高效液相色谱法测定大米中的维生素B_1

农产品中维生素的测定原理维生素是人体必需的微量营养素，它在人体内发挥着重要的生物活性和生理作用。

针对不同种类的维生素，测定原理也会有所不同。

下面将就常见的几种维生素的测定原理进行详细解析。

1. 维生素A的测定原理：维生素A是溶于有机溶剂的脂溶性维生素，常见的测定方法有色度法、荧光法和高效液相色谱法。

色度法是通过维生素A的吸收特性来测定其含量，通过向样品中加入溶剂提取维生素A后，用特定波长下的光照射样品，测定吸光度，并通过与标准品的对照来计算维生素A的含量。

荧光法是利用维生素A与特定试剂反应生成荧光物质，再测定荧光的强度来计算维生素A的含量。

高效液相色谱法则是将样品中的维生素A分离出来，通过色谱柱的分离，再通过检测器测定其含量。

2. 维生素C的测定原理：维生素C是水溶性维生素，常见的测定方法有滴定法、分光光度法和电化学法。

滴定法是通过将含有维生素C的溶液与一定浓度的氧化剂（如碘、溴）滴定反应，直到产生显色终点，通过滴定液的用量来计算维生素C的含量。

分光光度法是在特定波长下，测定维生素C对光的吸收度，根据吸光度与浓度之间的关系来计算维生素C的含量。

电化学法利用维生素C具有良好的电化学性质，通过测定维生素C在电极上的电流或电压来计算其含量。

3. 维生素D的测定原理：维生素D是脂溶性维生素，常见的测定方法主要有比色法和放射免疫分析法。

比色法是利用维生素D的特定吸收波长与标准品对比，通过测定吸光度来计算维生素D的含量。

放射免疫分析法是将放射性同位素标记到维生素D上，通过测定放射性同位素的衰减来计算维生素D的含量。

4. 维生素B的测定原理：维生素B是水溶性维生素，常见的测定方法有微生物法、分光光度法和高效液相色谱法。

微生物法是利用维生素B对微生物生长的影响来测定维生素B的含量，通过测定微生物的生长情况来判断维生素B的浓度。

分光光度法是在特定波长下，测定维生素B对光的吸收度，根据吸光度与浓度之间的关系来计算维生素B的含量。

食品安全国家标准食品中维生素B2的测定1范围本标准规定了食品中维生素B2的测定方法㊂本标准第一法为高效液相色谱法,第二法为荧光分光光度法,适用于各类食品中维生素B2的测定㊂第一法高效液相色谱法2原理试样在稀盐酸环境中恒温水解,调p H至6.0~6.5,用木瓜蛋白酶和高峰淀粉酶酶解,定容过滤后,滤液经反相色谱柱分离,高效液相色谱荧光检测器检测,外标法定量㊂3试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为G B/T6682规定的一级水㊂3.1试剂3.1.1盐酸(H C l)㊂3.1.2冰乙酸(C H3C O OH)㊂3.1.3氢氧化钠(N a O H)㊂3.1.4三水乙酸钠(C H3C O O N a㊃3H2O)㊂3.1.5甲醇(C H3O H):色谱纯㊂3.1.6木瓜蛋白酶:活力单位ȡ10U/m g㊂3.1.7高峰淀粉酶:活力单位ȡ100U/m g,或性能相当者㊂3.2试剂配制3.2.1盐酸溶液(0.1m o l/L):吸取9m L盐酸,用水稀释并定容至1000m L㊂3.2.2盐酸溶液(1+1):量取100m L盐酸,缓慢倒入100m L水中,混匀㊂3.2.3氢氧化钠溶液(1m o l/L):准确称取4g氢氧化钠,加90m L水溶解,冷却后定容至100m L㊂3.2.4乙酸钠溶液(0.1m o l/L):准确称取13.60g三水乙酸钠,加900m L水溶解,用水定容至1000m L㊂3.2.5乙酸钠溶液(0.05m o l/L):准确称取6.80g三水乙酸钠,加900m L水溶解,用冰乙酸调p H至4.0~5.0,用水定容至1000m L㊂3.2.6混合酶溶液:准确称取2.345g木瓜蛋白酶和1.175g高峰淀粉酶,加水溶解后定容至50m L㊂临用前配制㊂3.2.7盐酸溶液(0.012m o l/L):吸取1m L盐酸,用水稀释并定容至1000m L㊂3.3标准品维生素B2(C17H20N4O6,C A