质粒DNA提取方案(碱裂解法)

SDS碱裂解法制备质粒DNA步骤（1）挑取转化后的单菌落，接种到2ml的含有适当抗生素的丰富培养基中，37℃振摇培养过夜（培养物的体积小于溶液体积的1/4，否则容器不易盖紧，剧烈振摇培养）（2）收菌，将菌液倒入离心管中，4℃，12500r/min，3min。

（离心后将上清液倒入费废液缸中，倒扣在吸水纸上，若还有液体残留，用移液枪吸出）（3）将细菌沉淀重悬于100μl的预冷的碱性裂解液I（Glu, EDTA, Tris-Hcl）中，涡旋振荡。

（4）加200μl新配置的碱性裂解液II(0.2M NaOH,1%SDS)于每管细菌重悬液中，盖紧管口，快速颠倒离心管5次以混合内容物，切勿振荡，将离心管放置在冰上3-5min. （5）加150μl预冷的碱性裂解液III（CH3COOH,CH3COONa），盖紧管口，反复颠倒数次，使得溶液在粘稠度额细菌裂解物中分散均匀。

冰上防止3-5min。

（6）离心（4℃，12000r/min，6min），并将上清转移到另一个离心管中。

（7）在通风橱内加400μl的氯仿：异戊醇（24:1）（8）抽提：将管放在漂浮板上，划8字8min，后离心（4℃，12000r/min,7min），吸取上清液300μl到另一个离心管中。

（9）加无水乙醇600μl，混匀放置在-20℃沉淀15min，后离心（4℃，12000r/min,15min）（10）小心吸去上清液，将离心管倒置在吸水纸上，加70%乙醇700μl洗涤沉淀，弹起沉淀，浸泡一会，离心（4℃，12000r/min,4min），洗涤两次。

（11）倒掉上清，甩一下，吸去上清，晾干。

（12）TRE溶解（1mlTE，1μlRNA酶）20μl/管。

（13）65℃15min，后4℃冰箱保存。

碱裂解法提取质粒DNA的研究碱裂解法是一种常用的提取质粒DNA的方法。

该方法通过将大肠杆菌等细菌细胞进行碱性处理，使其细胞壁溶解，并释放出质粒DNA。

以下是对碱裂解法提取质粒DNA的研究进行详细介绍。

首先，进行实验前的准备工作。

实验材料包括大肠杆菌含质粒的培养液，碱性裂解液，中和液，以及一些常规实验室工具。

准备条件优化的培养基，如Luria-Bertani培养基，以获得高质量的质粒DNA。

将培养的大肠杆菌细胞进行离心，取得细菌细胞的沉淀，并将其重悬于适量的碱性裂解液中。

碱性裂解液的配制对提取质粒DNA的质量具有重要影响。

通常，碱性裂解液包括Tris-HCl缓冲液（pH 8.0-8.5）、EDTA （0.1M，pH 8.0）以及SDS（0.5%-1.0%）。

在碱性裂解液中，细胞壁受到破坏，并且其中的DNA被释放出来。

为了进一步提取质粒DNA，需要添加RNase A（最终浓度为20μg/mL）来降解细胞中的RNA。

此外，可以根据需要添加蛋白酶K（最终浓度为100μg/mL）来去除大部分的蛋白质。

接下来，使用酒精沉淀法来纯化质粒DNA。

首先，加入等体积的冰冷异丙醇，使DNA和异丙醇充分混合，然后进行离心。

在高速离心后，离心管底部会形成一个白色的DNA沉淀。

利用移液枪将上层液体倒掉，然后用70%的乙醇洗涤DNA沉淀，移液枪将乙醇沉淀洗涤掉。

最后，利用离心机将样品离心至全速，将乙醇溶液除去，并风干沉淀。

最后，使用合适的缓冲液溶解DNA，以达到所需的浓度。

为了确定提取的质粒DNA的纯度和浓度，可以使用紫外光谱仪来测定其260nm和280nm的吸光度比值。

这个比值可用于评估质粒DNA中的蛋白质污染情况。

如果蛋白质污染特别严重，可以使用氯仿、酒精沉淀等方法进行进一步清除。

此外，还可以使用琼脂糖凝胶电泳来检测提取的质粒DNA的大小和完整性。

通过比较不同样品的DNA迁移位置，可以快速确定质粒DNA的大小。

总结：碱裂解法是一种非常常用且简单的提取质粒DNA的方法。

质粒DNA的提取方案一常规小量提取(碱裂解法)【实验目的】(1)掌握碱裂解法小量提取质粒DNA的原理及操作过程。

(2)掌握微量加样器的使用方法。

【实验原理】在NaOH存在的碱性环境(pH值12.0～12.6)中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA由于分子量小且缠绕紧密，仍为自然状态。

将pH值调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA恢复可溶状态的。

通过离心，去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质等物质，上清液中的质粒DNA可用酚/氯仿抽提。

