发光细菌法测生物毒性

实验一发光细菌的急性毒性评价试验一、实验器材1.菌株明亮发光杆菌（Photobacterium phosphoreum）2.培养基酵母膏0.5%，胰蛋白胨或多聚蛋白胨（Polypetone）0.5%，甘油0.3%，NaCl 3%，Na2HPO4 0.5%, KH2PO4 0.1%，pH6.5。

固体培养基再加琼脂2%。

3.溶液、试剂及待测物质酵母粉，蛋白胨，NaCl（AR），Na2HPO4（AR），KH2PO4（AR），甘油（AR），二甲基亚砜（AR），乙酸乙酯（AR），HCl（1M），去离子水。

4.仪器及其他用品生物毒性测试仪；电热恒温鼓风干燥箱；振荡培养箱；DELTA 320pH计；氮吹仪；镊子，移液枪，三角锥形瓶等。

二、目的要求1.学习了解发光细菌的急性毒性评价试验的基本原理。

2.掌握发光细菌的急性毒性评价试验的操作要领和评价方法。

三、基本原理发光细菌是指在正常的生理条件下能够发射肉眼可见的蓝绿色荧光的细菌，这种可见荧光波长在450-490 nm之间，在黑暗处肉眼可见。

不同种类发光细菌的发光机理是相同的，都是由特异性的荧光酶(LE)，还原性的黄素(FMNH2)，八碳以上长链脂肪醛(RCHO)，氧分子(O2)所参与的复杂反应，大致历程如下：FMNH2+LE→FMNH2·LE+O2→LE·FMNH2·O2+RCH→LE·FMNH2·O2·RCHO→LE+FMN+ H2O+RCOOH+光具体来说，生物发光反应由分子氧作用，胞内荧光酶催化，将还原态的黄素单核苷酸(FMNH2)及长链脂肪醛氧化为FMN及长链脂肪酸，同时释放出最大发光强度在波长为407-409 nm处的蓝绿光。

发光细菌法是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光细菌发光强度的影响。

发光细菌含有荧光素、荧光酶、ATP等发光要素，在有氧条件下通过细胞内生化反应而产生微弱荧光。

当细胞活性升高，处于积极分裂状态时，其ATP含量高，发光强度增强。

发光细菌法检测水土环境毒性的进展和评价分析摘要：发光细菌法是一种快速、灵敏的生物测试方法，被人们广泛应用在水土环境毒性测试工作中，取得了理想的成绩。

文章在阐述发光细菌法测定原理的基础上，就发光细菌法在水土环境毒性测定中的应用问题进行探究。

关键词：发光细菌法；水土环境；毒性；检测在现代工业的快速发展下，金属开始通过各个途径进入到土壤、水文、大气等生态系统中，这个期间会对系统中的生物体产生不良反应，进而使得整个生态系统遭受到破坏。

为了能够确保工业发展的安全有效，需要相关人员按照规范的标准研究金属生物毒性以及其在生态系统中的潜在危害。

生物毒性是指生物体在毒物的作用下所产生的不良效应，为了能够更为精准的把握这种反应，可以借助生物测试方法，比如发光细菌法来测试生物体中的毒性。

一、发光细菌法的测定原理生物发光是一种普遍的自然现象，在自然环境中，可见光的生物有发光细菌、真菌、放射虫类等。

发光是发光细菌的一种生理过程，在分子氧作用、细胞内荧光酶催化作用下会将还原态的黄素单核苷酸和长链脂肪醛氧化为黄素单核苷酸和长链脂肪酸。

在发生化学反应之后还会释放出波长在450nm到490nm的蓝绿光。

从实际发展情况来看，发光过程很容易受到外界环境的影响，这个期间，能够干扰或者损害细菌呼吸、生理过程的任何因素都会使得细菌的发光强度出现变化。

在有毒有害物质和发光细菌出现接触的时候，发光强度会出现变化，且随着毒性物质浓度的增加，发光也会日渐减弱。

基于这个特点，可以利用发光细菌作为指示微生物，将发光强度的变化作为重要参考指标，在此基础上深入测定环境中有毒有害物质的生物毒性，从而帮助相关人员全面的了解环境中的污染物质。

