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Western Blotting 流程详细版1，收细胞。
从细胞间取出要收样的细胞，可以用两种方式进行处理（处理前准备好碎冰，并配好细胞裂解液，在所需量的细胞裂解液中加入leupeptin和PMSF，两者均为100X）：（1）真空泵吸去培养基，加入预冷PBS洗一次，真空泵吸去残液（彻底吸干净）。
直接在板中加入裂解液（6孔板：100ul/well；6cm板：500ul/well；10cm板：1.5ml/well），冰上静置5min。
再吸入预冷的1.5mlEP管中，准备超声(10cm板的细胞裂解液请分装至2到3个EP管中，方便超声)。
（2）真空泵吸去培养基，加入预冷PBS洗一次，真空泵吸净。
再在板中加入PBS（6孔板：500ul/well；6cm板：2ml/well；10cm板：5ml/well），用干净的细胞刮将板中的细胞刮下，转移至1.5mlEP管中（推荐每个EP管500ul左右液体，方便超声）。
2000r，5min，4℃。
如果想尽可能多收细胞，可以在刮过的板里再重复加一次PBS（用量见前述），待之前的管离心之后，再加入，重复离心一次。
离心之后，真空泵或移液枪吸去上清（用200ul tip头，尽可能吸干净）。
加入裂解液（6孔板：100ul/well；6cm板：500ul/well；10cm板：1.5ml/well）。
准备超声。
2，超声破碎细胞。
EP管置于冰上，每管按如下程序超声：超声时间1~2s/次，间隔5~10s 再重复下一次，总共10~20次。
超声后的样品与未超声样品相比更澄清。
超声效率推荐为20%，持续时间不宜过长，否则容易出现泡沫以及焦化现象。
超声1~2s时，可以将EP管从冰上拿出，以便操作，超声后立即放回冰上。
3，超声后离心，最大转速，30min，4℃。
离心后将上清转入新的干净EP管中（沉淀可以加入10ulSDS loading buffer混匀后，煮沸，跑胶，以验证目的蛋白是否残留于沉淀中，或是只存留于沉淀中）。
WB实验步骤详解Western blotting（简称WB）是一种常用的蛋白质检测技术，通过将蛋白质分离、转移和检测，可以用来确定特定蛋白质的存在和表达水平。
本文将详细介绍WB实验的步骤，以帮助读者了解该技术的操作流程。
1. 细胞培养和蛋白提取。
首先，需要培养细胞并收集细胞样本。
将细胞样本离心，去除培养基，然后用PBS洗涤细胞。
接下来，加入细胞裂解液并振荡离心，收集上清液，即为蛋白提取物。
2. 蛋白质浓度测定。
使用BCA或Bradford方法测定蛋白提取物的浓度，以确保后续实验中使用的蛋白质量一致。
3. SDS-PAGE凝胶电泳。
将蛋白提取物加入蛋白负载缓冲液，然后加入SDS-PAGE凝胶槽中。
进行电泳分离蛋白质，根据蛋白质大小和电荷不同，蛋白质会在凝胶中形成不同的条带。
4. 蛋白质转印。
将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质转移到膜上，通常使用半湿式或全湿式转印。
将蛋白质从凝胶转移到膜上，使得蛋白质可以与抗体结合。
5. 阻塞。
将膜放入含有蛋白质的溶液中，如5%脱脂奶粉或蛋白质阻塞缓冲液中，阻塞非特异性结合位点。
6. 一抗孵育。
加入第一抗体，孵育过夜。
第一抗体与目标蛋白结合，形成抗原-抗体复合物。
7. 洗涤。
用TBST或PBS洗膜，去除未结合的抗体。
8. 二抗孵育。
加入HRP标记的二抗，孵育1小时。
二抗与第一抗体结合，形成复合物。
9. 洗涤。
用TBST或PBS洗膜，去除未结合的二抗。
10. 显色。
加入ECL显色液，使得膜上的蛋白质产生发光反应。
将膜放入暗室中，用X光片曝光，然后用显影液显影。
11. 图像获取和分析。
将X光片放入X光片扫描仪中，获取蛋白质条带的图像。
使用图像分析软件，如ImageJ，分析蛋白质的相对表达水平。
以上就是WB实验的详细步骤，每一步都至关重要，需要严格按照操作规程进行。
希望本文能够帮助读者更好地理解WB实验的操作流程，并在实验中取得准确、可靠的结果。
WB实验的基本原理及操作流程WB实验（Western Blotting）是一种用于检测和分离蛋白质的实验方法，广泛应用于生物医学和生物化学领域。
它通过将复杂的蛋白质混合物按照分子大小分离，并使用特异性抗体来探测目标蛋白质。
本文将介绍WB实验的基本原理及操作流程。
一、基本原理WB实验主要基于蛋白质的电泳分离和免疫染色原理。
具体步骤如下：1.样品制备：首先，需要从细胞或组织中提取蛋白质，并经过适当的处理，如裂解细胞、破碎细胞膜等，以获取纯净的蛋白质样品。