S号:83-88-5):纯度ȡ98%㊂3.4标准溶液配制3.4.1维生素B2标准储备液(100μg/m L):将维生素B2标准品置于真空干燥器或装有五氧化二磷的干燥器中干燥处理24h后,准确称取10m g(精确至0.1m g)维生素B2标准品,加入2m L盐酸溶液(1+1)超声溶解后,立即用水转移并定容至100m L㊂混匀后转移入棕色玻璃容器中,在4ħ冰箱中贮存,保存期2个月㊂标准储备液在使用前需要进行浓度校正,校正方法参见附录A㊂3.4.2维生素B2标准中间液(2.00μg/m L):准确吸取2.00m L维生素B2标准储备液,用水稀释并定容至100m L㊂临用前配制㊂3.4.3维生素B2标准系列工作液:分别吸取维生素B2标准中间液0.25m L㊁0.50m L㊁1.00m L㊁2.50m L㊁5.00m L,用水定容至10m L,该标准系列浓度分别为0.05μg/m L㊁0.10μg/m L㊁0.20μg/m L㊁0.50μg/m L㊁1.00μg/m L㊂临用前配制㊂4仪器和设备4.1高效液相色谱仪:带荧光检测器㊂4.2天平:感量为1m g和0.01m g㊂4.3高压灭菌锅㊂4.4p H计:精度0.01㊂4.5涡旋振荡器㊂4.6组织捣碎机㊂4.7恒温水浴锅㊂4.8干燥器㊂4.9分光光度计㊂5分析步骤5.1试样制备取样品约500g,用组织捣碎机充分打匀均质,分装入洁净棕色磨口瓶中,密封,并做好标记,避光存放备用㊂称取2g~10g(精确至0.01g)均质后的试样(试样中维生素B2的含量大于5μg)于100m L具塞锥形瓶中,加入60m L的0.1m o l/L盐酸溶液,充分摇匀,塞好瓶塞㊂将锥形瓶放入高压灭菌锅内,在121ħ下保持30m i n,冷却至室温后取出㊂用1m o l/L氢氧化钠溶液调p H至6.0~6.5,加入2m L混合酶溶液,摇匀后,置于37ħ培养箱或恒温水浴锅中过夜酶解㊂将酶解液转移至100m L容量瓶中,加水定容至刻度,用滤纸过滤或离心,取滤液或上清液,过0.45μm水相滤膜作为待测液㊂注:操作过程应避免强光照射㊂不加试样,按同一操作方法做空白试验㊂5.2仪器参考条件a)色谱柱:C18柱,柱长150mm,内径4.6mm,填料粒径5μm,或相当者;b)流动相:乙酸钠溶液(0.05m o l/L)-甲醇(65ʒ35);c)流速:1m L/m i n;d)柱温:30ħ;e)检测波长:激发波长462n m,发射波长522n m;f)进样体积:20μL㊂5.3标准曲线的制作将标准系列工作液分别注入高效液相色谱仪中,测定相应的峰面积,以标准工作液的浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准曲线㊂5.4试样溶液的测定将试样溶液注入高效液相色谱仪中,得到相应的峰面积,根据标准曲线得到待测液中维生素B2的浓度㊂5.5空白试验要求空白试验溶液色谱图中应不含待测组分峰或其他干扰峰㊂6分析结果的表述试样中维生素B2的含量按式(1)计算:X=ρˑVmˑ1001000 (1)式中:X 试样中维生素B2(以核黄素计)的含量,单位为毫克每百克(m g/100g);ρ 根据标准曲线计算得到的试样中维生素B2的浓度,单位为微克每毫升(μg/m L);V 试样溶液的最终定容体积,单位为毫升(m L);m 试样质量,单位为克(g);100 换算为100克样品中含量的换算系数;1000 将浓度单位μg/m L换算为m g/m L的换算系数㊂结果保留三位有效数字㊂7精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%㊂8其他当取样量为10.00g时,方法检出限为0.02m g/100g,定量限为0.05m g/100g㊂第二法荧光分光光度法9原理维生素B2在440n m~500n m波长光照射下发生黄绿色荧光㊂在稀溶液中其荧光强度与维生素B2的浓度成正比㊂在波长525n