套峰
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套峰
套峰：即主峰下面套有低于或与主峰高度一致的干扰峰，如果干扰峰信号较强，则会影响主峰的正确读值。
引起套峰的原因包括以下一种或多种原因的组合：
1. 测序模板非单一：
a. PCR产物不纯：
PCR模板中含有点突变，如下图：
峰图说明：峰图其他位点碱基峰形独立且单一，只有个别位点有两个信号峰套在一起，如箭头所示。
常见原因为PCR的模板DNA中含有突变或者SNP多态性的等位基因。
序列插入缺失突变，如下图：
峰图说明：起始峰图正常，但从某一位置开始出现套峰，套峰序列与主峰序列基本相同，但出现碱基的移位；常见原因为PCR的模板DNA中含有插入后者缺失突变的等位基因。
PCR扩增非特异，PCR产物不纯，如下图：
峰图说明：起始峰图即为套峰，可以看到多个测序终止峰型，如箭头所示。
b.质粒不纯或者非单一克隆：质粒包含非单一克隆质粒，如下图：
峰图说明：峰图起始正常，但随后出现套峰，套峰较高时无法辨认主峰。
2. 测序引物不纯或者污染：
可能来自于引物降解，如下图：
峰图说明：底峰读值与下一个或上一个主峰一致，常见原因为测序引物的降解，部分引物分子丢失了3’端核苷酸。
PCR产物中含有引物二聚体，如下图：
峰图说明：起始峰图即为套峰或者底峰，一般至150bp以内会有明显“A尾”终止峰形（如箭头所示），随后峰图正常。
这是由于PCR产物中的引物二聚体未被去除，与测序引物结合产生信号所至。
PCR引物残留，如下图：
峰图说明：峰图从起始到结束均有套峰。
形成原因为PCR引物未被去除，在测序反应中被作为测序引物与模板结合并延伸。
引物与模板结合非单一：在测序反应的退火温度与模板和测序引物的比例条件下，引物与模板有多个结合位点。
峰图说明：峰图从起始到结束均有套（底）峰。
解决套峰的方法：
1.针对测序模板不纯和非单一克隆，解决的方式为尽量得到单一的纯化的测序模板：
a)针对PCR产物：
1)优化PCR条件或者重新设计PCR引物，提高引物扩增的特异性；
2)如果PCR产物条带不单一，可采用切胶回收的方式纯化后测序；
3)如果PCR产物条带单一，但测序结果仍有套峰，可将PCR产物克隆后测序；
4)存在等位基因多态性的模板的扩增产物，如果套峰影响碱基序列读取，也可以考虑将PCR产
物克隆后选取多个克隆分别测序；
5)设计序列特异性的测序引物，以期得到特异性的测序结果。
b)针对质粒和菌液的非单一克隆：重新转化或者涂板，培养后挑选单一克隆测序。
2.针对引物不纯或者污染：
a)如果引物降解或被其他引物污染，则需要重新合成引物；
b)如果为PCR模板中引物残留，则需要纯化测序模板。
3.测序引物与模板结合问题：
a)调整模板和测序引物的比例后重新测序；
b)重新设计特异性较高的测序引物。