2. SDS-电泳：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide Gel），随后进行电泳。
这一步骤会根据蛋白质的分子大小进行分离。
3.转膜：将分离的蛋白质从凝胶转移到聚乙烯2.2-羟基苯基酮（PVDF）或硝酸纤维素膜上，这样可以更容易进行免疫染色。
4.封闭：将转膜后的膜进行封闭，通常使用牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉等阻断非特异性结合位点。
5.抗体反应：加入目标蛋白质特异性的抗体，使其与特定抗原位点结合。
6.洗涤：将膜洗涤以去除非特异性的抗体。
7.免疫染色：加入酶标记的辅助抗体，它与目标抗体结合，并携带可检测信号物质（如酶或荧光染料）。
8.显色：加入合适的底物，使酶标记的辅助抗体产生可视化的颜色或荧光信号。
9.分析：通过成像设备（如X射线胶片或荧光成像系统）观察和记录目标蛋白质的表达。
二、操作流程下面是一份WB实验的基本操作流程，具体步骤可能因实验目的和实验条件而有所变化。
1.样品制备：a.收集细胞或组织样品，并使用适当的缓冲液裂解细胞膜。
b.添加蛋白质提取试剂，并彻底裂解细胞。
c.离心裂解后的细胞，收集上清液，其中含有目标蛋白质。
2.SDS-电泳：a.准备好聚丙烯酰胺凝胶，通常使用8%至12%的分辨胶。
b.加载待测样品和分子量标记蛋白质到凝胶中。
c.进行电泳，常用条件为100V持续电解，直到样品顶到凝胶底部。
3.转膜：a.准备合适大小的PVDF或硝酸纤维素膜，并剪成和凝胶一样大小。
Western blotting 步骤一、全细胞裂解液的提取(该步骤在冰上操作，所以要提前准备冰)1.用PBS洗两遍细胞，然后尽量把PBS吸干净2. 配细胞裂解液混合液：细胞裂解液（RIPA）：蛋白酶抑制剂（cocktail）=50：1 或细胞裂解液（RIPA）：PMSF=100：13.按每1×10^6细胞加100到250ul的细胞裂解液混合液，例如：每个10cm的中皿加500ul RIPA再加50ul cocktail4.冰上裂解30min中间震荡几下使其充分裂解(或放在4℃冰箱里，摇床上摇30min，速度20-30)，之后拿刷子把黏在板子上的细胞刷到下面的液体中，将液体吸到EP管中。
5.超声波破碎仪（此步骤可省略）6.离心12000g 4℃离心10min，离心结束后轻轻吸出上清至新的EP管。
离心时打开金属浴，提前做好准备，调节温度到95℃7.测蛋白质浓度(BCA法)①准备一个96孔板，每个孔里加25ul的蛋白质样品，注意加样时间隔一定的距离。
②配测浓度用的BCA液按A:B=50:1的比例配置，每个孔加200ul的BCA混合液。
然后放入37℃的水平摇床上摇晃30分钟，速度60rpm左右。
③将96孔板放入测浓度的设备中，打开电脑中的gen5软件，按“reading”开始测浓度。
假设所得的结果是X，则Y=921.62X-151.65，蛋白浓度=（Y/1000×4/5）ug/ul 上样量=样本量/蛋白浓度8.按吸出的蛋白样本：5×loading buffer =4：1的比例加入loading buffer，在小离心机上甩一下，使挂壁的液滴掉下来。
9.95℃煮蛋白10分钟，使蛋白成线性；然后再放冰上5分钟忽冷忽热使蛋白成球，并与loading紧密结合10.如果紧接着做Western blotting，则可直接用。
如果要以后备用，把蛋白样本放在-20或-80的冰箱里。
二、电泳及免疫印迹1.配胶①将玻璃板洗净，用干净纱布擦干。
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（Western Blotting，简称WB）是一种常用的分子生物学技术，主要用于检测和鉴定蛋白质的存在以及其在不同样本中的表达水平。
下面将详细介绍WB实验的具体步骤。
1.细胞裂解和蛋白质提取：首先将待检测的组织样本或细胞样本通过离心将其收集，并添加适量的裂解缓冲液。
使用超声波或机械破碎手段将细胞打乱，使蛋白质溶解在裂解缓冲液中。
再通过离心去除细胞碎片和细胞核等。
2.蛋白质浓度测定：根据实验需要，采用BCA法、Lowry法或Bradford法等方法测定蛋白质浓度，以确定后续实验的载体中待加载的蛋白质量。
3.蛋白质电泳：将相同量的蛋白质样品加入SDS-凝胶槽中，进行电泳。
电泳时蛋白质在凝胶中向阴极迁移，分子量小的蛋白质迁移速度较快，分子量大的较慢。
电泳结束后，将凝胶转移到膜上。
