基因工程技术研究进展57页PPT

酶连接起来→得到新的DNA分子。
1971年
1973年 科恩（Cohen S.）等进一步
将酶切DNA分子与质粒DNA
连接起来，并将重组质粒转
入E. cloi细胞中。
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1982年，美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在
细菌中生产人的胰岛素投放市场。
1985年，转基因植物获得成功。
1986年，Mullis发明了PCR技术，专利转让达3亿美元，并
植物细胞→使质粒部分DNA包括目的基因，整合到植物
染色体，实现→遗传转化。
利用抗草甘磷(glyphosate) E. coli中分离克隆的
EPSP合成酶基因，已培育出高抗除草剂转基因植物。
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农杆菌转化烟草过程：
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2. 基因枪转化技术
以高压气体为动力，高速发射包裹有重组DNA
茄、烟草、南瓜和木瓜等50多种转基因作物已培育成功。
主要分布在美国（3570万hm2）、阿
根廷（1180万hm2）、加拿大（320
万hm2）和中国（150万hm2）等国。
自交系LAX9
高赖氨酸转基因玉米
蛋白质含量 15.1%，赖氨酸含量 0.42%
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2001年全世界转基因作物占相应作物种植总面积的比较
筛选培养基
1-2月
炼苗
1周
移栽至大田
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生根培养基
分化培养基
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3. 受精卵细胞注射法
用于动物转基因:
目的基因+ 载体
→
重组DNA → 微量注射法
将重组DNA导入受体合子
细胞核→遗传转化。

PPT课件
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典型例子：抗烟草花叶病毒的转基因烟草、 抗病毒的转基因小麦、甜椒
PPT课件
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转黄瓜抗青枯病基因的甜椒
3.抗逆转基因植物
PPT课件
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4.利用转基因改良植物的品质
PPT课件
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富含赖氨酸的转基因玉米
基转 因入 的荧 发光 荧素 光酶 烟蛋 草白
PPT课件 不会引起过敏的转基因大4豆0
原 理： 基因重组
表达水平： DNA分子水平
过程：
意义： 1、定向改造某些性状
2、克服远缘杂交
PPT课件
3
原核细胞的基因结构
非编码区 编码区上游 启动子
编码区
非编码区 编码区下游
终止子
RNA聚合酶结合位点
启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能起 始mRNA合成的序列。没有启动子，基因就不能转录。
将目的基因导入 农杆菌介导的遗传转化法
植物细胞
基因枪法
方法
将目的基因导入 动物细胞
——显微注射法
将目的基因导入——感受态细胞吸收DNA分子
微生物细胞
(氯化钙法)
PPT课件
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(四)目的基因的检测与鉴定 ——检查是否成功 ①形态检测
检测— ②分子检测
PPT课件
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非目的基因片段 GACATAGCTACA CTGTATCGATGT
PPT课件
1
我们主要讨论4个问题：
1. 什么是基因工程——基因工程的概念。
2. 为什么能进行基因工程——基因工程的原理和技术。 3. 怎样进行基因工程——4大步骤 4. 基因工程的应用和前景
PPT课件
2
1、概念：又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。

