺失突变作图，以及重组子顺反子相关概念综合运用*southern杂交，限制性内切酶相关的基因诊断*CDNA文库的构建*作为载体应该具有哪些特性*启动子-10，-35RNA聚合酶识别和结合起始转录位点*重组修复*人dgal*IS因子*断裂基因*转换和颠换概念一定掌握*极性突变*多顺反子MRNA*摆动学说（一个氨基酸有多个对应密码子的原因名词解释：阻断交配重复基因点突变一般性转导外显率缺失环交叉遗传超倍体单体诱变剂问答：F因子的特点。

举两个例子说明基因间交互作用。

染色体的结构变异有几种类型，并分别简要说明。

绘图：人14号染色体和21号染色体发生易位后，在减数分裂配对时的形态，有哪些分离方式形成哪些配子？计算：1.有序四分子分析2.三点测交分析名解IS 转录因子 PRIBNOW BOX 多复制子多顺反子MRNA 共转染重组修复问答羟胺引起的突变及能否将三种无意突变回复载体的条件及用lacz插入判断重组子质粒画图限制酶切测定插入的质粒和另一种方法乳糖操纵子那个经典的判断能否产生LAC酶用PCR 的方法测镰刀贫血画图重叠基因及SANGER 法rii突变体互补测定缺失一种基因一种酶的学说的那个判断反应顺序及缺失体调控DNA复制中的酶和蛋白增强子和转座子的区别选择：常染色体显性遗传；隐性遗传；21三体综合症；细胞质遗传；孟德尔的贡献；名解：显性性状；半显性；母系遗传；上位性；互补基因；连锁群；先证者；双三体；拟显性；制图函数问答：发表对“进化的本质是遗传和变异”的看法；设计实验验证基因的显隐性关系；重组后基因型比率的计算；后代基因型比率的计算；三点测交；育种设计；。