4.膜上瞬时染色：在转移至膜上后，可以使用Ponceau S染色或其他瞬时染色方法，以确认蛋白质在膜上的存在和转移效果。
5.阻断：在膜上的蛋白质检测之前，需要对膜进行阻断处理，以防止非特异性结合。
常用的方法是在膜上加入牛血清蛋白或脱脂奶粉的溶液，进行阻断。
6.一抗反应：加入已稀释好的一抗抗体，与目标蛋白质特异性结合。
一抗的选择要根据待检测蛋白的特异性来确定。
7.清洗：一抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的一抗抗体。
8.二抗反应：9.清洗：二抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的二抗抗体。
10.显色和成像：使用显色剂（如ECL）使膜上的蛋白质发生化学发光反应，然后将膜放入X射线片中，进行曝光。
最后使用化学显影废片机或Gel Doc System等设备进行成像。
11.数据分析：使用专业的成像软件分析成像结果，计算蛋白质的相对表达水平，并与内参蛋白进行比较。
需要注意的是，在进行WB实验的过程中，要严格操作，避免污染和交叉反应的出现。
同时，应根据实验需求选择适当的试剂和抗体，并进行标记、保存和储存等操作。
Western blotting步骤一：配胶用具：玻璃板（厚板和薄板），海绵垫，梳子，移液枪（1000ul、200ul、20ul等）。
试剂：分离胶成分10%（水、Tris8.8、40%丙烯酰胺、10%APS、TEMED），浓缩胶5%（水，Tris6.8、40%丙烯酰胺、10%APS、TEMED），压线液异丙醇。
过程：1.配制40%的丙烯酰胺溶液，放4℃保存，配制10%APS溶液（0.1g/ml)，备用2.用一蒸水清洗玻璃板，海绵垫和梳子用自来水冲洗，必须冲洗干净，放入烘箱中烘干。
3.组装玻璃板，放入架子中夹紧，注意板一定要平齐后再放入，将各个量程的移液枪调至所需的量程，先配分离胶，加入各组分至50ml离心管中（最后加TEMED），充分混匀后，立即加入板中，注意沿着玻璃板壁加入，加至液面与板子凹槽平齐，立即加入0.5ml 高度的压线液异丙醇赶走气泡，并及时清洗配胶用的管子以防凝固，30min后待出现折光线即可倾倒去除异丙醇，用吸水纸将残留液体吸净，再配浓缩胶。
4.浓缩胶配制类似分离胶，配好后加入到玻璃板中，至顶部加满即可，插入梳子，及时洗配液管，待凝固后拆板，用双蒸水浸泡，现用或放入4℃冰箱中存放平衡，待第二天取用。
注意：APS，为白色粉末，常温保存，10%APS存于-20℃冰箱配置时提前半小时取出放置室温预热。
TEMED需4℃保存丙烯酰胺粉末，常温保存即可，而40%的丙烯酰胺溶液则需4℃避光保存步骤二、电泳用具：移液枪（20ul，100ul)，上样枪头试剂：marker，蛋白样品（已加上样缓冲液和100℃，5min加热处理）准备工作：配制10*电泳液保存，电泳时稀释成1*的电泳液1L现用过程：将玻璃板装入电泳架中，放入电泳槽中，垂直拔出梳子，先在两板内侧加满电泳液，外侧加一些，不得影响上样，吹打胶丝，去除样品孔中的气泡，上样20ul每孔，左端和右端不加样组分别加多（5ul）和少（2.5ul）的marker，枪头可以看出界线，主要是使marker 的量不一样，右端的多颜色深，左端的量少颜色浅，能区分左和右。
Western blotting实验流程实验流程共分为6步：1 待测蛋白的准备；2 蛋白电泳；3 转膜；4 抗体结合；5 曝光；6 灰度值统计分析。
一、待测蛋白的准备1.细胞蛋白的提取：（1）拿出六孔培养板，去培养液，PBS洗细胞两遍，根据细胞密度每孔加50~100µl细胞裂解液（含1%的蛋白酶抑制剂PMSF,现用现配），冰上放置10分钟裂解。
（2）将培养板置于冰上，用细胞刮挂下细胞，每孔刮一分钟左右（刮不同孔细胞需用PBS 或水冲洗细胞刮，洗后甩干），收集裂解液于1.5ml EP管中，置于冰上裂解20分钟，期间需用振荡器振荡混匀3次，每次15秒左右（3）12000rpm，4℃冷冻离心5min左右，收集上清置于新EP管，存于-80℃。
2. BCA法蛋白溶液浓度测定（具体步骤按试剂盒说明书）（1）配制BCA工作液：打开37℃恒温箱预热加温，取出BCA标准品与蛋白样品解冻，配BCA工作液，A：B=50：1，A液总量=（8个标准蛋白+待测蛋白数量）*200µl，B液总量=（8个标准蛋白+待测蛋白数量）*4µl，配好后混匀。
（2）配制BCA标准品与标准曲线：用PBS稀释好标准品，按说明书将标准品加入到96孔板中，再补加PBS到一样体积。
（3）配制蛋白样品：每孔加入5µl蛋白原液，补加PBS稀释（稀释可节省蛋白，记住稀释倍数，蛋白较多时也可不稀释直接加蛋白原液测；蛋白孔可做2~3个平行孔，测量时取平均值较准）（4）加入BCA工作液：每孔各加200µl已配好的工作液，盖上板盖混匀30秒，37℃孵育30min，放好蛋白样品。
（5）测蛋白浓度：打开酶标仪预热10分钟以上，孵育完后取出96孔板冷却到室温，用移液枪去除小气泡，用纸巾擦干96孔板板度水珠，调节酶标仪波长，放入打印纸，打开96孔板板盖，在570nm波长下读取数值，空白孔可设可不设。
（具体按酶标仪操作说明，可以测几次选取）（6）计算浓度：用EXCELL表格制作标准直线方程，计算待测蛋白浓度（若稀释测量的记住要乘以稀释倍数才是最终蛋白浓度），然后以每个条带最低浓度那组蛋白为标准计算各组蛋白上样体积与细胞裂解液RIPA的补加体积。
western blotting的基本操作过程Western blotting是一种常用的分子生物学技术，在蛋白质分析中具有重要的应用。
它可以用于检测、分析、定量和分离蛋白质分子，并广泛应用于生物医学、病理学、免疫学、遗传学等领域。
本文将介绍Western blotting的基本操作过程，以帮助读者了解和掌握Western blotting技术的实验操作。
一、材料准备在进行Western blotting之前，必须准备好所有需要的材料和试剂。
首先需要制备胶液和凝胶，包括聚丙烯酰胺凝胶、缓冲液、Tris-HCl缓冲液、SDS-PAGE凝胶、封盘液、扩增液等。
此外，还需要准备电泳装置、电源、电极、磁力搅拌器、主机等实验设备。
此外，还需要准备细胞或组织样本，并提取蛋白质。
提取蛋白质的方法有很多，目前常用的包括酚/氯仿法、三氯乙酸法、离子交换柱法、氨基酸顺序法等。
二、电泳分离Western blotting是基于电泳的分析方法，因此第一步是将提取的蛋白质进行电泳分离。
在分离之前，必须将样品加入载体缓冲液，以确保其稳定性和一致性。
将样品加入凝胶槽中，用电泳装置进行电泳分离。
在电泳期间，缓冲液通过电解质稀释样品。
当电流通过凝胶时，带电粒子会在电场中移动，分离出不同的组分，最后嵌入凝胶中。
分离后的蛋白质按照其分子量大小排列，从而形成一条蛋白质带。
三、转膜将蛋白质分离带从聚丙烯酰胺凝胶中转移到聚氟乙烯膜上，这个步骤称为转膜。
转膜要求将聚氟乙烯膜浸泡在沉淀剂中，使其吸水并增加其静电位，然后放置在集装箱中。
加入转移缓冲液、荷载样品和过硫酸铵，启动转移。
转膜电源把电流传递到电极板上，导致电子从内极板流向外极板。
这个过程产生的电流足以推动带电粒子（即蛋白质）从凝胶中转移到聚氟乙烯膜上。
由于膜具有不吸水的特性，其吸附的蛋白质能够保持原来的位置和形式。
借助荧光染料可以对蛋白质进行原位成像，并进一步进行分析。
四、免疫分析Western blotting的第四个步骤是免疫分析。
Western Blot操作方法及步骤1).蛋白质提取Extraction buffer组成:蔗糖0.7 MTris/HCl0.5 MEDTA 50 mMKCl0.1 M配制成母液pH 9.4巯基乙醇2%蛋白酶抑制剂25×取100-200 mg植物叶片，用液氮速冻后用研磨仪打碎（若量比较大可用液氮研磨，分装到多管中），加入500 µl 提取缓冲液，涡旋；完全混匀后加入500 µl 苯酚（分层，取下层酚层）, 涡旋；在3000 g 的转速下离心10 min, 4 °C拿两只新的EP管，各取200 µl 离心后的上清液；向两只EP管中各加入1 ml 0.1M NH4Ac（用甲醇溶解配制）；在-20°C下沉淀放置至少2 h过夜放置；在13000 rpm转速下离心5 min，4 °C；用0.1 M NH4Ac（用甲醇溶解配制）洗涤，用枪头将蛋白吹散，洗净杂质；在13000 rpm转速下离心5 min，4 °C；取上清后空甩EP管，去除多余的溶液；室温干燥蛋白, 用1% SDS（100ul左右）溶解蛋白。
2). 测定总蛋白浓度。
用BCA蛋白检测试剂盒测定提取物中的蛋白质含量(1)蛋白浓度测定1、考马斯亮蓝G250通过与蛋白质内的氨基和羧基基团间的静电结合作用以及范德华力，考马斯亮蓝与蛋白质形成强但非共价键连接的复合物。
蛋白-染料复合物的形成稳定染料携带的负电荷阴离子，从而产生在膜上或者胶上肉眼可见的蓝色①测定总蛋白浓度步骤：按照BCA试剂盒说明书进行操作1.配制标准曲线的标准样品--胎牛血清蛋白（BSA）浓度BSA原液浓度：5mg/ml②待测样品稀释用Nanophotometer（纳米光度计）初步测一下待测样品的浓度，计算好稀释的体积，使得终浓度在标准曲线区间内。
③加样准备测定标准样品和待测样品各准确吸取20μl溶液于酶标孔中，加入BCA工作液200μl。
