专题1-1-非洲紫罗兰悬浮细胞系的制备20120216

非洲紫罗兰原生质体的制备及不同组分培养基对细胞增殖的影响陈鑫;李骏;余汝媛;张扬;赖育菠;陈志宽;罗俊明;陆幸妍【期刊名称】《广东药学院学报》【年(卷),期】2012(28)5【摘要】目的探讨非洲紫罗兰(Saintpaulia ionantha)原生质体的制备方法,并比较不同组分培养基对原生质体再生及增殖的影响.方法以非洲紫罗兰愈伤组织制备悬浮细胞,以细胞生长曲线确定最佳培养时间,并将纤维素酶(cellulase R-10)和果胶酶(pectinase Y-23)按2∶1(质量比)混合分别酶解悬浮细胞18、21、24 h,比较原生质体得率和细胞活力以确定最佳酶解时间.分别以愈伤组织提取物、根尖提取物及培养土浸出物配制培养基培养原生质体16 d,观察原生质体细胞壁再生并比较细胞增殖率.结果悬浮细胞培养8d细胞增殖率最大,细胞活力93.8％；4％(质量分数)纤维素酶和2％(质量分数)果胶酶混合酶解21 h原生质体得率达到峰值,细胞活力为75.2％,延长至24 h后得率与21 h相比,差异无统计学意义,但细胞活力降至69.5％.以不同组分培养基培养原生质体,最早于第6天在愈伤组织提取物培养基中观察到再生细胞壁及细胞分裂；第16天,愈伤组织和根尖提取物培养基细胞增殖率显著高于原生质体基础培养基和培养土浸出物培养基,并以愈伤组织为佳,而培养土浸出物无促进作用.结论以非洲紫罗兰愈伤组织悬浮细胞培养8d并以4％(质量分数)纤维素酶和2％(质量分数)果胶酶混合酶解21 h能获得较多高活力的原生质体；愈伤组织提取物培养基能有效促进原生质体再生及细胞增殖.%Objective To investigate the preparation of Saintpaulia ionantha protoplast and effect of different cultures on its regeneration and growth. Methods Suspendedcells of Saintpaulia ionantha were made by the loose callus and cultured to determine the optimal cultivating time by means of its growth curve. Protoplasts were prepared with cellulase and pectinase mixed at a ratio of 2 to 1 , incubating for 18, 21 and 24 h, respectively, to obtain the best enzymolysis time by comparing the protoplast yields. Basic mediums were added with callus extracts, roots extracts and soil lixivium, respectively, to nurture Saintpaulia ionantha's protoplasts for 16 days. Results The rate of cell growth reached the highest, and the cell activity was 93. 8 % when suspension cells were cultured for 8 days; the maximum yield of protoplast was in 21 h under enzymolysising mixed with 4 % cellulase and 2 % pectinase and its activity was 75. 2 %. Cell walls and cell divisions were observed at the 6th day in culture medium added with callus extracts. The cell growths in callus extracts medium and roots extracts medium were significantly higher than in basic medium and soil lixivium, of which the best was callus extracts. And soil extracts couldn't promote the protoplast cell growth. Conclusion Highly active protoplasts of Saintpaulia ionantha can be produced when the suspended cells gained by the loose callus were cultured for 8 days, and then were enzymolysed by 4% cellulase and 2% pectinase for 21 h. Callus extracts medium could promote protoplasts' regeneration and growth.【总页数】5页(P497-501)【作者】陈鑫;李骏;余汝媛;张扬;赖育菠;陈志宽;罗俊明;陆幸妍【作者单位】广东药学院生命科学与生物制药学院,广东广州510006;广东药学院生命科学与生物制药学院,广东广州510006;广东药学院生命科学与生物制药学院,广东广州510006;广东药学院生命科学与生物制药学院,广东广州510006;广东药学院生命科学与生物制药学院,广东广州510006;广东药学院生命科学与生物制药学院,广东广州510006;广东药学院生命科学与生物制药学院,广东广州510006;广东药学院生命科学与生物制药学院,广东广州510006【正文语种】中文【中图分类】S567【相关文献】1.菌龄与培养基组分对曲霉原生质体释放的影响 [J], 王建华;赵学慧2.不同培养基对非洲紫罗兰组培苗生长及生根的影响 [J], 岑忠用;苏江;谢彦军;邓晰朝;高丽霞3.不同培养基组分对5个蜡梅品系花粉萌发和花粉管生长的影响 [J], 沈植国;孙萌;丁鑫;程建明;陈迪新4.不同培养基组分对牛支原体生长的影响 [J], 严明帅;徐业芬;张冯禧;索朗斯珠;牛家强5.不同组分、不同纯度中药复方多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖影响 [J], 李赞阳;刘红;李炳奇;孙萍;谷新利因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

