色谱分析法概论

⾊谱分析法概论

第⼀章⾊谱分析法概论

第⼀节概述

⾊谱分析法简称⾊谱法或层析法(chromatography)，是⼀种物理或物理化学分离分析⽅法。从本世纪初起，特别是在近50年中，由于⽓相⾊谱法、⾼效液相⾊谱法及薄层扫描法的飞速发展，⽽形成⼀门专门的科学——⾊谱学。⾊谱法已⼴泛应⽤于各个领域，成为多组分混合物的最重要的分析⽅法，在各学科中起着重要作⽤。历史上曾有两次诺贝尔化学奖是授予⾊谱研究⼯作者的：1948年瑞典科学家Tiselins因电泳和吸附分析的研究⽽获奖，1952年英国的Martin和Synge因发展了分配⾊谱⽽获奖；此外在1937～l972年期间有12次诺贝尔奖的研究中，⾊谱法都起了关键的作⽤。

⾊谱法创始于20世纪初，1906年俄国植物学家Tsweet将碳酸钙放在竖⽴的玻璃管中，从顶端倒⼊植物⾊素的⽯油醚浸取液，并⽤⽯油醚冲洗。在管的不同部位形成⾊带，因⽽命名为⾊谱。管内填充物称为固定相(stationary phase)，冲洗剂称为流动相(mobile phase)。随着其不断发展，⾊谱法不仅⽤于有⾊物质的分离，⽽且⼤量⽤于⽆⾊物质的分离。虽然“⾊”已失去原有意义，但⾊谱法名称仍沿⽤⾄今。30与40年代相继出现了薄层⾊谱法与纸⾊谱法。50年代⽓相⾊谱法兴起，把⾊谱法提⾼到分离与“在线”分析的新⽔平，奠定了现代⾊谱法的基础，l957年诞⽣了⽑细管⾊谱分析法。60年代推出了⽓相⾊谱—质谱联⽤技术(GC-MS)，有效地弥补了⾊谱法定性特征差的弱点。70年代⾼效液相⾊谱法(HPLC)的崛起，为难挥发、热不稳定及⾼分⼦样品的分析提供了有⼒⼿段。扩⼤了⾊谱法的应⽤范围，把⾊谱法⼜推进到⼀个新的⾥程碑。80年代初出现了超临界流体⾊谱法(SFC)，兼有GC与HPLC的某些优点。80年代末飞速发展起来的⾼效⽑细管电泳法(high performance capillary electrophoresis，HPCE)更令⼈瞩⽬，其柱效⾼，理论塔板数可达l07m-1。该法对于⽣物⼤分⼦的分离具有独特优点。

⾊谱法的分离原理主要是利⽤物质在流动相与固定相之间的分配系数差异⽽实现分离。⾊谱法与光谱法的主要区别在于⾊谱法具有分离及分析两种功能，⽽光谱法不具备分离功能。⾊谱法是先将混合物中各组分分离，⽽后逐个分析，因此是分析混合物最有⼒的⼿段。这种⽅法还具有⾼灵敏度、⾼选择性、⾼效能、分析速度快及应⽤范围⼴等优点。

⾊谱法可从不同的⾓度进⾏分类：1.按流动相与固定相的分⼦聚集状态分类在⾊谱法中流动相可以是⽓体、液体和超临界流体，这些⽅法相应称为⽓相⾊谱法(gas chromatography，GC)、液相⾊谱法(liquid chromatography，LC)和超临界流体⾊谱法(supercritical fluidchromatography，SFC)等。按固定相为固体(如吸附剂)或液体，⽓相⾊谱法⼜可分为⽓-固⾊谱法(GSC)与⽓-液⾊谱法(GLC)；液相⾊谱法⼜可分为液-固⾊谱法(LSC)及液-液⾊谱法(LLC)。

2.按操作形式分类可分为柱⾊谱法、平板⾊谱法、电泳法等类别。

柱⾊谱法(column chromatography)是将固定相装于柱管内构成⾊谱柱，⾊谱过程在⾊谱柱内进⾏。按⾊谱柱的粗细等，⼜可分为填充柱(packed column)⾊谱法、⽑细管柱(capillary column)⾊谱法及微填充柱(microbore packed column)⾊谱法等类别。⽓相⾊谱法、⾼效液相⾊谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)及超临界流体⾊谱法等属于柱⾊谱法范围。