WB实验步骤详解WB实验（Western Blotting）是一种用于检测和鉴定蛋白质的实验技术。
在WB实验中，通常将目标蛋白质从混合蛋白样本中分离出来，然后通过电泳将其分离在聚丙烯酰胺凝胶上，并利用蛋白质转印技术将蛋白质迁移到膜上。
最后，使用特异性抗体进行免疫染色来检测目标蛋白质。
下面是WB实验的详细步骤：1.提取蛋白质：首先，从细胞、组织样本中提取蛋白质。
这个步骤可以使用不同的方法，例如细胞裂解、组织切碎和离心等。
提取的蛋白质可以用于整个WB实验的下一步。
2.蛋白质电泳分离：将提取的蛋白质样本与样品缓冲液混合，然后加载到聚丙烯酰胺凝胶上。
通常使用的凝胶是SDS-（聚丙烯酰胺凝胶电泳），该凝胶根据蛋白质的分子量将其分离开来。
样品加载完毕后，通电进行电泳分离。
较小的蛋白质会迁移到凝胶的上部，较大的蛋白质会停留在凝胶的下部。
3.转印：将电泳分离后的蛋白质转移到膜上。
通常使用的膜是聚偏氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素膜。
在转印之前，通常将凝胶浸泡在转移缓冲液中以增强转印效果。
然后，将凝胶与膜、滤纸层堆叠在一起，将其放置在转印装置中，施加电流进行蛋白质转印。
4.阻断：将转印完成的膜孔洞中的非特异性结合位点进行阻断。
阻断是为了防止以后的抗原-抗体反应受到非特异性结合的干扰。
最常用的阻断剂是1%-5%的非脂牛奶粉或5%-10%的牛血清蛋白。
5.抗体孵育：使用特异性的抗体来检测目标蛋白质。
首先将抗体稀释在主抗体稀释液中，然后将其加到阻断后的膜上进行孵育。
通常在4℃下过夜孵育，使抗体与目标蛋白质结合。
选择合适的抗体对于获得准确的结果非常重要。
6.辅助抗体孵育：将特异性抗体之外的次级抗体添加到膜上，用于识别已结合的主抗体。
这些次级抗体通常与酶（如辣根过氧化物酶）或荧光染料标记进行共轭，以便于标记的抗体的检测。
次级抗体与主抗体结合形成复合物。
7.检测：使用特定的检测方法来显示已结合的抗体。
这些方法可以使用酶标法（如辣根过氧化物酶反应和色素显色）或荧光技术（如荧光染料）。
从网上看到的，希望对你有所帮助：一、配胶注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面乡下倾斜置于干净的纸巾晾干。
分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4度，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP （0.7~0.8：100,分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5：100）及TEMED（分离胶用0.4：1000，15%的可用到0.3：1000，浓缩胶用0.8：1000）即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED浓度到《分子克隆》建议浓度。
封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。
封胶后切记，勿动。
待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。
片刻后倒掉SDS，将玻璃板倒立放置片刻控净。
4．灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。
拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。
若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。
30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。
(10%的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周。
30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉.)二．样品处理1．培养的细胞（定性）：⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。
⑶100℃，1min。
⑷用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。
