不用爬片的免疫荧光实验方法-雷萌生物

免疫荧光技术实验步骤及方法免疫荧光是标记免疫技术发展最早的一种，它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，通过将抗体与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。

10个关键点免疫荧光步骤包括，细胞固定和通透，封闭，孵育一抗，二抗等。

除了这些基本步骤，以下建议可以帮助您获得更好的实验结果。

1、选择合适的细胞种板密度细胞数过多时，生长过密，细胞结构不清，易导致染色背景深，细胞数过少时，会使贴壁贴壁不佳，状态不好，一般以六孔板为例，（1-5）×100000比较适宜。

2、细胞固定和通透为达到最佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。

这些步骤非常关键，细胞和抗原需要保证最佳的结构，并利于抗体与抗原结合。

现在固定液选择比较多，有4%多聚甲醛、甲醇、乙醇、丙酮以及丙酮和甲醇混合液（1：1），但效果最好的应用最多的还是推荐4%多聚甲醛。

之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100进行通透。

前者是比较温柔的处理，但是对于核内抗原可能无效，需要用到Triton。

使用皂角苷进行通透时，要注意它会引起细胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每个抗体孵育环节都需要进行通透。

另外，细胞可以用冰甲醇进行同时固定和通透，可以避免去垢剂的使用。

3、抗体特异性免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体，可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果。

在大多数情况下，纯化抗体的效果很好，但是正确的对照可以帮助精准定位抗原。

使用只有二抗染色的片子作为阴性对照，有利于减少降低背景干扰。

4、合适的抗体稀释比例通过优化抗体稀释比例来优化染色，通常情况下1ug/ml的纯化抗体或者1:100-1:1000的抗血清足够达到特异性染色的结果。

但在能保证低背景染色的前提下，可以通过增加浓度来提高信号强度。

如果是第一次使用该抗体或测定某抗原，强烈建议浓度梯度实验。

5、优化缓冲液和封闭剂尽管很多抗原在常见的Buffer如PBS中可以很好的被染色，但是对于某些目的抗原，更换一下含有不同离子的缓冲液，比如钙、镁、钾等，可以带来很大程度上的改善。

【ibidi--focus on cells】通道载玻片--新的免疫荧光方法细胞的免疫荧光实验是一个基础的细胞实验，传统的方法是在培养板中放入预先处理好的盖玻片，待细胞贴壁后，使用镊子将盖玻片拿出再开始进行固定，染色等系列工作。

现在分享一种简便的免疫荧光方法，无需爬片，培养-操作-镜检，在一个培养皿/载玻片上完成所有工作！一气呵成！使用如图的培养皿和载玻片，免疫荧光步骤将简化为：1.直接细胞培养2.冲洗玻片/培养皿3.固定细胞4.冲洗玻片/培养皿5.染色6.冲洗玻片/培养皿7.冻存液处理细胞8.直接镜检观察免去了指甲油封片的传统免疫荧光方法中的冗长步骤：1.无需对盖玻片和载玻片消毒灭菌2.无需对盖玻片进行包被3.无需等细胞爬片4.无需指甲油封片之所能如此简便完成免疫荧光实验，是因为这些ibidi培养皿和载玻片的底部为特殊处理的材质，绝大多数细胞可以直接贴壁生长，而不需要另外包被。

同时，这些耗材的底部薄如盖玻片，可以直接使用倒置显微镜进行观察，得到高质量的成像，适用于高端显微镜比如共聚焦显微镜。

成像效果：下面再分享一种极致的免疫荧光方法，不仅更加简化实验步骤，而且可以节约试剂和细胞，同时还能得到更出色的成像效果。

如图的ibidi通道载玻片，简单快速完成免疫荧光实验。

步骤：培养-固定-染色-镜检，只需在这个载玻片上进行4个步骤，免疫荧光实验轻松完成~ 优点总结：1、节约细胞和试剂ibidi通道载玻片里的通道只有400μm高，以μ-slide VI为例，通道的容积只有30μl，而普通8well的腔式载玻片一个孔的容积有300μl。