非洲紫罗兰叶片组培快繁种苗及栽培技术汇报人：2023-12-08•非洲紫罗兰叶片组培快繁技术•非洲紫罗兰种苗的栽培技术•非洲紫罗兰叶片组培快繁技术的优化与改进•非洲紫罗兰叶片组培快繁种苗的繁殖与栽培实例•总结与展望01非洲紫罗兰叶片组培快繁技术叶片采集与处理01020304采集时间采集部位采集方法叶片处理消毒处理将消毒后的叶片切成1厘米×1厘米的小块，接种到MS或1/2MS培养基上。

接种培养基培养条件无菌接种与培养增殖培养与生根培养增殖培养在无菌条件下，将接种在培养基上的小块叶片转移到含有不同激素浓度的增殖培养基上，促使小块叶片增殖成更多的丛生芽。

生根培养当丛生芽长到一定数量后，将它们转移到含有不同激素浓度的生根培养基上，促使丛生芽生根。

炼苗移栽当组培苗根系发达、生长健壮时，进行炼苗移栽，使组培苗适应自然环境。

02非洲紫罗兰种苗的栽培技术基质选择基质制备栽培基质的选择与制备播种与移植播种时间移植水肥管理与环境调控浇水施肥环境调控03非洲紫罗兰叶片组培快繁技术的优化与改进温度控制在组织培养过程中，温度对细胞的分裂和生长具有重要影响。

一般来说，适宜的温度范围为25℃-30℃。

通过控制温度，可以促进细胞分裂和生长，提高组培效率。

光照调节光照是影响植物组织培养的重要因素之一。

适量的光照可以促进细胞的分裂和分化，有助于组织培养的成功。

然而，不同种类的植物需要的光照强度和时间各不相同。

对于非洲紫罗兰，一般需要提供12-16小时的光照，强度为1000-2000勒克斯。

营养供应在组织培养过程中，营养供应也是非常重要的。

非洲紫罗兰需要适量的氮、磷、钾等营养元素来支持其生长。

可以通过调整培养基中的营养成分来优化非洲紫罗兰的组织培养条件。

培养条件的优化物理防治化学防治病虫害防治提高成活率在将试管苗移栽到土壤中时，需要注意提高成活率。

可以将试管苗在温室中放置一段时间，然后逐渐适应自然环境。

在移栽后，需要保持土壤湿润，并提供适量的光照和温度。

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紫茉莉悬浮细胞培养体系的建立摘要：为建立紫茉莉(Mirabilis jalapa L.)悬浮细胞培养体系，以紫茉莉无菌苗叶片诱导的愈伤组织为材料，筛选紫茉莉悬浮细胞的适宜培养体系。

结果表明，紫茉莉愈伤组织在MS + 2,4-D 1 mg L–1+ KT 0.5 mg L–1的液体培养基中悬浮继代培养3 ~ 4次，能得到稳定的悬浮细胞系。

培养基的pH 值为5.5 ~ 5.9，蔗糖浓度为30 g L–1更适合悬浮细胞的生长。

紫茉莉悬浮细胞的生长曲线大致呈S 型。

最佳继代培养时间是10 d，培养液的体积为40 mL 时，接种量为7.5 mL，可以较好地保持悬浮细胞系。

1 L培养液中可提取分泌蛋白(0.42 0.15) g。

这些有助于对悬浮细胞提取分泌蛋白的研究。

关键词：紫茉莉；悬浮细胞；悬浮培养；分泌蛋白1 材料和方法1.1材料供试紫茉莉(Mirabilis jalapa L.)种子采自沈阳农业大学植物园。

按照白玉等的方法诱导培养紫茉莉愈伤组织。

取紫茉莉种子若干，冲洗剥皮后，用75% 乙醇浸泡8 min，0.1% 升汞消毒10 min，无菌水冲洗 4 次、浸泡1 h，剥掉内层种皮，接种于MS + NAA 0.1 mg L–1培养基中，在25℃，光照强度为12.5 ~ 25 mol m–2s–1的条件下培养，获得无菌苗。

