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细胞受到氧化应激后损伤的检测方法杨丽娟;游育红【摘要】正常生理状态下,机体活性氧的产生与消除处于一个动态平衡中.而在某些病理生理状态下,细胞内的自由基产物超出其自身的抗氧化能力时,便会产生氧化应激.活性氧基团引起的氧化损伤在许多慢性疾病中起着重要作用,如糖尿病、动脉粥样硬化等.近年来,一些动物、细胞实验及临床试验对细胞氧化损伤的方法展开了研究.对目前国内外常用的检测细胞氧化损伤的方法予以综述,以期为检测细胞氧化受损提供更好的参考.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2010(016)006【总页数】4页(P924-927)【关键词】细胞损伤;活性氧;氧化应激;检测【作者】杨丽娟;游育红【作者单位】福建医科大学药学院药理系,福州,350004;福建医科大学药学院药理系,福州,350004【正文语种】中文【中图分类】R392氧化应激是机体或细胞内以氧自由基为代表的氧化性物质的产生与消除失衡,或外源性氧化物质的过量摄入,导致氧化性物质在细胞内蓄积而引发氧化反应的状态[1]。
血管内皮细胞正常生理活动过程都有氧化性物质参与,主要为氧自由基,统称为活性氧(reactive oxygen species,ROS)。
ROS是需氧生物在自身的新陈代谢过程中,由于受到内外环境的刺激而在其机体内持续产生的活性产物。
ROS因含有未成对电子,所以极不稳定,容易与其邻近分子反应,并可诱发产生新的自由基。
一般情况下可以参与机体的物质代谢和信号转导,对细胞的正常代谢起着重要作用。
它的产生会受到体内抗氧化防御系统的调节,从而保持在平衡的健康状态。
当其产生过量或机体清除能力下降时,则对组织细胞产生不可逆损伤,氧化应激即发生,造成蛋白质损伤、脂质过氧化、DNA改变、酶失活等,发生包括癌症、心血管疾病、风湿性关节炎、感染等多种疾患[2]。
1.1 电子自旋共振法电子顺磁共振又称电子自旋共振(electron spin resonance,ESR),是研究含有未成对电子的物质和材料(包括自由基)的得力工具。
成熟红细胞的衰老凋亡机制成熟红细胞的寿命只有大约120天，随着时间的推移，它们会逐渐衰老，最终凋亡。
这个过程是由多个生物化学机制组成的。
一、细胞膜的变化成熟的红细胞细胞膜主要由磷脂分子组成。
衰老过程中，细胞膜的含水量减少，膜脂质排布不规则。
细胞膜磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇含量减少，而磷脂酰肌酸和磷脂酰甘油等含量增加。
这些变化使细胞膜的弹性和稳定性下降，细胞膜的生理活性也会降低。
二、氧化损伤红细胞处于氧气环境下，在此过程中极易受到氧化损伤。
在衰老过程中，红细胞LCAT （酯化酶）活性下降，细胞膜上的抗氧化酶GPx（谷胱甘肽过氧化物酶）和CAT（过氧化氢酶）活性也减弱，这些酶正常情况下可以清除细胞内部的氧自由基，但是随着红细胞的衰老和死亡，氧自由基的数量逐渐增加，导致红细胞内部的氧化状态加剧，最终造成细胞膜的损伤。
三、细胞膜蛋白的磷酸化红细胞衰老过程中，细胞膜磷酸化状态的改变也是一个重要的标志。
磷酸化可以使蛋白质分子结构发生变化，影响它们的功能。
一些研究表明，在细胞膜磷酸化状态改变的同时，细胞膜上一些蛋白质的构象也发生了变化。
这可能导致细胞膜蛋白从原来的造血细胞系列转化为破坏或凋亡细胞系列的标志性蛋白质。
四、微管和微丝的改变红细胞的外部骨架主要由微丝和微管组成。
这些蛋白质质地柔软，可以使细胞形态保持在一个固定的形状。
随着红细胞的衰老，微管和微丝的蛋白骨架内的蛋白质质量也随之降低，并且逐渐发生断裂。
这导致细胞形态的变扁和畸变，进而引起细胞膜和内部结构的变化和损坏。
五、细胞色素的氧化血红蛋白是一种重要的细胞色素，可以使红细胞以高效能的方式运输氧气到全身组织。
然而，衰老红细胞中的血红蛋白会逐渐发生氧化改变，形成自由基，使血红蛋白失去了它的真正功能。
氧化血红蛋白可以在细胞膜上形成氧化产物，进一步导致膜破坏和氧自由基形成，最终加速红细胞的衰老和凋亡。
综上所述，成熟红细胞的衰老凋亡是由多个生物化学机制共同作用引起的。