m下测定其荧光强度㊂试液再加入连二亚硫酸钠,将维生素B2还原为无荧光的物质,然后再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度,两者之差即为试样中维生素B2所产生的荧光强度㊂10试剂和材料除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为G B/T6682规定的一级水㊂10.1试剂10.1.1盐酸(H C l)㊂10.1.2冰乙酸(C H3C O O H)㊂10.1.3氢氧化钠(N a O H)㊂10.1.4三水乙酸钠(C H3C O O N a㊃3H2O)㊂10.1.5木瓜蛋白酶:活力单位ȡ10U/m g㊂10.1.6高峰淀粉酶:活力单位ȡ100U/m g,或性能相当者㊂10.1.7硅镁吸附剂:50μm~150μm㊂10.1.8丙酮(C H3C O C H3)㊂10.1.9高锰酸钾(KM n O4)㊂10.1.10过氧化氢(H2O2):30%㊂10.1.11连二亚硫酸钠(N a2S2O4)㊂10.2试剂配制10.2.1盐酸溶液(0.1m o l/L):吸取9m L盐酸,用水稀释并定容至1000m L㊂10.2.2盐酸溶液(1+1):量取100m L盐酸,缓慢倒入100m L水中,混匀㊂10.2.3乙酸钠溶液(0.1m o l/L):准确称取13.60g三水乙酸钠,加900m L水溶解,用水定容至1000m L㊂10.2.4氢氧化钠溶液(1m o l/L):准确称取4g氢氧化钠,加90m L水溶解,冷却后定容至100m L㊂10.2.5混合酶溶液:准确称取2.345g木瓜蛋白酶和1.175g高峰淀粉酶,加水溶解后定容至50m L㊂临用前配制㊂10.2.6洗脱液:丙酮-冰乙酸-水(5+2+9,体积比)㊂10.2.7高锰酸钾溶液(30g/L):准确称取3g高锰酸钾,用水溶解后定容至100m L㊂10.2.8过氧化氢溶液(3%):吸取10m L30%过氧化氢,用水稀释并定容至100m L㊂10.2.9连二亚硫酸钠溶液(200g/L):准确称取20g连二亚硫酸钠,用水溶解后定容至100m L㊂此溶液用前配制,保存在冰水浴中,4h内有效㊂10.3标准品维生素B2(C17H20N4O6,C A S号:83-88-5):纯度ȡ98%㊂10.4标准溶液配制10.4.1维生素B2标准储备液(100μg/m L):将维生素B2标准品置于真空干燥器或装有五氧化二磷的干燥器中干燥处理24h后,准确称取10m g(精确至0.1m g)维生素B2标准品,加入2m L盐酸溶液(1+1)超声溶解后,立即用水转移并定容至100m L㊂混匀后转移入棕色玻璃容器中,在4ħ冰箱中贮存,保存期2个月㊂标准储备液在使用前需要进行浓度校正,校正方法参见附录A㊂10.4.2维生素B2标准中间液(10μg/m L):准确吸取10m L维生素B2标准储备液,用水稀释并定容至100m L㊂在4ħ冰箱中避光贮存,保存期1个月㊂10.4.3维生素B2标准使用溶液(1μg/m L):准确吸取10m L维生素B2标准中间液,用水定容至100m L㊂此溶液每毫升相当于1.00μg维生素B2㊂在4ħ冰箱中避光贮存,保存期1周㊂11仪器和设备11.1荧光分光光度计㊂11.2天平:感量为1m g和0.01m g㊂11.3高压灭菌锅㊂11.4p H计:精度0.01㊂11.5涡旋振荡器㊂11.6组织捣碎机㊂11.7恒温水浴锅㊂11.8干燥器㊂11.9维生素B2吸附柱㊂12分析步骤12.1试样制备12.1.1试样的水解取样品约500g,用组织捣碎机充分打匀均质,分装入洁净棕色磨口瓶中,密封,并做好标记,避光存放备用㊂称取2g~10g(精确至0.01g,约含10μg~200μg维生素B2)均质后的试样于100m L具塞锥形瓶中,加入60m L0.1m o l/L的盐酸溶液,充分摇匀,塞好瓶塞㊂将锥形瓶放入高压灭菌锅内,在121ħ下保持30m i n,冷却至室温后取出㊂用氢氧化钠溶液调p H至6.0~6.5㊂12.1.2试样的酶解加入2m L混合酶溶液,摇匀后,置于37ħ培养箱或恒温水浴锅中过夜酶解㊂12.1.3过滤将上述酶解液转移至100m