⑸用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于0℃后在14000~16000g离心2min，再次挑丝。
若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。
⑹待样品恢复到室温后上样。
2．培养的细胞（定量）：⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
⑷12000g离心，4℃，2min。
⑸取少量上清进行定量。
⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。
3．组织：⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。
可手动或电动匀浆。
注意尽量保持低温，快速匀浆。
⑵12000g离心，4℃，2min。
⑶取少量上清进行定量。
⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer 后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。
(裂解液配方：Tris-Cl (pH7.4) 20mM，EDTA 1mM由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。
提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO40.1mM及NaF 25mM）。
1×loading buffer配方：10% 甘油，50mM Tris·Cl (pH6.8)，2% β-巯基乙醇，0.2~0.5‰溴酚蓝，2%或5%的SDS。
Buffer可配成2×~5×，注意SDS终浓度勿超过10%。
对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS，肝肾等组织2%即可。
)三．电泳1．上样前将胶板下的气泡赶走。
2．所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loading buffer上样，Marker也用1×loading buffer调整至与样品等体积。
2．以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V 时改为稳压电泳。
3．在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。
电泳液配方：Tris-base 3g, glycine 14.4g, 0.1% SDS（10ml 10% SDS）/LTris-base 1.5g, glycine 7.2g, 0.1% SDS（5ml 10% SDS）/0.5L 四．转膜1．电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：湿转使用常规电转液：Tris 3.0g，Gly 14.4g，M-OH 200ml，加去离子水至1,000ml。
干转则取此转移液，每50ml加入10%SDS180ul。
浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。
PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。
将滤纸也浸入转移液中。
2．取胶：将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张（干转每侧三张）滤纸。
注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路）3．转膜：湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1,000ml电转液。
将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。
降温，将电泳槽置于冰水混合物中。
恒流100mA过夜，或400mA，4h。
注意不同蛋白的要求不同。
干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2小时。
负载电压不宜超过1V/cm2胶面积。
电转液配方：Tris-base 3g, glycine 14.4g, 200ml 甲醇/1L五．封闭及杂交1．封闭：将膜从电转槽中取出，去离子水与PBST或TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。