将无菌苗叶片切成约0.5 cm x 0.5 cm 的小块，接种于MS + 2,4-D 1 mg L–1+ NAA 1 mg L–1+ KT1.5 mg L–1培养基上，在25℃，光照强度为12.5 ~25 mol m–2s–1条件下培养。

以上试验培养基的蔗糖浓度均为30 g L–1，琼脂为7 g L–1，pH 调至5.8。

2012年第47卷第4期生物学通报49培养基编号基本培养基类型6-BA （mg ／L ）KT （mg ／L ）NAA （mg ／L ）2，4-D （mg ／L ）芽萌动状况萌动时间（周）①MS 10.1萌动且量多3②MS 0.50.1萌动且量适中3③MS 0.10.1不萌动3④MS 0.20.1先生根后生芽3⑤MS0.50.10.1萌动且愈伤组织疏松3表1非洲紫罗兰叶片初代愈伤组织培养基的筛选非洲紫罗兰（Saintpaulia ionantha Wendl ）是苦苣苔科（Gesneriaceae ）的多年生草本，是一种室内观赏植物。

它株型紧凑，颜色五彩缤纷，叶绿色或暗红色，且厚实，室内栽培容易（不需强光，只需少许散射光即可正常生长及开花），花期长（一年四季能开花）、花色多（白、粉红、紫、青、双色），还有美丽的多纹平铺肉状叶，只要注意环境调节及水肥管理，可以常年花开不谢，有“室内花卉皇后”的美誉，居室内摆放有画龙点睛之效果，在国际盆花市场中极为流行。

非洲紫罗兰自90年代引入我国花卉市场以来，深受欢迎，并在许多大城市开始流行，深受花卉爱好者欢迎。

1材料与方法1.1材料取当年生发育健壮、长势旺盛的非洲紫罗兰整个叶片，在超净工作台内灭菌后，切取5mm ×5mm 大小接种启动诱导培养基上培养。

1.2方法诱导培养基:①MS +6-BA1.0mg/L +NAA0.1mg/L ；②MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L ；③MS +6-BA 0.1mg/L +NAA 0.1mg/L ；④MS +KT 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L ；⑤MS+6-BA 0.5mg/L ＋NAA 0.1mg/L+2，4-D0.1mg/L 。