二、发光细菌法检测水土环境毒性检测使用发光细菌进行毒性测试可以从以下几个方面进行：第一，利用野生型发光细菌来开展毒性测试，细菌发光强度和毒性物质的浓度会呈现出一种反比的关系。

在具体测试分析中会通过发光抑制率来体现水土环境中的毒性大小。

生物发光毒性测试分析毒性是一项综合的生物学参数，它是衡量样品对活性生物体所产生的影响，不能以化学分析的方法进行测定，一些生物测试方法如鱼类试验、浮游动物试验、藻类试验等则较为复杂，且必须使用高等生物进行试验，从而引起众多的争议。

发光细菌测试使用了具有发光特性的天然或人工遗传改造的微生物，这一方法经研究被证实具有快速、简便的特点，同时有很好的灵敏度和可靠性，发光细菌本身又没有危害性。

发光细菌试验已成为环境样品毒性检测的生物测试技术，被列入了我国国家标准GB/T 15441-1995，德国国家标准(DIN38412)和国际标准(ISO11348)。

发光细菌毒性测试方法是一个我国国家标准和ISO标准认证的，运用发光细菌Vibrio fischeri进行急性毒理测试。

发光细菌闪烁测试（flash test）是一个改良的方法用于测试含有固体和有色的样品。

上述两个系统包括化学发光检测仪（闪烁测试系统的发光仪必需有自动样品注射器），软件程序，试剂冷却/孵育器和冷冻干粉状态的测试用发光细菌。

生物重金属试剂盒是一个革命性地用于分析环境中少量样品的方法。

这些细菌能够特异性地感受到某种特定金属的存在，如来自固体和液体样品中ppb水平的铅、汞、砷和镉。

发光终点测试方法具有很高的灵敏度，快速和高通量进行。

发光细菌毒性测试此方法是传统和标准的通过发光细菌方法来测试化合物或污水的毒性（GB/T 15441-1995，ISO 113483: 水质）测定水样对Vibrio fischeri <发光细菌测试>的光发射抑制效果。

这个测试方法是建立在此基础之上的――当有毒性的化合物存在时，细菌的发光量会降低。

这个方法非常快速，只需要5－30分钟就可以完成。

标准发光细菌的测试过程是：把样品和细菌混合在一起，经过短暂的孵育，测试发光强度。

检测仪器只需要化学发光仪（如Berthold Detection Systems管式或板式化学发光仪)。

ICS13.060.01Z16DB23黑龙江省地方标准DB23/T2750—2020水质生物毒性的测定发光细菌快速测定法2020-12-16发布2021-01-15实施目 次前言 (II)引言 (III)1范围 (1)2规范性引用文件 (1)3方法原理 (1)4试剂和材料 (1)5仪器设备 (2)6测定 (2)7结果计算与表示 (3)8方法的精密度 (3)附录A（资料性附录）结果判定参考内容 (4)前 言本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。

本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由黑龙江省生态环境厅提出并归口。

本文件参与起草单位：黑龙江省生态环境监测中心。

本文件主要起草人：王鹏杰、曹胜、邢延峰、孟庆庆、李博、胡丽娜、张蕊、杨宏坤、姜景阳、关吉鑫、李经纬、王国梁、李海智、芦旭峰、苏晓慧、于宗灵、柏广宇、李慧。

引 言为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国水污染防治法》等法律法规，保护和改善生态环境，保障人体健康，制定本文件。

水质生物毒性的测定发光细菌快速测定法1范围本文件规定了水质生物毒性的测定发光细菌快速测定法的方法原理、试剂和材料、仪器设备、测定、结果计算和表示及方法的精密度。

本文件适用于工业废水，纳污水体及实验室条件下可溶性化学物质的水质急性毒性监测。

2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。

其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T15441-1995水质急性毒性的测定发光细菌法3方法原理水样在一定的时间和条件下与发光细菌接触后，发光细菌的发光强度变化与水样中毒性组分总浓度呈负相关关系，通过生物发光光度计测定水样与发光细菌接触一定时间后的发光抑制率来表征水样的急性毒性水平。