3. Ampr Tets （转化、重20组21均成功 ）
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（2）插入表达（insertional expression) 载体设计时，在筛选标志基因前连接一段负
调控序列（抑制作用），当目的基因在此插入 时 ，使其对下游的抑制作用丧失 ，从而下游 的筛选标志得到表达。
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CI为负控制序列（抑制Ter表达）
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五、重组体筛选、鉴定与 克隆扩增
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1. 常用筛选/鉴定阳性重组体的方法
➢ 平板筛选
➢插入失活 ➢插入表达 ➢ 电泳筛选
初步筛选 表型鉴定
➢ PCR筛选
➢ 核酸杂交
➢ DNA测序
精确鉴定
➢ 免疫学检测法
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1.平板筛选法 （1）插入失活（insertional inactivation)：
• 转化子：又称工程菌，即接受了重组DNA的受
体菌。
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2.受体细胞感受态
➢ 感受态(competent) ：细胞最易摄取 和“容忍”外来DNA的生理状态。
➢ 致敏：诱导细胞进入感受态的操作。
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３．转化动物细胞常用的方法
1.磷酸钙共沉淀法； 2.DEAE-葡聚糖或聚阳离子促进吸收法； 3.脂质体转染法； 4.电穿孔法； 5.病毒转染法； 6.显微注射法。
同尾酶。
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DNA连接酶―“分子针线”
• 连接双链DNA分子 中相邻3’- OH和 5’-磷酸基之间的 磷酸二酯键的形成。
• 最常用的是T4连接 酶，可以连接粘性 末端和平头末端。
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03
基因工程在医学领域的应用
基因治疗
基因治疗是指通过改变人类基因来治疗遗传性疾病和获得性病变的方法 。
基因治疗可以分为直接基因治疗和间接基因治疗。直接基因治疗是将正 常的基因导入病变细胞，以取代异常基因；间接基因治疗则是通过调节
病变细胞的基因表达来达到治疗目的。
基因治疗在遗传性疾病、肿瘤、感染性疾病等领域具有广泛的应用前景 ，例如囊性纤维化、镰状细胞贫血、癌症等疾病的基因治疗研究已经取 得了一定的成果。
基因工程的发展历程
自20世纪80年代以来，基因工程技术不断发展 和完善，已经广泛应用于农业、工业、医学等领 域。
基因工程的未来发展
随着基因编辑技术的发展和应用，基因工程将在 未来发挥更加重要的作用，有望解决许多人类面 临的重大问题。
基因工程的应用领域
农业领域
基因工程在农业上的应用主要包 括抗虫、抗病、抗除草剂等转基 因作物的培育，以及提高农作物
合成生物学
通过设计和构建人工基因组和细胞系统，实现生物体的定制化，为工 业生产、环境保护等领域提供新的解决方案。
基因工程面临的挑战与问题
安全问题
基因工程操作可能引发不可预测的后果，如基因突变、生态失衡等，需要建立严格的安 全评估和监管机制。
伦理问题
基因工程涉及到人类和动物的遗传信息，可能引发隐私、公平和尊严等方面的伦理问题 ，需要制定相应的伦理准则和法规。
开展基因工程伦理
教育
在学校、社区、企事业单位等各 个层面开展基因工程伦理教育， 引导人们正确看待基因工程技术 的利与弊，树立正确的科技伦理 观念。
05
未来展望与挑战
基因工程的未来发展趋势
基因治疗
利用基因工程技术治疗遗传性疾病和癌症等严重疾病，提高患者的 生活质量和生存率。

•
具有若干限制性内切酶单一识别
制的双链环状 DNA 分子。
位点，便于外源基因插入。
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克隆载体: PBR322
特点： • 分子量小，，便于操作。 • 有两个抗性基因，便于转化子筛选。 • 有几个常用的限制性内切酶的单一位点，分布在抗性基因上，7种位
于四环素选择标记上，4种位于Amp抗性基因上。外源基因的插入 将破坏抗性基因的完整性，导致抗性基因插入失活，这种特性可用 于区分重组和非重组分子。 • 松弛性质粒，在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数，当细菌蛋白质合 成停止时，它仍能继续复制。
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• 克隆载体(cloning vector)
用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低 的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。主要由细菌质粒 或与其它质粒、噬菌体及真核生物病毒的DNA重组构建 （PBR322）。
• 表达载体(expression vector)
使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体 DNA导入适合的受体细胞，使所载荷的目的基因能够复制、 转录和翻译（pCDNA3）。
The Nobel Prize in Chemistry 1980
Jackson, Symons,and Berg (1972) – generated first recombinant DNA molecules
Cohen and Boyer (1973) – produced first plasmid vector capable of being replicated within a bacterial host vectors – carriers of foreign DNA
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打破了常规育种难以突破的物种之间的界限
可以使原核生物与真核生物之间的遗传信息进行 相互重组和转移 可以使动物与植物之间的遗传信息进行相互重组 和转移 可以使人与其他生物间的遗传信息进行相互重组 和转移
2.2 DNA重组
2.2.1 DNA的一般性质 2.2.1.1 DNA的组成和结构
腺嘌呤脱氧核苷酸(A) 鸟嘌呤脱氧核苷酸(G) 胞嘧啶脱氧核苷酸(C) 胸腺嘧啶脱氧核苷酸(T)
主要途径： 限制性内切核酸酶酶切法 PCR扩增法 化学合成法
2.2.2 获得DNA片段的主要途径
2.2.2.1 限制性内切核酸酶和DNA片段化 限制性内切核酸酶(restriction endonuclease) 功能：能识别双链DNA中特殊核苷酸序列, 并在合适的 反应条件下,使每条链的一个磷酸二酯键断开,产生具有 3´OH和5´P的DNA片段。 识别序列规律：旋转对称或左右互补对称。 切割位点:在识别序列上使磷酸二酯键断开的位置。
这些酶的普遍缺点： 热稳定性差，DNA热变性后即被灭活。
Taq酶
来自水生嗜热菌Thermus aquaticus YT-1，该菌是 1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离得 到。生长在70～75℃极富矿物质的环境中。
Taq聚合酶的特点及浓度：
具有良好的热稳定性。在70～75℃时生物学活性最 高；92.5℃时半衰期为130 min。
人类DNA的长度相当于3200公里
2 nm
11 nm
30 nm
DNA双螺旋短区域 染色质节段
由紧密包装的核小体组 成的30nm的染色质纤维
染色体节段的一部分 中期染色体的凝缩节段
染色体
300 nm
700 nm
1400 nm