钙网蛋白免疫调节的分子机制研究吴薇;刘朝奇【摘要】钙网蛋白(Calreticulin,CRT)是46 kD大小的Ca2+结合内质网常驻蛋白,具有调节细胞内钙浓度、增强抗原递呈及抑制血管生成等多种生物学功能.从机体凋亡细胞的清除、抗原提呈、信号转导及与体液免疫多方面阐述近来钙网蛋白在机体免疫调节分子机制的最新进展,以期为钙网蛋白的致病机制及免疫干预奠定理论和试验基础.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2013(000)003【总页数】4页(P44-47)【关键词】钙网蛋白;免疫调节;分子机制;抗原提呈【作者】吴薇;刘朝奇【作者单位】三峡大学分子研究所,宜昌443002【正文语种】中文钙网蛋白（Calreticulin，CRT）是一种在结构和功能上高度保守的钙结合蛋白，主要存在于内质网（endoplasmic reticulum，ER）［1] 。
大量研究发现，钙网蛋白具有多种功能，参与抗原提呈、分子伴侣、抑制血管生成及细胞黏附等生物学作用。
因此，与多种疾病的发生发展有一定的相关性。
但钙网蛋白免疫调节作用分子机制的研究甚少，因此本研究从钙网蛋白在免疫调节增强及免疫逃避方面对其分子机制进行综述，并期望能为这一领域的科研工作者提供一些参考。
1 CRT的免疫增强活性1.1 CRT与吞噬作用机体对凋亡细胞的清除是正常的基本的生理功能，这个过程对于维持机体的内环境稳定具有重要意义。
目前，比较明确的凋亡细胞膜上的受体识别配体是磷脂酰丝氨酸（phosPhatidylserine，PS），PS的外翻表明细胞凋亡的发生。
近几年的研究发现，CRT也参与巨噬细胞对凋亡细胞的清除过程［2] ，CRT与人精子蛋白（ERP57）共转位至膜表面会引起免疫原性的细胞死亡［3] ，主要是通过囊泡相关膜蛋白（SNARE）依赖的胞吐作用转位至膜表面，这个过程可能与囊泡相关的SNARE蛋白（如囊泡相关膜蛋白1）和膜相关SNARE蛋白（如突触小体相关蛋白23/25）的相关［4] 。
流式细胞仪检测细胞凋亡方法（AnnexinV法）实验概要Annexin V是一种检测细胞凋亡的试剂，本实验介绍了一个用流式细胞仪检测细胞凋亡的方法(Annexin V 法)。
实验原理Annexin V是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。
它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。
在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。
Annexin V与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。
由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA碎片检测比较，使用Annexin V可以更早地检测到凋亡细胞。
因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V /核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V /核酸染料 )。
主要试剂1. PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8°C保存。
2. Annexin V Binding Buffer缓冲液(Cat. No. 66121E)：浓度为10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。
3. Annexin V试剂与核酸染料：Annexin V 核酸染料Annexin V-Biotin(Cat. No. 65872X) PI(Cat. No. 66211E)或Streptavidin-FITC(Cat. No. 13024D) 7-AAD(Cat. No. 34321X)Annexin V-FITC(Cat. No. 65874X) PI(Cat. No. 66211E) Annexin V-PE(Cat. No. 65875X) 7-AAD(Cat. No. 34321X)1. 一次性12×75mm Falcon试管。
一、实验目的本实验旨在通过观察细胞凋亡的形态学特征和检测凋亡相关蛋白表达，了解细胞凋亡的发生机制，为细胞凋亡相关疾病的研究提供理论依据。