这意味着通道需要的试剂和细胞量仅需约十分之一！对于非常珍贵的细胞和试剂来说，这可是非常重要的。

2、成像效果好使用通道载玻片时，能在相差显微镜下获得更好的成像效果。

因为通道上下都是平坦的，不会因为凹液面的折射现象影响到相差显微镜成像。

而well式的开放小室的相差成像会受到培养皿盖和液面的折射现象影响。

免疫荧光实验——iPSC-derive神经元的体外神经毒性检测如今神经毒性检测主要是依赖活体动物实验，不仅有伦理问题，而且通常非常昂贵并且十分耗时。

当需要大规模的测试化合物的时候就不太合适了。

因此，高通量的体外的神经毒性测试就显得十分必要了，而且可以使用人源的细胞直接进行试验，试验结果的实用性也更佳。

但是，到目前为止，人源干细胞诱导的神经元并没有适合进行这类试验的特质，试验时间较长，批次间差异大，并且有收到伦理和一些法律的制约，使得这种细胞都不太适用于做大规模的体外测试试验。

最近，市面上出现了商用的人源iPSC-derive神经元细胞，重复性好，可以用来做这类的体外神经毒性试验。

荷兰的科学家使用人源iPSC-derive神经元细胞做了免疫荧光染色试验，作为高通量进行体外的神经细胞毒性检测的预试验。

由不同供应商提供的人源iPSC-derive神经元细胞混合培养能够形成不同（激活型或抑制型）神经元共培养的样本。

ALTEX. 2016 Mar 24. doi: 10.14573/altex.1510091Is the time right for in vitro neurotoxicity testing using human iPSC-derived neurons?Tukker AM1, de Groot MW1, Wijnolts FM1, Kasteel EE1, Hondebrink L2, Westerink RH1.一、实验材料1）细胞：iCell® Neurons（NRC-100-010-001，Cellular Dynamics international）CDI iCell® Astrocytes（Cellular Dynamics international）HIP neurons (GSC-4312, MTI-GlobalStem)DOPA.4U® neurons (Axiogenesis, Cologne, Germany)2）培养基：Complete iCell Neurons Maintenance Medium (with 2% iCell Neurons Medium Supplement) supplemented with laminin (10 μg/mL)3）试剂：Poly-L-Ornithine （[PLO] 0.01%）4）培养耗材：µ-Slide 8孔腔室载玻片，ibiTreat底部处理（ibidi，Germany，80826）二、实验方法一）载玻片包被①每孔加入300μl 的0.01%的Poly-L-Ornithine 溶液②室温孵育60分钟③吸除所有液体并小心用PBS冲洗5-10分钟，即可开始使用二）免疫荧光实验1）铺细胞：iCell® Neurons 每孔铺100000个细胞iCell® Neurons/CDI iCell® Astrocytes共培养，每孔铺66000个细胞HIP neurons每孔铺100000个细胞DOPA.4U® neurons每孔铺52000个细胞DOPA.4U® neurons/iCell® Astrocytes共培养，每孔铺48000个细胞2）加入约300μl/孔的4%多聚甲醛的PBS溶液，静置15分钟3）加入300μl 1% Triton® X-100 的PBS 溶液通透3-5分钟4）加入300μl 2% BSA的PBS溶液封闭20分钟5）依次加入一抗，二抗进行免疫荧光染色后，冲洗小室并加入封片液进行显微镜观察（图二）。

细胞免疫荧光步骤方法一：1. 首先需要把细胞养在玻璃片上（悬浮细胞需要用多聚赖氨酸包被过的玻璃片）2. 然后在 4％PFA 里面室温下固定 30 分钟， PBS 洗两次， 0.1% TX-100 室温下作用 1－2 分钟使细胞膜通透。

3. 接下来进行荧光标记，需要在一个大的容器（面积大，扁平状的，比如大的培养皿）里面，放一张用水打湿的滤纸，以保持湿度。

4. 剪一片合适大小的parafilm ，在上面滴上稀释在1％BSA/TBS 中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定），每个玻璃片 30ul 足够，把玻璃片盖在上面（细胞面朝下），室温下孵育 30 分钟，然后在 PBS 里洗三次。

5. 接下来二抗孵育步骤同上。

6. 最后，在载玻片加上mounting medium （大约每个玻璃片加10ul）,把玻璃片放上去（细胞面朝下）， 37 度 30 分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。