练习
在基因工程中，切割运载体和含有目 的基因的DNA片段，需使用（ Ａ ） Ａ．同种限制酶 B. 两种限制酶 Ｃ．同种连接酶 D. 两种连接酶
注意：要用同一种限制酶切取目的基因 和运载体，并用DNA连接酶连接。
练习
不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制
B、有多个限制酶切点
（Hale Waihona Puke D）C、具有标记基因D、它是环状DNA
双基练习： 一、基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计, 通过体外____和____等技术,赋予生物以心得遗 传特性,创造出符合人们的需要的新的____和 ____.又叫做DNA的重组技术 .
二、DNA重组技术的基本工具
1.限制性核酸内切酶-----”分子手术刀”
平末端
假如目的基因导入受体细胞后不能复制 将怎样？ 作为载体没有切割位点将怎样？ 目的基因是否进入受体细胞，你如何察 觉？ 如果载体对受体细胞有害将怎样？如果 不能分离会怎样？
对受体细胞无害，易分离．
被同一种限制酶切断的几个来源不同的DNA 是否具有相同的黏性末端？
被同一种限 制切断的几 个DNA具有 相同的黏性 末端。
二个不同的ＤＮ Ａ的黏性末端黏 合起来，就似乎 可以合成重组的 DNA分子了。
二. DNA连接酶——“分子缝合针”
１、作用： 把两条ＤＮＡ末端之间的缝 隙“缝合”起来
２、种类：
（一）基因工程的概念 该技术是在生物体外，通过对DNA分子进行人 工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改 造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性 繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出 人类所需要的基因产物。 基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。

基因工程研究
体外 操作 与细 胞内 表达
(基因工程技术包括下列过程)
分─获取目的基因和载体 接─目的基因与载体的连接 转─重组DNA导入宿主细胞 筛─重组DNA的筛选 鉴─重组DNA的鉴定
可用以上五个字表示
(一)目的基因的分离(分)
目的基因:是指所要研究或应用的基因,也是需要克隆或表达 的基因。 (一) 目的基因的分离 1、基因分离的策略
同 源 多 聚 尾 连 接 法
三、将重组体导入受体细胞 (转)
根据受体生物,可将重组体导入受体细胞的方法主要分为大肠杆 菌转化法、酵母转化法、植物细胞转化法及动物细胞转化法
(一) 大肠杆菌转化法 1、氯化钙转化法(狭义的转化)或转染 感受态细胞(Competent Cell)的制备:用特殊方法处理,使细胞膜通透 性增加,从而具有摄取外源DNA的能力。 转化流程:感受态细胞和重组DNA混合,使DNA与钙离子形成复合物, 吸附于细胞表面,经42℃短暂(90s)的热处理,促进外源DNA进入感受态 细胞。
(三) 植物细胞转化法
1、农杆菌质粒介导法 农杆菌介导法是目前双子叶植物基因转移的常用方法。
它是利用根癌农杆菌的Ti (Tumor induce)质粒和发根农杆 菌的Ri (Root induce)质粒上的一段T-DNA区在农杆菌侵染 植物形成肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细胞并插 入到染色体基因中。利用Ti质粒的这一天然的遗传转化特性, 可将外源基因置换T-DNA中的非必需序列即可使外源基因整 合到受体染色体而获得稳定的表达。
4、同源多聚尾连接法
也称作人工接尾连接法 当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断,无 法得到相同得粘性末端时,可采用此方法。 此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平,再在末端核 苷酸转移酶的催化下,将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的 基因的3'-端,如载体上添加一段polyG,则可在目的基因上添 加一段polyC,故二者即可通过碱基互补进行粘合,再由DNA连 接酶连接。