【实验试剂】(1)溶液I:50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-HCl(pH值8.0)10mmol/LEDTA(pH值8.0)溶液I可成比配制，每瓶约100ml,在6.9×10°Pa(10lbf/in²)高压下蒸汽灭菌15min,贮存于4℃下。

(2)溶液Ⅱ:0.2mol/LNaOH(临用前用10mol/L贮存液稀释)1%SDS(3)溶液Ⅲ:5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml(4)酚(pH值7.8～8.0)。

(5)氯仿。

(6)TE缓冲液。

(7)6×DNA上样缓冲液。

(8)0.8%琼脂糖。

(9)无水乙醇。

【实验器材】(1)低温高速离心机。

(2)旋涡振荡器。

(3)Eppendorf管(EP管)。

(4)微量移液器。

(5)移液器头。

(6)电泳仪与电泳槽。

(7)紫外透射仪。

【实验样本】细菌(含某种质粒)。

【实验步骤】(1)将5ml菌液分次装入同一1.5mlEP管中，3000r/min离心5min,以收集菌体。

(2)将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡5min。

(3)加200μl新配制的溶液Ⅱ,盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物，不可强烈振荡，放置于冰上3min左右。

质粒DNA的提取（碱裂解法）实验原理：碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。

在pH 值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。

当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。

通过离心，染色体DNA 与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。

提取步骤：1.吸取1.5mL菌液于1.5mL离心管中，4℃下12000rpm离心2min，吸干上清液，使细菌沉淀尽可能干燥2.加入100μLSolutionⅠ，枪头充分打匀，使细胞重新悬浮。

此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率3.加入200μL新配制的SolutionⅡ，轻柔颠倒混匀（千万不要振荡），冰上放置至清亮（小于5min）。

这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。

4.加入150μL solutionⅢ，颠倒混匀（温和振荡10秒），使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀冰浴10min，使杂质充分沉淀5.4℃下12000rpm离心15min，小心将上清转至新的1.5mL离心管中6.加入6μL 10μgl/μL的RaseA，混匀，37℃温浴30min。

7.等体积TriS饱和酚:氯仿:异戊醇(25:24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中8.等体积氯仿:异戊醇(24:l)抽提1次，小心将上清吸至新的 1.5mL离心管中9.加入2.5倍体积的冰冻无水乙醇，冰浴0.5-1h，沉淀双链 DNA。

碱裂解法提取质粒DNA的实验原理和操作步骤碱裂解法是一种常用的方法，用于提取质粒DNA（plasmid DNA）纯化。

以下是具体的实验原理和操作步骤。

实验原理：碱裂解法利用碱性溶液将细菌细胞的细胞壁和细胞膜溶解，使细菌细胞内的质粒DNA被释放出来。

接着，使用中性化剂中和碱性溶液，使DNA带正电荷，而细胞中的蛋白质则带负电荷，从而能够通过离心将DNA与蛋白质分离。

最后，通过浓缩、洗涤和纯化，得到高质量的质粒DNA。

操作步骤：1.培养细菌：选取含有质粒DNA的细菌菌株，如大肠杆菌。

在含有适当抗生素的培养基中培养细菌菌株。

2.收获细菌：当菌液呈现较稠的浑浊状态时，收取细菌培养物。

使用离心机将菌液离心，分离菌体沉淀和上清液。

将上清液倒掉，保留菌体沉淀。

3.碱裂解：将菌体沉淀溶解于碱性溶液中，如盐酸和十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。

轻轻混合并将溶液放入水浴中加热，使细菌细胞壁和细胞膜被溶解。

4.中和：使用中性化剂，如醋酸，使溶液中的酸性物质中和。

这样可以确保DNA带正电荷，而蛋白质和其他污染物则带负电荷。

5.离心：将溶液离心，在离心过程中，DNA会与细胞内其他分子分离，形成一个DNA沉淀。

上清液中含有蛋白质和其他污染物。

6.洗涤：使用洗涤缓冲液，如乙酸盐缓冲液，洗涤DNA沉淀，去除残留的污染物。

7.纯化：用去离子水溶解DNA沉淀，使其溶解在水中。

将溶解的DNA沉淀通过滤纸等过滤装置过滤掉残余杂质。

8.浓缩：通过酒精沉淀法或其他方法，将DNA溶液浓缩到所需的浓度。

9.检测：使用紫外分光光度计等方法，测定提取的质粒DNA的纯度和浓度。

注意事项：1.在实验过程中保持操作环境和仪器无菌。

2.碱裂解法中使用的溶液需准备新鲜，并避免受到污染。

3.操作过程中需要低温处理和离心操作，以保护DNA的完整性。

4.质粒DNA的提取可以根据实验目的进行进一步的扩增、测序或转染等应用。

总结：通过碱裂解法，可以从细菌中提取纯化的质粒DNA。

质粒DNA的提取一、实验方法碱裂解法抽提质粒DNA二、实验原理基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。

三、实验步骤1）质粒提取1. 10,000g,1min离心收集1.5－5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。

