SLMBP21影响离区发育的分子机理研究

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密级: 论文编号:中国农业科学院学位论文SEP ALLATA类MADS盒基因SLMBP21参与番茄花柄离区发育的分子机制研究The SEPLLATA-like MADS-box Gene SLMBP21is Required for Tomato (Solanum lycopersicum L.) Flower Abscission ZoneDevelopment博士研究生:刘旦梅指导教师:毛龙研究员申请学位类别:理学博士专业:生物化学与分子生物学研究方向:植物基因工程培养单位:作物科学研究所研究生院提交日期2013年12月Secrecy:No. Chinese Academy of Agricultural SciencesDissertationThe SEPLLATA-like MADS-box Gene SLMBP21is Required for Tomato (Solanum lycopersicum L.) Flower Abscission ZoneDevelopmentPh.D Candidate:Danmei LiuAdvisor:Professor Long MaoMajor: Biochemistry and Molecular BiologySpecialty:Plant Gene EngineeringDecember 2013独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。

研究生签名:时间:年月日关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定,即:中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。

同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。

研究生签名:时间:年月日导师签名:时间:年月日中国农业科学院博士学位论文评阅人、答辩委员会签名表论文题目SEP ALLATA类MADS盒基因SLMBP21参与番茄花柄离区发育的分子机制研究论文作者刘旦梅专业生物化学与分子生物学研究方向植物基因工程指导教师毛龙培养单位(研究所、中心)作物科学研究所姓名职称单位专业签名评阅人答辩主席答辩委员会议记录(秘书)论文答辩时间地点摘要器官脱落是植物生命周期中普遍而重要的生理过程,同时又是一个重要的农艺性状。

大部分植物的器官脱落发生于离区,离区发育与器官脱落紧密相关。

番茄花(果)柄离区位于花(果)柄中部,是研究离区发育的良好模式植物。

利用转基因技术阻止或调节果实离区的发育可以有效地防止或减少果实脱落,提高作物产量,在农业生产上有重要的应用价值。

在番茄中已确定并克隆的决定离区发育的基因有两个:JOINTLESS (J) 和MACROCALYX (MC),在这两个基因的突变体或功能抑制转基因植株中离区不能正常形成,但截至目前,番茄离区发育机制尚未明了。

根据已有的番茄中MADS-box蛋白互作研究结果以及我们的遗传学分析,我们发现SEPALLATA (SEP) 亚族基因SLMBP21参与番茄离区发育。

同时我们还从蛋白互作水平和转录调控水平分析了SLMBP21影响番茄花(果)柄离区形成的分子机制。

主要结果如下:1. 构建并获得了SLMBP21的反义RNA转基因(SLMBP21-AS) 植株,RNAi转基因植株(SLMBP21-RNAi)和过量表达转基因(SLMBP21-OX) 植株。

通过对SLMBP21-AS转基因植株的表型分析我们发现SLMBP21参与离区发育过程,因为在SLMBP21-AS转基因植株中离区发育受到抑制。

同时,SLMBP21-RNAi植株的表型也进一步证明了SLMBP21的确参与离区发育。

在SLMBP21-OX转基因植株中,花柄近轴端和花梗由于细胞变小而变短,并且这些小细胞具有部分离区性质,表明SLMBP21通过调节离区细胞大小来参与离区形成。

2. 酵母双杂交和双分子荧光互补实验表明SLMBP21,J和MC之间可以发生两两互作,并且SLMBP21和MC能够形成同源二聚体。

同时蛋白质免疫共沉淀(CoIP) 实验表明当J,MC和SLMBP21同时在植物体内表达时,它们能够形成蛋白复合体。

3. 原位杂交表达模式分析表明,在花发育的早期,SLMBP21,J和MC的表达模式各异但重叠于初期的花柄离区维管束。

花柄离区维管束起源于顶端分生组织第三层(L3)的最外层,该层细胞已被证明在花柄离区的形成过程中有重要作用。

同时,SLMBP21,J和MC的表达模式具有重叠区也为它们的蛋白互作提供了时空条件。

4. 酵母中转录激活活性分析表明:与J和MC相比,SLMBP21具有较强的转录激活活性,暗示了SLMBP21是SLMBP21/J/MC蛋白复合体中唯一的起转录激活作用的蛋白。