腺嘌呤 (A)、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶 (C)、胸腺嘧啶 (T)
由氢键连接的碱基组合称为碱基配对，即腺嘌呤A必与胸腺嘧 啶T配对，胞嘧啶C必与鸟嘌呤G配对。
A＝T 氢键 G≡C
1972年 ，美国的Berg和Jackson等人将猿猴病毒基因组SV40DNA、 噬菌体基因以及大肠杆菌半乳糖操纵子在体外重组获得成功。
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每天都是美好的一天，新的一天开启 。21.1.1 921.1.1 904:35 04:35:0 204:35:02Jan-2 1
ห้องสมุดไป่ตู้
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相信命运，让自己成长，慢慢的长大 。2021 年1月19 日星期 二4时3 5分2秒 Tuesday , January 19, 2021
•
爱情，亲情，友情，让人无法割舍。2 1.1.192 021年1 月19日 星期二 4时35 分2秒21 .1.19
基因工程的应用及其安全管理
一、基因工程的研究进展： 二、基因工程的基本操作程序： 三、基因工程的巨大贡献： 四、基因工程的危险性： 五、基因工程安全管理法规：
基因工程的研究进展
DNA的结构 :
DNA是一种高分子化合物,它是由4种核苷酸组成 ，4种核苷酸 的差异仅仅在于碱基不同，4种碱基分别是 :
谢谢大家！
1997年7月，中华人民共和国农业部颁布了《农业生 物基因工程安全管理实施办法》。1998年，农业部农业生 物基因工程安全管理办公室和农业部生物基因工程安全委 员会共对2批68项申请进行了评审，同意商品化申请2项、 同意环境释放10项，同意和认可中间试验39项，暂不同意 或不认可16项。
•
生活中的辛苦阻挠不了我对生活的热 爱。21. 1.1921. 1.19Tu esday , January 19, 2021

3、质粒的复制只能在宿主细胞内完成。
• 大肠杆菌的质粒：
最常用的质粒是大肠 杆菌的质粒，其中常 含有抗药基因，如四 环素的标记基因。质 粒的存在与否对宿主 细胞生存没有决定性 作用，但复制只能在 宿主细胞内进行。
练习
1.以下说法正确的是
（C ）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷 酸序列
B、质粒是基因工程中唯一的运载体
将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中 是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌 落，保留有表达产物的进一步培养、研究。
无表达产物 无表达产物 有表达产物 无表达产物
１、基因工程与作物育种
1993年，中国农业科学院的 科学家成功地培育出了抗棉 铃虫的转基因抗虫棉，抗虫 的基因来自苏云金杆菌。苏 云金杆菌形成的伴胞晶体是 一种毒性很强的蛋白质晶体， 能使棉铃虫等鳞翅目害虫瘫 痪致死。科学家将编码这个 蛋白质的基因导入作物，使 作物自身具有抵御虫害的能 力。
要获得目的基因，主要有两条途径：一条是从供 体细胞的DNA中直接分离基因，另一条是人工合 成基因。
2、目的基因与运载体结合
细菌
供体细胞
取出质粒
取出DNA
用限制酶切断DNA
用连接酶连 接目的基因
用与提取目的基因 相同的限制酶切割质粒 使之出现一个切口，将 目的基因插入切口处， 让目的基因的黏性末端 与切口上的黏性末端互 补配对后，在连接酶的 作用下连接形成重组 DNA分子。
培育生物新品种 B、重组DNA的形成在细胞内完成 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、质粒都可作为运载体
三、基因工程基本步骤
1、获取目的基因
基因工程的第一步，是取得人们所需要的特定基 因，也就是目的基因如抗虫基因，抗病基因、种 子的贮存蛋白基因，以及人的胰岛素基因、干扰 素基因等都是目的基因。