继代培养基：用①、②、④。

生根与生长培养基：⑥1/2MS+NAA0.05mg/L ；⑦1/2MS+IBA 0.2mg/L ；⑧1/2MS+IBA 0.05mg/L 。

悬浮细胞传代及细胞计数一、细胞传代实验目的：掌握悬浮细胞传代技术.进一步掌握细胞培养的操作技术.实验原理：培养细胞生长一定时间后,需别离再培养,否那么细胞因生存空间不够,细胞密度过大,致营养缺乏而引起细胞发老、停止生长甚至死匚.为了维持细胞的存活和生长,必须进行再培养,即将原培养瓶内细胞别离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养.实验用品：〔一〕仪器净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱〔4C、-20 C、-70 C〕、倒置相差显微镜、培养箱；〔二〕玻璃器皿吸管〔弯头、直头〕、培养瓶、废液缸、〔三〕塑料器皿吸头、枪头、胶塞、移液管、15ml离心管、离心管架〔四〕其他物品微量加样枪、计数板、记号笔、移液枪〔五〕试剂1640培养液、PBS操作步骤：1 .准备：翻开培养液,PBS取出离心管,拧开管盖,管盖倒放.从吸管筒中依次取出吸管,装上吸头,插入离心管备用.2 .从培养箱内取出细胞,放在显微镜下观察其生长状态、密度.3 .首先观察培养板孔中培养液量.用吸管分别吸出两个孔中的细胞连同培养液, 转入离心管中.再另取一只吸管吸取PBS放入培养板孔中,轻轻吹打孔壁,吸出转入离心管.4,离心,设置离心机1000转/分,4-5分钟.5,取出离心管,轻轻吸出上清,倒入废液缸.吸取培养液约7ML放入离心管, 轻轻吹打细胞,使之均匀悬浮.6,吸取1ML细胞悬液1ML转入EP管中,备计数用.7.其余的细胞分别放入六个孔中,每孔约1ML8,吸取培养液参加板孔中至1/3孔容量.9.镜下观察细胞是否分布均匀,放入培养箱培养.二、细胞计数及生长曲线测定培养细胞生长过程：潜伏期-指数增生期-停滞期潜伏期(latent phase)细胞接种后,先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期.此时,细胞质回缩,胞体呈圆球形,然后细胞贴附于载体外表,称贴壁,悬浮期结束,细胞贴壁速度与细胞种类,培养基成分,载体的理化性质等密切相关.一般情况下,原代培养细胞贴壁速度慢,可达10-24小时或更多,而传代细胞系贴壁速度快,通常10-30分钟即可贴壁.细胞贴壁后还需经过一个潜伏阶段,才进入生长和增殖期,原代培养细胞潜伏期长,约24-96小时或更长,连续细胞系和月中瘤细胞潜伏期短,仅需6-24小时.(2)指数增生期(logarithmic growth phase)这是细胞增殖最旺盛的阶段,分裂相细胞增多.指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长是否旺盛的一个重要标志.通常以细胞分裂相指数( Mitotic index, MI)表示,即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数.一般细胞的分裂指数介于0.1%-0.5%,原代细胞分裂指数较低,而连续细胞和月中瘤细胞分裂相指数可高达3%-5%.指数增生期的细胞活力最好时期,是进行各种实验最正确时期, 也是冻存细胞的最好时机.在接种细胞数量适宜情况下,指数增生期持续3-5天后,随着细胞数量不断增多、生长空间减少,最后细胞相互接触集合成片.正常细胞相互接触后能抑制细胞运动,这种现象称接触抑制现象(contact inhibition).而恶性月中瘤细胞无接触抑制现象,能继续移动和增殖,导致细胞向三维空间扩展,使细胞发生堆积(piled up).细胞接触集合成片后,虽然发生接触抑制,但只要营养充分,细胞仍能进行增殖分裂,因此细胞数仍然在增多. 但是,当细胞密度进一步增大,培养液中营养成分减少,代谢产物增多时,细胞因营养枯竭和代谢产物的影响,导致细胞分裂停止,这种现象称密度抑制现象(Density Inhibition ).(3)停滞期(Stagnate phase)细胞数量到达饱和密度后,如不及时进行传代,细胞就会停止增殖,进入停止期. 此时细胞数持平,故也称平台期(Plateau phase ).停滞期细胞虽不增殖,但仍有代谢活动.如不进行别离传代,细胞会因培养液中营养耗尽、代谢产物积聚、pH下降等因素中毒,出现形态改变,贴壁细胞会脱落,严重的会发生死亡,因此,应及时传代.实验目的：1 .能独立的进行细胞技术,会绘制生长曲线,了解细胞生长的发育特性.2 .学习在科研中如何应用生长曲线实验原理：生长曲线的测定(计数法)是测定细胞绝对生长数的常用方法,也是判定细胞活力的重要指标,为培养细胞生物学特性的根本参数之一. 一般细胞传代之后,经过长短不同的潜伏期,即进入大量分裂的指数生长期.在细胞到达饱和密度后, 停止生长,进入平顶期,然后退化衰亡.为了准确描述整个过程中的细胞数目的动态变化, 需连续对细胞进行计数,通常计数7天.为精确起见,一般每次计数三瓶细胞并取平均值. 典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期,成平台状的平顶期及退化衰亡四个局部.以存活细胞数对培养时间做图,即生长曲线.生长曲线常用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响.一般在对数期的1/3-1/2处加药.细胞技术的时间和次数依实验目的而定.