二、实验材料1. 细胞：人肝癌细胞株HepG2，人正常肝细胞株LO2。
2. 试剂：Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，Caspase-3活性检测试剂盒，DNA ladder检测试剂盒，荧光显微镜，流式细胞仪等。
3. 仪器：CO2培养箱，细胞培养瓶，移液器，离心机，荧光显微镜，流式细胞仪等。
三、实验方法1. 细胞培养：将HepG2和LO2细胞分别接种于培养瓶中，置于CO2培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期时进行实验。
2. 细胞凋亡检测：（1）Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测：将细胞悬液离心后弃去上清，加入Annexin V-FITC/PI染液，室温避光孵育15分钟，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
（2）Caspase-3活性检测：按照试剂盒说明书操作，检测细胞中Caspase-3活性。
（3）DNA ladder检测：按照试剂盒说明书操作，进行琼脂糖凝胶电泳，观察DNA ladder现象。
3. 数据分析：采用SPSS软件进行统计学分析，比较两组细胞凋亡率、Caspase-3活性和DNA ladder的差异。
四、实验结果1. Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测：HepG2细胞凋亡率为（30.2±2.5）%，LO2细胞凋亡率为（2.1±1.2）%，两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。
2. Caspase-3活性检测：HepG2细胞Caspase-3活性为（2.58±0.21）U/mg，LO2细胞Caspase-3活性为（0.83±0.14）U/mg，两组间差异具有统计学意义（P<0.05）。
3. DNA ladder检测：HepG2细胞出现明显的DNA ladder现象，LO2细胞无DNA ladder现象。
安徽省皖中名校2022-2023学年高一下学期期中联考生物试卷学校：___________姓名：___________班级：___________考号：___________一、单选题1、酶指的是一类由活细胞产生的、对其底物具有高度特异性和高度催化效能的有机物。
下列相关叙述正确的是( )A.各种酶都能与双缩脲试剂发生紫色反应B.低温会破坏酶的空间结构，使其变性失活C.人的成熟红细胞内有多种酶，但不能更新D.一种酶只能催化一种底物发生化学反应2、如图表示环化一磷酸腺苷（cAMP)的结构式，该物质是由ATP脱去两个磷酸基团后环化而成的一种细胞内信号分子。
ATP的结构简式为A-P～P～P，其中“~”代表一种特殊的化学键。
下列叙述错误的是( )A.cAMP解环化后，可得到腺嘌呤核糖核苷酸B.cAMP和ATP中分别有1个和2个特殊的化学键C.ATP在形成cAMP的过程中，初期会释放能量D.cAMP与磷脂所含的元素都是C、H、O、N和P3、如图表示酵母菌细胞内发生的部分生化反应。
下列叙述错误的是( )A.图中①过程涉及的酶在细胞质基质中B.图中③过程需要氧气的参与C.图中②过程没有腺苷三磷酸的形成D.图中③过程均发生于线粒体内膜上4、某生物兴趣小组利用葡萄糖溶液培养酵母菌并探究其无氧呼吸的类型(如图)。
下列叙述错误的是( )A.葡萄糖溶液的浓度是该实验的无关变量B.甲瓶与乙瓶连接前，需静置一段适宜时间C.若乙瓶内呈现出黄色，则说明甲瓶中有CO2产生D.甲瓶与乙瓶连接前，酵母菌的呼吸产物中无水5、在室温25℃，不同光照强度下，某植物吸收CO2速率的变化曲线如图所示。
据图分析，甲~丁4个点对应的光照强度中，该植物叶肉细胞的光合速率大于呼吸速率的有( )A.一点B.两点C.三点D.四点6、如图表示某植物细胞的有丝分裂过程中染色体和核DNA的数量变化曲线图。
据图分析，下列有关该植物细胞的有丝分裂过程的叙述，错误的是( )A.图中a点和b点，细胞内核DNA数是相同的B.图中d点，细胞内正在进行DNA分子的复制C.图中b点和e点，细胞内染色体数目均为4nD.图中f点，细胞赤道板处的细胞板正逐渐扩大7、如图表示人的骨髓造血干细胞通过增殖和分化，形成多种细胞的示意图。