7. 抗体很重要，不能有非特异性结合。

你可以先做 WB 检测一下你的抗体，看看有没有杂带。

8. 双标的话，可以把两个一抗一起加或者分别标记两次（可以都试一下看看那种方法合适）。

如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的，可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。

方法二：1. 选取一抗时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit 和 rat 的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC （绿）和donkey anti-rat-Tex-Red （红）。

2. 我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。

抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗 4 度孵育过夜比较好，背景比较清晰。

3. 我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。

4. 封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10%的正常donkey 血清。

5. 其余步骤同一般免疫荧光单标操作。

免疫荧光技术操作步骤一. 直接免疫荧光法测抗原基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。

其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。

试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4 的PBS 进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液1 份配制搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4 的PBS 1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸37℃温箱等。

实验步骤1. 滴加0.01mol/L，pH7.4 的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。

2. 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一30min定时间（参考：30min）。

3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4 的PBS 冲洗后，再按顺序过0.01mol/L，pH7.4 的PBS 三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。

4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。

5. 立即用荧光显微镜观察。

观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮。

待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。

注意事项1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在1：20-100 之间，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。

2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min 到数小时，一般30 min 已足够。

三种细胞免疫荧光染色操作步骤免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。

zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。

2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。

注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。

洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。

2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。

3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。

4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。

5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。

6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。

7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。

8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。

免疫荧光染色的主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，荧光显微镜下即可观察到荧光，下文主要列举了三种细胞免疫荧光染色的实验步骤。

zo-1的免疫荧光，步骤如下：1、细胞在盖片上生长融合到95%-100%时，从孵箱中取出。

2、用预温的1×PBS洗3次，每次10分钟3、4%的甲醛室温固定20-30分钟4、1×PBS洗3次，每次10分钟5、0.2%Triton X-100透化2-5分钟6、1×PBS洗3次，每次10分钟7、5%BSA室温封闭30分钟8、加一抗(用1%BSA稀释)放在湿盒里，4度过夜9、1×PBS洗3次，每次10分钟10、加二抗(用1%BSA稀释)30分钟，闭光11、1×PBS洗3次，每次10分钟12、95%甘油封片注：4%甲醛，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀释从大鼠分离的T细胞能否直接做细胞免疫荧光细胞爬片的免疫荧光步骤基本一致：1.取出细胞爬片放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍。

注意：有的时候作的细胞爬片可能比较小，因此夹取的时候要小心，注意反正面，放在皿里洗比较方便，避免了来回夹取，另外洗的时候加PBS不要太冲，不要细胞冲下来。

洗的时候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，没有等5分钟或10分钟。

2. 4%冷的多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三遍。

3. 0.2%Triton X-100通透10分钟，PBS洗三遍。

4. 与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。

5. 一抗4度湿盒内过夜，也可37度2小时，感觉前者效果好，PBS洗三遍。

6.二抗室温2小时(避光)，或者37度1半小时，PBS洗三遍。

7.最好用DAPI染核，然后直接照荧光片。

8.蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因为甘油不象树脂那样会干，所以不用指甲油封的话会弄的一塌糊涂。

免疫荧光(Iｍmunoflｕoresｃeｎcｅ, IF)实验方法免疫荧光技术就是在免疫学、生物化学与显微镜技术得基础上建立起来得一项技术、它就是根据抗原抗体反应得原理,先将已知得抗原或抗体标记上荧光基团,再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内得相应抗原(或抗体)。

利用荧光显微镜可以瞧见荧光所在得细胞或组织,从而确定抗原或抗体得性质与定位,以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。

免疫荧光实验得主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。

细胞片制备(通俗得说法就是细胞爬片)就是免疫荧光实验得第一步,细胞片得质量对实验得成败至关重要,原因很简单,如果发生细胞掉片,一切都无从谈起。

这一步关键得就是玻片(Ｓｌiｄes or Cｏverslips)得处理以及细胞得活力,有人根据成功经验总结出许多有益得细节或小窍门,非常值得借鉴、固定与通透步骤最重要得就是根据所研究抗原得性质选择适当得固定方法,合适得固定剂与固定程序对于获得好得实验结果就是非常重要得、免疫荧光中得封闭与抗体孵育与其它方法(如ＥLＩＳA或 Wｅsｔeｒn Ｂｌot)中得相同步骤就是类似得,最重要得区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体,因此必须谨记避光操作,此外抗体浓度得选择可能更加关键。