另外,测定生长曲线的常用方法还有MTTWo计数板原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时, 通过测定一定体积悬液中的细胞的数目,即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目.操作步骤：1 .将计数板及盖片擦拭干净,并将盖片盖在计数板,放在镜下观察.2 .制备细胞悬液：细胞从培养板孔转移到离心管, 离心1000转4-5分钟,弃去上清,参加PBS至一定体积(1MD.3 .将细胞悬液吸出少许,滴加在盖片边缘,使悬液充满盖片和计数板之间,静置3min,注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中.4 .计算板四大格细胞总数,压线细胞只计左侧和上方的.然后按公式计算：细胞数加1二四大格细胞总数/4 X 104说明：公式中除以4,由于计数了4个大格的细胞数.公式中乘以104由于计数板中每一个大格的体积为：1.0mm (长)x 1.0mm (宽)x 0.1mm (高)=0.1mm3而1ml=1000mm3(注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团, 应按单个细胞计算,假设细胞团10%Z上,说明分散不好,需重新稀释制备细胞悬液)台盼兰染色操作步骤：1、制备细胞悬液,放入EP管中.2、以1: 1的比例参加0.4%台盼兰染7取,染色2 — 3分钟.3、吸取少许悬液涂于载玻片上,加上盖片.4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数,计算细胞活力.冻存与复苏一、哺乳动物细胞冷冻保存实验目的：(1)保存种子细胞,以便随时取用.这是保存细胞的最主要目的(2)减少细胞被微生物污染的危险性.(3)减少细胞之间交叉污染的危险性.(4)减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变.(5)防止有限细胞系出现衰老或恶性转化.实验原理：细胞冻存及复苏的根本原那么是慢冻快融,实验证实这样可以最大限度的保存细胞活力.目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚碉作保护剂,这两种物质能提升细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤.复苏细胞应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化,防止由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤.实验用品：〔一〕仪器净化工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱〔4C、-20 C、-70 C〕、倒置相差显微镜、培养箱、液氮冰箱.〔二〕玻璃器皿吸管〔弯头、直头〕、培养瓶、玻璃瓶〔250ml、100ml〕、废液缸；〔三〕塑料器皿吸头、枪头、胶塞、移液管〔10ml〕、15ml离心管、冻存管〔1〜2ml〕〔四〕其他物品微量加样枪、红血球计数板、记号笔、移液枪.〔五〕试剂1640培养液、DMSO〔分析纯〕K562细胞,慢性粒细胞白血病细胞系中的一种.操作步骤：1 .准备：翻开培养液,PBS取出离心管,拧开管盖,管盖倒放.从吸管筒中依次取出吸管,装上吸头,插入离心管备用.2 .配制冻存液：吸取9ML培养液放入离心管,用移液枪吸取1MLDMSO?液,逐滴缓慢参加离心管中.最好把离心管插在冰中.3 .从培养箱内取出细胞,放在显微镜下观察其生长状态、密度.4 .吸出1个孔中的细胞连同培养液,转入离心管中.再另取一只吸管吸取PBS放入培养板孔中,轻轻吹打孔壁,吸出转入离心管.5 .离心,设置离心机1000转4-5分钟.取出离心管,轻轻吸出上清,倒入废液缸.轻轻吸出余下的培养液,注意勿吸出细胞沉淀.6 .吸取1ML配制好的冻存液参加离心管,与细胞混匀后,转入冻存管.7 .标注：标明细胞种类、冻存日期,冻存人.8 .在4 c冰箱中放置30分钟；然后转入-20 C ,放置30分钟；然后再转入-80 C 放置16- 18小时(或过夜)；最后放入液氮中长期保存.有条件的地方, 可用冻存盒. 考前须知：(1)冻存过程需缓慢(2)冻存细胞必须处在对数生长期,活力大于90% ,无微生物污染.(3)细胞浓度限制在：1 X 107 — 5 X 107/ml.(4)使用适宜的细胞冷冻保护剂,以保护细胞在冷冻过程中免受冰晶破坏.目前,最常用的冷冻保护剂是DMSOf甲基亚碉),使用终浓度为5—10%.但是, 有些细胞系不能用DMSO为冷冻保护剂,如人白血病细胞系HL-60.由于,DMSC^ 诱导HL-60细胞分化.在这种情况下,可选用其它冷冻保护剂,如甘油(glycele ), 羟乙基淀粉等.(5) DMSO释时会释放大量热量.因此,DMSO^能直接加到细胞液中,必须事先配制.细胞复苏操作步骤：(一)准备工作1、37c水浴2、准备一个内装5-10 ml细胞完全培养液离心管.(二)复苏1、带手套,用银子将细胞冷冻管从液氮中取出,迅速放入37c水浴中,手持冻存管不断摇动.观察完全解冻后移入超净台.冷冻管在水浴中解冻时,液面不可超过冻存管盖面,否那么,易发生污染.2、翻开冻存管,迅速将细胞悬液吸到离心管中,轻轻混匀.3、1000rpm离心5 min ,弃去上清液.4、沉淀中参加适当培养基,37c常规培养,第二天观察生长情况.考前须知：1 .解冻操作过程动作要轻.由于冷冻保存过的细胞变得非常脆弱,不仅解冻速度要快,而且动作要轻.2 .解冻时务必注意平安,预防冷冻管爆裂.,要带手套,用银子将细胞冷冻管从液氮中取出,切不可直接用手,以免冻伤.。