2. 加入100μl溶液1，振荡至彻底悬浮。

3. 加入200μl溶液2，立即轻柔颠倒离心管6次，使菌体充分裂解，随后将离心管冰上放置3分钟4. 加入150μl溶液3，立即温和颠倒离心管数次，冰上放置3分钟，10，000g离心10min。

5. 将步骤4的上清转移至新的离心管（尽量去除杂质），加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10，000g离心5min。

6. 将步骤5的上清转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置5－10min，沉降DNA7. 10，000g离心10分钟,弃乙醇，保留沉淀，加入1ml 70％的乙醇洗涤沉淀，10，000g离心5分钟8. 倒掉乙醇溶液，用吸水纸吸净管壁上的水珠，室温蒸发痕量乙醇9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA2）质粒鉴定→琼脂糖凝胶电泳灌胶：胶中加入荧光染料(SYBR Green I)加样：质粒+上样缓冲液→混匀电泳结果观察：UV灯下四、实验结果五、实验分析裂解细胞中除含有质粒DNA外，还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质，因此用碱裂解法除去杂质1、防止DNA裂解：Solution 11）、所含糖增加溶液黏度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切作用降解2）、所含EDTA抑制酶活性2、溶解与变性：Solution21)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性2）离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白3、沉降与复性：Solution31)质粒DNA复性2）在钾盐中，染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构，和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀预期结果为剩余质粒DNA4、琼脂糖凝胶电泳1）荧光染色染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间2）琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用，因所带电荷、分子量大小和构型不同，泳动速度不同六、误差分析实验失败，本组实验出现4条带，3明1暗，明亮处应为DNA分子数最多的，为质粒DNA，质粒DNA前有较暗的两条带，推测其中一条为未复性质粒DNA，可能Solution2处变性过长，不易复性，或Solution3处时间过短，复性不充分。

碱裂解法提取质粒DNA溶液 I ： 50 mM Glu / 25 mM Tris-CI / 10 mM EDTA （pH 8.0）；重悬菌体，供应缓冲环境。

（pH 很重要）。

葡萄糖：最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部，增加粘稠度，削减 摇摆时对DNA 的机械剪切力。

如缺了葡萄糖对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。

所以 说溶液I 中葡萄糖是可缺的。

EDTA ：它是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，在分子生物学试剂中的主要作用是抑制 DNase 的活性和抑制微生物生长。

在溶液1中加入高达10 mM 的EDTA,就是要把E.coli 细胞中 的全部二价金属离子都螯合掉。

若不加EDTA,只要是在短时间里完成质粒抽提，也不怕DNA 会快速被降解，由于最终溶解质粒的TE 缓冲液中有EDTA 。

假如哪天你手上正好缺了溶液I,只要用等体积的水，或LB 培育基来悬浮菌体就可以了。

留 意菌体肯定要悬浮匀称，不能有结块。

NaOH ：用新奇的NaOH,是为了保证NaOH 没有汲取空气中的CO2而减弱了碱性。

裂解细 胞的主要是碱，而不是SDS,所以才叫碱法抽提。

NaOH 是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠 杆菌还是哺乳动物细胞，遇到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer （双 层膜）结构向micelle （微囊）结构的相变化所导致。

用了不新奇的NaOH,即便有SDS 也无法有 效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。

只用SDS 也能抽提得到少量质粒，由于SDS 也是弱碱。

加SDS 是为下一步操作做铺垫。

留意：一，时间不能过长,在这样的碱性条件下基因组DNA 片断会渐渐断裂；二，必需温 顺混合,不然基因组DNA 也会断裂。

溶液III ： 3M KAc∕2M HAc o 加入后就会有大量的沉淀消失，与SDS 的加入有关系。

假如在溶液II 中不加SDS 时也会有很少量的沉淀，明显是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。

实验一碱裂解法抽提质粒DNA[实验原理]质粒是存在于染色体外的小型双链环状DNA，大小在1-200kb之间，能在宿主菌中自主复制。

宿主细胞中质粒的拷贝数各有不同，一种是低拷贝数的，每个细胞仅含有一个或几个质粒分子，称为“严紧型”复制的质粒，另一类高拷贝的质粒，拷贝数可达到20个以上，这种类型称为“松弛型”复制的质粒。

质粒能编码一些遗传性状，如抗药性（氨苄青霉素、四环素等抗性），利用这些抗性可以对宿主菌或重组菌进行筛选。

质粒作为基因工程载体必须具备以下条件（1）复制子（ori）：一段具有特殊结构的DNA序列；（2）有一个或多个便于检测的遗传表型，如抗药性、显色表型反应等；（3）有一个或几个限制性内切酶位点，便于外源基因片段的插入；（4）适当的拷贝数。

制备质粒载体是分子生物学的常规技术。

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。

例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。

对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。

[实验目的]1、掌握碱裂解法抽提质粒DNA的原理和方法。

2、掌握紫外吸收光谱法测定核酸含量的原理和方法。

[实验步骤]1、试剂配制（1）LB培养液10 g Tryptone，5 g Yeast Extract，10 g NaCl，双蒸水定容至1000mL，高压灭菌后4℃保存。