最后需要注意得就是,标记好荧光得细胞片应尽早观察,或者用封片剂封片后在４℃或－20℃避光保存,以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果、由于操作步骤比较多,同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量得大小区分非特异性识别,所以要得到一个完美得免疫荧光实验结果,除了需要高质量得抗体,以及对实验条件进行反复优化外,还必须设立严谨得实验对照、总之,免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后得封片及观察拍照,每步都非常关键,需要严格控制实验流程中每个步骤得质量,才能最终达到您得实验目得。

基本实验步骤:(1) 细胞准备。

免疫荧光的操作方法
免疫荧光是在细胞或组织中，利用特殊成分将蛋白质抗体与荧光染料结合在一起，产生荧光标记，用来可视化受体的技术。

以下是免疫荧光的一般操作方法：
1. 样品的制备：在进行免疫荧光前，需要对样品进行制备，包括固定、包埋、切片等。

2. 抗体标记：选用特异性抗体，并将它们标记成与荧光染料等可视化试剂结合的格式，如荧光分子、酶、金粒子等。

3. 样品的处理：在进行免疫荧光实验时，需要将样品进行特定的处理，如孵育在抗体或底物中。

4. 光学显微镜：使用荧光显微镜或共聚焦显微镜等可视化技术，观察标记物的分布和数量。

5. 数据分析：使用特定的软件分析图像，帮助确定荧光强度、荧光标记的数量等。

总之，免疫荧光是一项十分繁琐的技术，在实验中需要严格控制各个步骤，才能获得可靠的实验结果。

免疫荧光技术实验的常用方法免疫荧光技术(Immunofluorescence technique )，又叫做荧光抗体技术，其主要的实验原理是抗原与抗体能够特异性结合，通过之间的化学反应使得标记抗体的荧光素显色来确定组织细胞内的目标抗原（多肽和蛋白质），并对其进行定位、定性及定量研究的一类方法，该技术也是标记免疫技术中发展最早的一种。

免疫荧光实验主要的实验步骤有三步：首先是抗原片的制作，接下来是试验类型，最后是荧光显微镜检查。

抗原片的制作分为标本组织的制作和样品固定，试验类型分为直接法、间接法、补体结合法等。

其中细胞滴片的间接免疫荧光法属于免疫组化方法的一种，可用于抗体、抗原的定性、定量及定位检测，也是目前使用最为广泛的一种实验技术。

从相关的文献中很容易找到其操作步骤，但是由于很多实验室的条件有限，通常实验无法正常进行。

此外，其他的免疫荧光技术还有流式细胞仪、时间分辨免疫荧光技术、荧光偏振免疫分析技术、时间分辨荧光免疫测定、荧光偏振免疫分析技术等。

手机微信“扫一扫”，更多学术齐分享！免疫荧光技术实验过程中改进的小窍门免疫荧光技术实验过程中往往对实验条件要求较高，所以在具体的操作过程中根据现有条件及实验要求对实验做一些改进、简化，既省力又省钱，同样可以达到预期效果。

该实验对玻片的清洁度要求很高，因此在玻片的选择和处理时要格外注意，只能使用干净的普通玻片或有凹孔的玻片。

在用普通玻片制作细胞滴片时，通常需要采用盐酸浸泡、乙醇清洗处理等方法保证玻片的清洁。

要使得细胞悬液在玻片上充分固定，需要用PBS缓冲液洗涤，只有这样样品烘干后才能显示印迹。

当向印迹滴加试液和二抗后，伊文斯兰将样本染成肉眼可见的蓝色，荧光观察时也极易找准观察位置。

当然，用专门进行免疫荧光操作的凹孔玻片效果更好，但是成本较高。

此外在粘片剂的使用方面，可以使用直接细胞滴片法代替蛋白甘油，直接滴片样本有较好的附着力，避免使用费劲的粘片剂，还能简化实验步骤、节省经费支出。