5. 我们进一步开展了SLMBP21-AS植株花柄和野生型花柄的转录组分析实验。

通过与已发表的J和MC的芯片数据作比较,我们发现共有7个基因能被SLMBP21,J和MC一致性调节并能够在离区特异性表达。

这7个基因中包括已知的分生组织相关基因,比如LeWUS,Blind (Bl) 和Lateral suppressor(Ls),这与离区具有分生组织性质这一观点相吻合。

同时,我们还发现离区发育是一个复杂且需要多种途径和信号共同起作用的过程。

6. 系统进化分析表明SLMBP21属于SEP亚族LOFSEP分支下的FBP9/23小分支。

除了SLMBP21,该分支也包括其它来自于茄科,苹果属和梨属的蛋白,但在拟南芥以及其他十字花科植物中并没有该分支蛋白。

既然如此,那么SLMBP21所在蛋白复合体所参与的过程应该是一个不同于拟南芥的新的离区发育机制。

综上所述,我们发现了SEP类MADS-box基因SLMBP21参与番茄花(果)柄离区发育,这一发现在控制番茄果实脱落方面具有潜在的应用价值。

同时,鉴于拟南芥中并没有SLMBP21类似基因,因而SLMBP21可能为我们揭示了一个植物中离区发育的新机制。

关键词:SLMBP21,MADS-box蛋白复合体,离区,番茄AbstractOrgan abscission is a key step in plant life cycle and an important agronomic trait for crops. For most plants, abscission occurs at a specific region named abscission zone (AZ). Tomato has proven to be an excellent model for AZ study because of its distinctive joint-like AZ structure in the middle of flower (fruit) pedicels. Control of organ abscission is of commercial significance for most crops because fruit dropping (abscission) is one of the major factors for yield loss under adverse growth conditions. In tomato, two MADS-box genes JOINTLESS(J) and MACROCALYX(MC) have been reported to be required for AZ formation. However, the detailed mechanism underlying AZ development is still not well understood. In this work, based on previous yeast two hybridization data, we identified that the SEP ALLATA group MADS-box gene SLMBP21 was required for tomato pedicel AZ development and then studied its mode of action both on protein-protein interaction level and transcriptome level. The main results are as follows:1. We generated antisense and overexpression transgenic lines of SLMBP21 and found that loss of function of SLMBP21 caused the elimination of AZ at tomato pedicels. The observation was confirmed by additional RNAi transgenic plants, indicating that SLMBP21 is required for tomato AZ development. Overexpression of SLMBP21 generated more AZ-like small cells at the proximal section of the pedicel as well as the peduncle. Exogenous ethylene treatment showed that these cells conferred partial AZ functions.2. Yeast two-hybrid and bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays showed that pair-wise interactions exsisted among SLMBP21, J, and MC, and both SLMBP21 and J could form homodimers. We then generated fusion proteins of J-Flag, MC-GFP, and SLMBP21-Myc, and conducted co-immunoprecipitation (Co-IP) on protein extracts from tobacco leaves. The results showed that J, MC, and SLMBP21 could redily form a protein complex in vivo when expressed together, indicating that they may function as protein complexes.3.In situ expression analyses showed that SLMBP21, J, and MC were expressed with distinct patterns but overlapped in the incipient AZ vasculature which corresponds to the outmost L3 layer during early stages of flower development, providing an explanation for the important role that the outmost L3 taking in AZ development. Co-expression of the three genes also provides needed spatiotemporal conditions for their products to interact with each other.4. Further transactivation analysis using yeast cells showed that among SLMBP21, J, and MC, only SLMBP21 had a strong transcription activity. Therefore, SLMBP21 has a unique role in the SLMBP21/J/MC protein complex as the sole transcription activator.5. We then carried out a RNA-seq analysis on pedicels from the wild-type and antisense transgenic plants. Through comparison with published data for J and MC, we found seven AZ-specific genes that were down-regulated in any of the loss-of-function plant of SLMBP21, J, and MC, including a subset of meristem-related genes such as LeWUS, Blind (Bl), and Lateral suppressor (Ls). These results are in line with the notion that AZ cells may confer meristematic nature. These seven genes can be good candidatedownstream genes of SLMBP21/J/MC protein complex for AZ development and should be studied further. We also found that AZ development was a complicated process that required multiple pathways and signals.6. Phylogenetic analysis showed that SLMBP21 belonged to the FBP9/23 group of the LOFSEP supclade in SEP clade. Apart from SLMBP21, we also found proteins from other species of Solanaceae, Malus, and Pyrus in the FBP9/23 group. Since the FBP9/23 group is unique to Solanaceae and absent from Arabidopsis, the SLMBP21-mediated protein complex may represent a distinct molecular mechanism for plant AZ development.Overall, this work identifies a novel function for the MADS-box gene SLMBP21in tomato AZ development which can be potentially applied in tomato abscission manipulation. In light of the absence of SLMBP21-like genes in Arabidopsis, the mode of action of these genes in tomato may represent a distinguished mechanism for plant AZ development.Key word: SLMBP21, MADS-box protein complex, AZ development, tomato目录第一章引言 (1)1.1植物器官脱落研究进展 (1)1.1.1 离区的形态 (2)1.1.2 离区发育的分子生物学研究进展 (3)1.2MADS-box基因研究进展 (7)1.2.1 植物MADS-box基因的一般特性 (7)1.2.2 SEP亚族基因研究进展 (13)1.3本研究的意义,内容与技术路线 (13)1.3.1 本研究的意义和内容 (13)1.3.2 技术路线 (14)第二章番茄SLMBP21基因的全长获得与序列分析 (15)2.1实验材料 (15)2.1.1植物材料 (15)2.1.2实验中的各种试剂,酶,与耗材 (15)2.1.3 LB培养基和其它试剂的配制 (15)2.1.4 引物 (16)2.2实验方法 (16)2.2.1 SLMBP21 cDNA全长序列的获得 (16)2.2.2基因结构,蛋白结构,以及系统进化分析 (21)2.3实验结果与分析 (21)2.3.1 SLMBP21全长cDNA序列的获得 (21)2.3.2 SLMBP21蛋白序列分析 (22)2.3.3 SLMBP21基因结构分析 (23)2.3.4 SLMBP21的系统进化分析 (24)2.4讨论 (26)2.4.1 SLMBP21同J-2基因之间的关系 (26)2.4.2 SLMBP21功能研究的意义 (26)第三章离区发育的组织细胞学分析 (27)3.1实验材料 (27)3.1.1 植物材料 (27)3.1.2 实验中的各种试剂,酶与耗材 (27)3.1.3 试剂配制 (27)3.2实验方法 (27)3.2.1 组织包埋与切片 (27)3.2.2 石蜡切片染色 (28)3.3实验结果与分析 (29)3.4讨论 (31)第四章SLMBP21功能分析 (32)4.1实验材料 (32)4.1.1实验中所用植物材料与菌株 (32)4.1.2 实验中的各种试剂,酶与耗材 (32)4.1.3 各种试剂盒培养基的配制 (32)4.1.4 实验中所用引物 (34)4.2实验方法 (34)4.2.1 载体构建 (34)4.2.2 番茄转化 (39)4.2.3 阳性植株鉴定 (41)4.2.4 表型观察和组织细胞学分析 (41)4.2.5 乙烯处理 (41)4.2.6 Real-time PCR (42)4.3实验结果与分析 (42)4.3.1 SLMBP21-AS和LeMADS1-AS植株的获得与分析 (42)4.3.2 SLMBP21-RNAi 转基因植株的获得与表型分析 (46)4.3.2 SLMBP21过量表达转基因植株的获得和表型分析 (47)4.3.2 J过量表达植株的获得与鉴定 (52)4.4讨论 (54)4.4.1 SLMBP21参与离区形成过程 (54)4.4.2 SLMBP21通过影响细胞大小决定离区形成 (54)第五章SLMBP21,J和MC的互作关系分析 (55)5.1实验材料 (55)5.1.1 实验中所用菌株和烟草材料 (55)5.1.2 实验中的各种试剂,酶与耗材 (55)5.1.3 各种试剂和培养基的配制 (55)5.1.4 实验中所用引物 (57)5.2实验方法 (57)5.2.1 酵母双杂交 (57)5.2.2 BiFC(双分子荧光互补实验) (60)5.2.3 酵母三杂交 (61)5.2.4 CoIP(蛋白质免疫共沉淀) (62)5.3实验结果与分析 (66)5.3.1 SLMBP21,J和MC之间的转录调控关系分析 (66)5.3.2 酵母双杂交结果表明J,MC和SLMBP21之间可以发生两两互作 (67)5.3.3 双分子荧光互补实验验证了J,MC和SLMBP21之间的互作关系 (68)5.3.4 酵母三杂交 (70)5.3.5 蛋白质免疫共沉淀 (71)5.4讨论 (72)5.4.1 SLMBP21可能通过与J和MC形成蛋白复合体来影响离区发育 (72)5.4.2 J受MC的转录调控 (72)第六章SLMBP21, J和MC的表达模式分析 (73)6.1实验材料 (73)6.1.1 植物材料 (73)6.1.2 实验中的各种试剂,酶与耗材 (73)6.1.3 实验中所用引物 (73)6.2实验方法 (74)6.2.1 载体构建 (74)6.2.2 探针制备 (74)6.2.3 石蜡切片 (76)6.2.4 片子预处理 (76)6.2.5 杂交 (77)6.2.6 洗片及检测 (78)6.3实验结果与分析 (80)6.3.1 实验条件确定 (80)6.3.2 SLMBP21,J和MC表达模式分析 (80)6.4讨论 (83)6.4.1 SLMBP21,J和MC的表达模式各不相同但重叠于离区处的维管束 (83)6.4.2 SLMBP21和J的表达模式决定离区的位置 (84)第七章SLMBP21,J和MC的转录激活活性分析 (85)7.1实验材料 (85)7.1.1 菌株 (85)7.1.2 实验中的各种试剂,酶与耗材 (85)7.1.3 各种试剂的配制 (85)7.2实验方法 (85)7.3实验结果与分析 (85)7.4讨论 (86)第八章RNA-seq分析SLMBP21的下游基因 (87)8.1实验材料 (87)8.1.1 植物材料 (87)8.1.2 实验中的各种试剂,酶与耗材 (87)8.2实验方法 (87)8.2.1 实验流程 (87)8.2.2 标准信息分析流程 (88)8.2.3 数据处理 (88)8.3实验结果与分析 (89)8.3.1 差异基因的获得与分类 (89)8.3.2 GO功能富集分析 (89)8.3.3差异基因MapMan分析 (91)8.3.4 SLMBP21,J和MC共同调节的下游基因 (92)8.4讨论 (94)第九章全文结论 (95)参考文献 (96)附录 (111)致谢 (127)作者简历 (128)英文缩略表英文缩写英文全称中文名称AZ abscission zone 离区BiFC bimolecular fluorescence complementation 双分子荧光互补CoIP coimmunoprecipitation 免疫共沉淀Y2H yeast-two hybrid 酵母双杂in situ In situ hybridization 原位杂交SLMBP21-AS SLMBP21-antisense transgenic plant SLMBP21反义RNA转基因植株SLMBP21-OX SLMBP21-overexpression transgenic plant SLMBP21过量表达转基因植株Et ethylene 乙烯JA jasmonic acid 茉莉酸GA gibberellin 赤霉素BR brassinolide 油菜素内酯ABA abscisic acid 脱落酸3-AT 3-Amino-1,2,4-triazole 3-氨基-1,2,4-三氮唑PP The proximal section of pedicel 花柄近轴端DP The distal section of pedicel 花柄远轴端第一章引言器官脱落(organ abscission),是指植物细胞、组织或器官脱离母体的生理过程。