L容量瓶中,加水定容至刻度,用干滤纸过滤备用㊂此提取液在4ħ冰箱中可保存一周㊂注:操作过程应避免强光照射㊂12.2氧化去杂质视试样中核黄素的含量取一定体积的试样提取液(约含1μg~10μg维生素B2)及维生素B2标准使用溶液分别置于20m L 的带盖刻度试管中,加水至15m L ㊂各管加0.5m L 冰乙酸,混匀㊂加0.5m L30g /L 高锰酸钾溶液,摇匀,放置2m i n,使氧化去杂质㊂滴加3%过氧化氢溶液数滴,直至高锰酸钾的颜色褪去㊂剧烈振摇试管,使多余的氧气逸出㊂12.3 维生素B 2的吸附和洗脱12.3.1 维生素B 2吸附柱硅镁吸附剂约1g 用湿法装入柱,占柱长1/2~2/3(约5c m )为宜(吸附柱下端用一小团脱脂棉垫上),勿使柱内产生气泡,调节流速约为60滴/m i n㊂注:可使用等效商品柱㊂12.3.2 过柱与洗脱将全部氧化后的样液及标准液通过吸附柱后,用约20m L 热水淋洗样液中的杂质㊂然后用5m L洗脱液将试样中维生素B 2洗脱至10m L 容量瓶中,再用3m L ~4m L 水洗吸附柱,洗出液合并至容量瓶中,并用水定容至刻度,混匀后待测定㊂12.4 标准曲线的制备分别精确吸取维生素B 2标准使用液0.3m L ㊁0.6m L ㊁0.9m L ㊁1.25m L ㊁2.5m L ㊁5.0m L ㊁10.0m L ㊁20.0m L (相当于0.3μg ㊁0.6μg ㊁0.9μg ㊁1.25μg ㊁2.5μg ㊁5.0μg ㊁10.0μg ㊁20.0μg 维生素B 2)或取与试样含量相近的单点标准按12.2和12.3操作㊂12.5 试样溶液的测定于激发光波长440n m ,发射光波长525n m ,测量试样管及标准管的荧光值㊂待试样管及标准管的荧光值测量后,在各管的剩余液(约5m L~7m L )中加0.1m L20%连二亚硫酸钠溶液,立即混匀,在20s内测出各管的荧光值,作各自的空白值㊂13 分析结果的表述试样中维生素B 2的含量按式(2)计算:X =(A -B )ˑS(C -D )ˑmˑf ˑ1001000 (2)式中:X试样中维生素B 2(以核黄素计)的含量,单位为毫克每百克(m g /100g );A 试样管的荧光值;B 试样管空白荧光值;S 标准管中维生素B 2的质量,单位为微克(μg );C 标准管的荧光值;D 标准管空白荧光值;m 试样质量,单位为克(g);f 稀释倍数;100换算为100克样品中含量的换算系数;1000 将浓度单位μg /100g 换算为m g/100g 的换算系数㊂计算结果保留至小数点后两位㊂14精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%㊂15其他当取样量为10.00g时,方法检出限为0.006m g/100g,定量限为0.02m g/100g㊂附 录 A维生素B 2标准溶液的浓度校正方法A .1 标准校正溶液的配制准确吸取1.00m L 维生素B 2标准储备液,加1.30m L0.1m o l /L 的乙酸钠溶液,用水定容到10m L ,作为标准测试液㊂A .2 对照溶液的配制准确吸取1.00m L0.012m o l /L 的盐酸溶液,加1.30m L0.1m o l /L 的乙酸钠溶液,用水定容到10m L ,作为对照溶液㊂A .3 吸收值的测定用1c m 比色杯于444n m 波长下,以对照溶液为空白对照,测定标准校正溶液的吸收值㊂A .4 标准溶液的浓度计算标准储备液的质量浓度按式(A.1)计算:ρ=A 444ˑ104ˑ10328(A.1)式中:ρ 标准储备液的质量浓度,单位为微克每毫升(μg /m L );A 444标准测试液在444n m 波长下的吸光度值;104将1%的标准溶液浓度单位换算为测定溶液浓度单位(μg /m L )的换算系数;10标准储备液的稀释因子;328 维生素B 2在444n m 波长下的百分吸光系数E 1%1c m ,即在444n m 波长下,液层厚度为1c m 时,浓度为1%的维生素B 2溶液(盐酸-乙酸钠溶液,p H=3.8)的吸光度㊂附录B维生素B2的液相色谱图维生素B2标准溶液的液相色谱图见图B.1㊂图B.1维生素B2标准溶液的液相色谱图。