反式作用因子的四种作用方式：
（1）通过与DNA结合发挥作用
（2）一个转录因子可以识别另一个转录因子 （3）可识别RNA聚合酶
（4）当有其它几种蛋白质存在时可以掺入转录起始复合物
现在二十八页，总共五十七页。
(1) 转录因子的种类
基础转录因子(basal factor)：是RNA聚合酶II在所有启动子上形成转录起始复合物时 所需的转录因子。 活化因子(activator)：是通过作用于启动子以刺激RNA聚合酶的结合，从而刺激基 因表达。真核生物中，活化因子结合的启动子中的序列，称为应答元件。 协同活化因子(coactivator)：不结合DNA，是活化因子和基础转录因子相互作用时 所需要的转录因子。
现在二十页，总共五十七页。
现在二十一页，总共五十七页。
4 乳糖操纵子在基因工程中的应用
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷
（isopropylthiogalactoside, IPTG）
现在二十二页，总共五十七页。
1.3.2 control of eukaryotic transcription 1 真核基因表达调控的类型 1）DNA水平上的基因表达调控 2）转录水平上的基因表达调控 3）转录后水平上的基因表达调控 4）翻译水平上的基因表达调控 5）蛋白质加工水平上的基因表达调控
基因工程技术研究进展
现在一页，总共五十七页。
1.1 gene structure
1.1.1 promoter 1.1.2 coding region 1.1.3 terminator
原核生物基因的结构
1）基因区
原核生物的基因多数以操纵子形式存在，即完成同类功能的多个基因聚集在一起，处于同一个 启动区的调控之下，下游同具一个终止子。但各基因分别具有起始密码子和终止密码子。基因 之间一般都存在间隔序列。

（一） 质粒
◆质粒(plasmid)是细菌染色体外存在的一种 能够自我复制的双链闭合环状DNA分子，大 小1kb～200kb。
质粒常常带有一些特殊的基因，如致死基因，抗 抗生素的基因等等。 一般质粒都含有一个复制起始区，可独立复制。 质粒DNA复制与宿主之间的关系，可分为“严谨 型”和“松弛型”。“严谨型”质粒在每个细胞中 的拷贝数通常1~3个，而“松弛型” 通常在10个以 上，可高达200个拷贝。
◆通常是将cDNA库与核基因库配合使用， 以便既能得到基因的编码序列，又可得到基 因的调控序列。
2 筛选基因库
◆从基因库中筛选、分离基因，可据对待选 基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和 条件。
◆常用方法是利用一段核苷酸序列(DNA， cDNA或寡核苷酸)作探针(probe)，用放射性 同位素或非放射性同位素标记探针，也可用 抗体作探针，筛选基因库。性： 只切割双链DNA分子，不切单链DNA； 每种酶有其特定的核苷酸序列识别特异性； 需要镁离子激活等。
（一）限制性内切核酸酶
★限制酶可分为3类。
Ⅰ型酶：只有EcoB和EcoK两种，具有催化限制性 切割和修饰核苷酸2种功能。 Ⅱ型酶：在遗传工程中应用最广泛。① 有特异识别 和切割的序列部位，被切割的DNA分子形成单链的断 裂；② 断裂的部位通常不是直接相对的，结果所形 成的DNA片段常具有碱基互补的单链尾巴（粘性末 端），使其能够重新连接； ③ 内切酶的切割和修饰 功能由两个不同的酶催化所完成。 Ⅲ型酶具有特异的识别位点，这种识别位点是非对 称的。
粘粒载体
与噬菌体载体和质粒载体相比具有多个优点：
具有cos位点，能高效地转化大肠杆菌，能在大肠 杆菌中实现自身环化，并能在大肠杆菌中复制； 有像质粒一样的选择标记； cosmid载体比较小，但能插入较大的外源片段，可 克隆外源片段的长度在15~45 kb之间。