必要时可先用丽春红染色（2%乙酸，0.5%丽春红的水溶液）观察蛋白条带，再用去离子水和TTBS将丽春红洗脱后封闭，如用蛋白marker则可省略此步。
2．结合一抗：一抗的准备：使用反贴法时每张3×9cm2膜约需2ml一抗稀释液。
反贴法的操作：含一抗的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。
在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。
3．洗涤：一抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
4．结合二抗：根据一抗来源选择合适的二抗，根据鉴定方法选择HRP或AP标记的抗体，按相应比例稀释（1:1000~1:10000），室温轻摇一小时。
5．洗涤：二抗孵育结束后，用PBST或TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次5-10min。
PBST：1×PBS TTBS：Tris-HCl 20mM, pH 7.4 (25℃)Tween-20 0.01% ~0.02% NaCl 150mMTween-20 0.05%封闭液与抗体溶剂均为含5%脱脂奶粉的PBST或TTBS，临用时取200ml PBST或TTBS加入10g脱脂奶粉即为封闭液。
六．发光鉴定一般使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP显色法。
1．HRP-ECL发光法：将A、B发光液按比例稀释混合。
膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。
取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。
2．AP-NBT/BICP显色法：每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个EP管中，每张3×9cm的膜取一管配成1ml即可。
将PBST或TTBS 洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。
背景深浅与一抗的质量及二抗的量有关，当然如果暴光时间长达半小时，出现背景是正常的。
七．增强敏感性若目的条带未出现，或很淡，可试用以下方法增强发光强度：用清水漂洗膜数分钟，重加发光液进行曝光，可延长曝光时间。
将膜在PBST或TTBS中洗涤30min或更长，期间至少换2次液。
封闭40~60min一抗杂交，室温1h。
37℃1h 会更强，但可能增加非特异条带。
PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。
二抗杂交，37℃1h。
PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。
发光鉴定。
若条带仍未出现或很淡，可以再用PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。
10．三抗杂交，室温1h。
37℃1h 会更强，但可能增加非特异条带。
三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此时三抗可以选择兔抗羊或鼠抗羊等。
11．PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。
12．发光鉴定。
一抗溶液中加入0.2% 叠氮钠后可4℃存放至少2周（一个月我也用过，没问题，再长时间还没试）八．NC膜的多次使用一张NC膜可使用多次，对多种蛋白进行杂交，步骤与“七．增强敏感性”相近。
如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置差别较大则只需用PBST洗涤掉发光液（10min×3次）后从一抗杂交开始，后续步骤同前。
如前次杂交结果条带距离本次杂交的蛋白的预计位置较近则需更强的洗涤，可用strip液（可用杂交袋）于室温摇动洗涤30min~60min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。
对于杂交若干次的膜，如果常规洗涤方法不易去掉众多条带，可用强度更强的自配的strip液（可用杂交袋）于50℃洗涤30min，然后用PBST洗涤10min×3次，再从封闭开始，后续步骤同前。
