细胞和分子生物学的研究方法

Southern杂交: 是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。

将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。

RNAi技术: 是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。

Southern杂交 一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量]。

扫描电镜技术：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。

细胞显微分光光度计：用来描述薄膜、涂层厚度超过1微米的物件的光学性能的显微技术。

免疫荧光技术：将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。

电镜超薄切片技术：超薄切片是为电镜观察提供极薄的切片样品的专门技术。用当代较好的超薄切片机，大多数生物材料，如果固定、包埋处理得合适，可以切成50-100微米的超薄切片。

Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。

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实用文档. 常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍 (2021-04-23 11:01:29)转载▼

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常用的分子生物学根本技术

核酸分子杂交技术

由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的根本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其根本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下〔适宜的温室度及离子强度等〕可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针〔probe〕,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。

固相杂交

固相杂交〔solid-phase hybridization〕是将变性的DNA固定于固体基质〔硝酸纤维素膜或尼龙滤膜〕上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。

斑步杂交〔dot hybridization〕

是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后参加过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永别离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。

印迹杂交〔blotting hybridization〕

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实用文档. Southern印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反响，用放射性自显影或酶反响显色，检测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析〔RELP〕等。

第五章 分子生物学研究方法

本章主要内容：

1、重组DNA技术概念及操作步骤

2、工具酶与载体

3、DNA操作技术（转化、阳性克隆的筛选、cDNA文库的构建、PCR等）

4、基因克隆技术

5、基因表达技术

6、蛋白质表达技术

一、 重组DNA技术发展史

从1909年丹麦遗传学家W.Johannsen开始将孟德尔的遗传因子命名为基因到现在出现的克隆羊“多莉”，分子生物学的发展出现了划时代的突破和历史性变革，它已成为生命科学的领头学科。以分子生物学为理论基础，以重组DNA技术为主导的生物技术已日益渗透入农林牧副渔、医药、食品、石油、化工等应用领域，正在取得不可估量的经济和社会效益。让我们回顾一下分子生物学发展史上的重大事件，这样会使我们更加理解重组DNA技术的诞生是历史发展的必然结果。

（一）重组DNA技术诞生的理论基础

随着分子生物学的发展，许多生命的基本现象实质和遗传的奥秘逐渐被揭开神秘的面纱。分子生物学发展史上的三方面成就为重组DNA技术的诞生奠定了坚实的理论基础。

1、年代明确了遗传的物质基础是DNA

1994年O.Avery及其同事们用光滑型（S）和粗糙型（R）两种肺炎球菌的菌株做实验。他们从S型菌的培养物中提取DNA，将其在试管内与R型菌混合，再接种到培养基里，所长出的部分菌落变成了S型，这样的现象称为“转化”。他们发现，加入各种蛋白水解酶，对转化无影响；但加入少量提纯的脱氧核糖核酸酶（DNase）后，转化很快消失，说明引起细菌遗传性状改变的物质是DNA，而不是蛋白质，从而证实了遗传物质是DNA。

2、 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制，解决了基因的自我复制和遗传信息传递问题

在DNA的双螺旋结构建立之前，E.Chargaff已从不同生物来源的DNA中分离出四种碱基，即腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）。他们发现腺嘌呤的量总是和胸腺嘧啶一样（A=T），而鸟嘌呤的量也总是和胞嘧啶一样（G=C），并称之为碱基配对。而（A+T）/（G+C）的比值随不同来源的DNA而有所不同。另外M.Wilkins等已对DNA进行X衍射研究，阐明了有关结构、螺旋性质、线形分子直径、相邻碱基之间的距离等情况。

一、章（节、目）授课计划 第 页

授课章节名称 第三章 细胞生物学研究方法 授课

时数 2

教

学

目

的 1、使学生掌握细胞形态结构的观察方法，了解主要工具，侧重掌握基本原理和基本应用

2、了解细胞组分的分析方法及细胞培养

3、了解细胞工程技术

教

学

要

求 1、掌握细胞形态结构的观察方法，掌握光学显微镜技术

2、了解细胞组分的分析方法及细胞培养

3、了解细胞工程技术

教

学

重

点 1、细胞形态结构的观察方法

2、细胞组分的分析方法及细胞培养。

教

学

难

点 1、观察细胞形态的主要方法及工具的介绍。

2、细胞组分的分析方法

教学

方法与手段 讲授法、 互动讨论法

作业与

思考题 部分课后作业

阅读

书目或参考

资料 1、《细胞生物学》（第3版）(翟中和等)(高等教育出版社)（2009）

2、《细胞生物学进展》（郑国錩等）（高等教育出版社）（1994）

3、《分子细胞生物学》（韩贻仁）（高等教育出版社）（2007） 教

学

后

记

二、课时教学内容 第

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教 学 内 容 小结 技术的进步在一门学科的建立与发展过程中起着巨大的作用。没有

显微镜的发明就没有细胞的发现，更不会有细胞学说的建立，没有电子显微技术及其分子生物学技术的结合，就不会有细胞生物学今天的发展。

细胞生物学研究方法：一般来说，凡是用来解决细胞生物学问题所采用的方法，都属于细胞生物学研究方法。当前细胞生物学研究中常用到的方法有:核酸和蛋白质成分的分析和序列测定、研究特异DNA、RNA常用的southern杂交、Northwre杂交及蛋白质免疫印迹技术、基因打靶技术等等。

第一节 细胞形态结构的观察方法

一、有关显微镜的一些概念

（1）分辨率（resolution）：指分辨物体最小间隔的能力。

光学显微镜的分辨率 R=0.61λ/N．sin（α/2）．