细胞凋亡磷脂酰丝氨酸外翻分析关键词：磷脂酰丝氨酸磷脂化合物磷酸试剂细胞标准物质北京标准物质网磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)又称丝氢酸磷脂，二酰甘油酰磷酸丝氨酸，是一类普遍存在的磷脂，磷脂化合物中的磷酸甘油酯类，是细胞膜组分之一，与一系列的膜功能有关。
在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）是一种分子量为35～36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与PS有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。
因此Annexin-V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。
将Annexin-V进行荧光素(FITC、PE)或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。
因此将Annexin-V与PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。
细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。
因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。
正常活细胞与此相似。
在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(FITC-／PI-)；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为(FITC+／PH+)：而右下象限为凋亡细胞，显现(FITC+／PI-)。
Annexin-V可作为FACS(流式细胞分选)方法筛选凋亡细胞的基础。
由于融合蛋白Annexin-V-EGFP，EGFP与PS的结合比例为1：1，还可进行定量检测。
除此之外，还提供生物素偶联的Annexin V，可通过常用的酶联显色反应来检测。
食品研究与开发２００６．Ｖｏｌ．２７．ＮＯ．９然而人的胎盘来源短缺，满足不了医药、食品等多方面的需求。
因此充分利用牛胎盘、猪胎盘、羊胎盘等丰富的动物胎盘，做好动物胎盘与人胎盘在形态、成分、功能、检测、鉴别等方面的研究工作，就能使数量大、成本低、供货时间长的动物胎盘具有极大的开发利用价值，为胎盘类产品的开发提供坚实的物质基础［７￣８］。
由于胎盘蕴藏着巨大的市场价值，借助于先进的科学技术将哺乳类动物胎盘加工成附加值和效用更高的产品成为发展的趋势。
以药剂、食品、化妆品等多种形式出现的胎盘类产品将为人类的生活做出巨大的贡献。
参考文献：［１］孙刚．《胎盘内分泌的基础与临床》［Ｍ］．第二军医大学出版社．２００１．［２］朱梅，许梓荣．牛胎盘催乳素（ｂＰＬ）的研究进展［Ｊ］．饲料研究，２０００，１０：１９￣２２．［３］陈晓萍．酶水解法加工牛胎盘的工艺研究［Ｊ］．科技通报，２００１，１７（６）：６７￣７０．［４］苏晔，魏泓．胎盘免疫调节因子的生物功能及临床应用进展［Ｊ］．免疫学杂志，２００２，１８（３）：１１７￣１１９．［５］黄楚华，殷学伦．胎盘肽制剂的理化性质及免疫活性研究［Ｊ］．药物生物技术，１９９５，２（２）：４０￣４２［６］程雅琴，杨鹏云．人胎盘组织液ＨＰＬＣ指纹图分析［Ｊ］．中国生物制品学杂志，２００１，１４（４）：２３８￣２４０．［７］张丽君，乔传卓，余慕婉．紫河车和几种动物胎盘及其加工品的放射免疫分析评价［Ｊ］．中药材，１９９５，１８（１２）：６２２￣６２４．［８］吴凌，李金香，王国良，等．人和动物胎盘药理作用和临床应用的研究进展［Ｊ］．黑龙江八一农垦大学学报，２００１，１３（２）：６８￣７１．收稿日期：２００６－０７－２４冯雷刚，周红梅，胡光祥，高昱颖，王朋书（天津尖峰天然产物研究开发有限公司，天津３００４５７）磷脂酰丝氨酸的应用研究摘要：综述了磷脂酰丝氨酸（ＰＳ）近２０年来国内外的动物试验及临床应用，表明ＰＳ对改善记忆和认知能力、防治老年痴呆症、抑郁症及缓解精神压力都有显著疗效，是一种极具开发潜力的功能性保健原料，特别是大脑机能的提高方面。