平板⾊谱法(planar或plane chromatography)是⾊谱过程在固定相构成的平⾯状层内进⾏的⾊谱法。⼜分为纸⾊谱法(paperchromatography；⽤滤纸作固定液的载体)、薄层⾊谱法(thin layer chromatography，TLC，将固定相涂在玻璃板或铝箔板等板上)及薄膜⾊谱法(thin film chromatography；将⾼分⼦固定相制成薄膜)等，这些都属于液相⾊谱法范围。

⽑细管电泳法(capillary electrophoresis，CE)的分离过程在⽑细管内进⾏，利⽤组分在电场作⽤下的迁移速度不同进⾏分离。3.按⾊谱过程的分离机制分类可分为分配⾊谱法(partition chromatography)、吸附⾊谱法(adsorption chromatography)、离⼦交换⾊谱法(ion exchange chromatography，IEC)、空间排阻⾊谱法(steric exclusion chromatography，SEC)及亲合⾊谱法(affinity chromatography)等类型。

⾊谱法简单分类如下表:

⾊谱法⽓相⾊谱法

填充柱⾊谱法

⽑细管⾊谱法

（GC）GLC

GSC液相⾊谱法

（LC）

平板⾊谱

柱⾊谱法

经典液相柱⾊谱法

⾼效液相⾊谱法（HPLC）

薄层⾊谱法（TLC）

纸⾊谱法SEC

LSC

LLC

LLC

SEC

LSC

IEC

LLC

⾼效⽑细管电泳法（HPCE）

超临界流体⾊谱法（SFC）

第⼆节⾊谱法的基本原理

⼀、⾊谱过程

⾊谱过程是物质分⼦在相对运动的两相间分

配“平衡”的过程。混合物中，若两个组分的分配

系数(distribution coefficient)不等，则被流动相携带

移动的速度不等—差速迁移，⽽被分离。

吸附柱⾊谱法的操作及⾊谱过程如图18-l 所

⽰。把含有A、B两组分的样品加到⾊谱柱的顶端，A、B均被吸附到固定相上。然后⽤适当的流动相

冲洗，当流动相流过时，已被吸附在固定相上的两

种组分⼜溶解于流动相中⽽被解吸，并随着流动相

向前移⾏，已解吸的组分遇到新的吸附剂颗粒，⼜

再次被吸附，如此在⾊谱柱上不断地发⽣吸附、解

吸、再吸附、再解吸……的过程。若两种组分的理化性质存在着微⼩的差异，则在吸附剂表⾯的吸附能⼒也存在微⼩的差异，经过反复多次的重复，使微⼩的差异积累起来就变成了⼤的差异，其结果就使吸附能⼒弱的B先从⾊谱柱中流出，吸附能⼒强的A后流出⾊谱柱，从⽽使各组分得到分离。

⼆、基本类型⾊谱法的分离机制1.分配⾊谱法 分配⾊谱法利⽤被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别⽽实现分离。其固定相为液体，GLC 和LLC 都属于分配⾊谱法范围。分配⾊谱法的⽰意图如图18-2。图中X 代表样品中某组分(溶质)分⼦，下标m 与s 分别为流动相与固定相。溶于流动相与溶于固定相的溶质分⼦处于动态平衡，平衡时浓度之⽐(严格应为活度⽐)为狭义分配系数(partition coefficient):m

m s s m s V X V X C C K //== (1.1) 溶质分⼦在固定相中溶解度越⼤，或在流动相中溶解度越⼩，则K 越⼤。在LLC 中K 主要与流动相的性质(种类与极性)有关，在GLC 中K 与固定相极性和柱温有关。2.吸附⾊谱法 吸附⾊谱法利⽤被分离组分对固体表⾯活性吸附中⼼吸附能⼒的差别⽽实现分离。其固定相为固体吸附剂，⼤部分GSC 和LSC 都属于吸附⾊谱法。

吸附过程是样品中各组分的分⼦(X)与流动相分⼦(Y)争夺吸附剂表⾯活性中⼼(即为竞争吸附)的过程(图18-3)。吸附平衡可以表⽰为:m a a m nY X nY X +?+

流动相中组分的分⼦X m 与吸附在吸附剂表⾯的n 个流动相分⼦Y a 相置换，组分的分⼦被吸附，以X a 表⽰。流动相分⼦回⾄流动相内部，以Y m 表⽰。吸附平衡常数称为吸附系数(K a )，可近似⽤浓度商表⽰：[][][][]n a m n m a a Y X Y X K =

因为流动相的量很⼤，[][]na n m Y Y /近似于常数，且吸附只发⽣于吸附剂表⾯，所以，吸附系数可写成：

[][]()()m m a a m a a V X S X X X K ////== (1.2)

式中S a 为吸附剂的表⾯积，V m 为流动相（展开剂）的体积。吸附系数与吸附剂的活性、组分的性质和流动相的性质有关。3.离⼦交换⾊谱法 离⼦交换⾊谱法利⽤被分离组分离⼦交换能⼒的差别⽽实现分离。其固定相为离⼦交换树脂，按可交换离⼦的电荷符号⼜可分为阳离⼦交换树脂和阴离⼦交换树脂。

以阳离⼦交换⾊谱为例说明分离机制。图1-4中R 为树脂⾻架，树脂表⾯的负离⼦(如SO 3-)为不可交换离⼦；其正离⼦为可交换离⼦(H +离⼦)。当流动相中携带有正离⼦出现时，发⽣交换反应(见第2章)。交换反应达平衡时，以浓度表⽰的平衡常数称为选择系数(selec- tivity coefficient ；K s )，即[][]

++=X RX K s / (1.3)

式中RX +为交换到树脂上的阳离⼦，X +为在流动相中的游离阳离⼦。K s 与离⼦的电荷和⽔合离⼦半径、流动相性质和pH 、离⼦交换树脂的性质及温度有关。

4.空间排阻⾊谱法 空间排阻⾊谱法根据被分离组分分⼦的线团尺⼨⽽进⾏分离。其固定相是多孔性填料凝胶，故此法⼜称为凝胶⾊谱法(gel chromatography)，也称为分⼦排阻⾊谱法。该⾊谱法按流动相的不同分为两类：以有机溶剂为流动相者称为凝胶渗透⾊谱法 (gelpermeation chromatography ，GPC)；以⽔溶液为流动相者为凝胶过滤⾊谱法(gel filtration chromatography ，GFC)。

凝胶⾊谱法的分离机制与前三种⾊谱法完全不同，它只取决于凝胶的孔径⼤⼩与被分离组分线团尺⼨之间的关系，与流动相的性质⽆关。其作⽤类似于分⼦筛的作⽤(反筛⼦)，⽰意图如图1-5。

凝胶⾊谱法的分离机制有多种说法，空间排斥理论是⽬前被多数⼈所接受的理论。该理论有两条假设：(l)孔内外同等⼤⼩的溶质分⼦处于扩散平衡状态:

Xm sX m 与X s 分别代表在流动相与凝胶孔隙中同等⼤⼩的溶质分⼦。平衡时，两者浓度之⽐为渗透系数(permeation coefficient ；K p )

[][]m s p X X K /= (1.4)

(2)渗透系数的⼤⼩只由溶质分⼦的线团尺⼨及凝胶孔隙的⼤⼩所决定。

在凝胶孔径⼀定时：①当分⼦⼤到不能进⼊凝胶的所有孔隙时，[ X m ]=0，则K p =0；②当分⼦⼩到能进⼊所有孔隙时，[ X s]=[X m ]，K p =1；③分⼦尺⼨在上述两种分⼦之间时，0

以上是四种基本类型的⾊谱法，这四类⾊谱法都可⽤于液相⾊谱法，⽽⽓相⾊谱法主要⽤前两类。此外，还有其他分离机制的⾊谱法。近年来最常见的⼀种⾊谱法是化学键合相⾊谱法(chemically bonded-phase chromatography)，从分离机制讲，键合相⾊谱法并未超出上述基本类型，但是对于特定固定相在特定实验条件下，哪⼀种机制起主要作⽤仍是当前研究较多的问题。

三、分配系数与保留⾏为的关系l.分配系数: 达到分配“平衡”后，组分在固定相(s)与流动相（m ）中的浓度（C ）之⽐为分配系数(K )。K 与组分、固定相和流动相的性质及温度有关。m

s C C K = (1.5)

2.保留时间: 由进样到某组分⾊谱峰峰顶的时间间隔为该组分的保留时间(t R )，如图18-1所⽰。不保留(不溶于固定相或不被固定相所吸附等)组分的保留时间为死时间(t 0)，亦即流动相的保留时间。