多发性骨髓瘤患者微小RNA-92a表达水平及其临床意义

·论著·

多发性骨髓瘤患者微小ＲＮＡ９２ａ

表达水平及其临床意义

屈晓燕　张森森　吴霜　洪鸣　李建勇　陈丽娟　许家仁

【摘要】　目的　探讨多发性骨髓瘤（ＭＭ）患者微小ＲＮＡ９２ａ（ｍｉＲ９２ａ）的表达水平及其与染色体

ｄｅｌ（１３ｑ１４）和患者预后的关系，并进一步探索ｍｉＲ９２ａ作用的信号通路。方法　收集５３例初诊ＭＭ

患者骨髓标本，用ＣＤ１３８磁珠分选浆细胞，然后用间期荧光原位杂交技术检测染色体ｄｅｌ（１３ｑ１４）情

况；用实时定量ＰＣＲ检测浆细胞中ｍｉＲ９２ａ的表达；用ｍｉＲ９２ａ前体转染ＭＭ细胞株（ＬＰ１、Ｕ２６６和

ＪＪＮ３），Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测ｃｊｕｎ蛋白表达水平。结果　５３例ＭＭ患者中３１例（５８．５％）染色体

ｄｅｌ（１３ｑ１４）阳性；伴有和不伴有ｄｅｌ（１３ｑ１４）的患者ｍｉＲ９２ａ相对中位表达水平分别为２７．３６±２．６１和

２１．８７±１５．９８，两者差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）。中位随访１３．５（０．５～７２．５）个月，ｍｉＲ９２ａ高表达

的患者中位无进展生存期明显短于低表达者（４．５个月对１４．０个月，Ｐ＝０．００６）。转染ｍｉＲ９２ａ前体

后，ＭＭ细胞株（ＬＰ１、Ｕ２６６和ＪＪＮ３）中ｃｊｕｎ蛋白表达水平呈时间依赖性下降。结论　ｍｉＲ９２ａ高表

达的ＭＭ患者预后差，ｍｉＲ９２ａ表达水平与ｄｅｌ（１３ｑ１４）无相关性，ｍｉＲ９２ａ有可能通过ｃｊｕｎ途径影响

ＭＭ的疾病过程。

【关键词】　多发性骨髓瘤；　微ＲＮＡｓ；　基因，ｃｊｕｎ；　预后

ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡ９２ａａｎｄｉｔｓｃｌｉｎｉｃａｌｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｉｎｍｕｌｔｉｐｌｅｍｙｅｌｏｍａｐａｔｉｅｎｔｓ　ＱＵＸｉａｏ

ｙａｎ，ＺＨＡＮＧＳｅｎｓｅｎ，ＷＵＳｈｕａｎｇ，ＨＯＮＧＭｉｎｇ，ＬＩＪｉａｎｙｏｎｇ，ＣＨＥＮＬｉｊｕａｎ，ＸＵＪｉａｒｅｎ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ

Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，ＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＪｉａｎｇｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｎａｎｊｉｎｇ　

２１００２９，Ｃｈｉｎａ

Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＸＵＪｉａｒｅｎ，Ｅｍａｉｌ：ｘｕｊｉａｒｅｎ＠ｔｏｍ．ｃｏｍ

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡ９２ａ

（ｍｉＲ９２ａ）ａｎｄｄｅｌ（１３ｑ１４）ａｎｄｔｈｅｐｒｏｇｎｏｓｉｓｏｆＭＭｐａｔｉｅｎｔｓ，ａｎｄｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｐａｔｈｗａｙｔｈａｔｍｉＲ９２ａｉｎ

ｖｏｌｖｅｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｓａｍｐｌｅｓｆｒｏｍ５３ｎｅｗｌｙｄｉａｇｎｏｓｅｄＭＭｐａｔｉｅｎｔｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄ，ｄｅｌ（１３ｑ１４）

ｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｉｎｔｅｒｐｈａｓｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｉｎｓｏｒｔｅｄＣＤ１３８ｐｏｓｉｔｉｖｅｐｌａｓｍａｃｅｌｌ．Ｔｈｅｅｘ

ｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ９２ａｉｎｐｌａｓｍａｃｅｌｌｓｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ．Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｊｕｎｗａｓ

ｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｍｉＲ９２ａｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄＭＭｃｅｌｌｌｉｎｅｓ（ＬＰ１，Ｕ２６６ａｎｄＪＪＮ３）．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｏｆｔｈｅ５３

ＭＭｐａｔｉｅｎｔｓ，ｄｅｌ（１３ｑ１４）ｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎ３１（５８．４％）ｐａｔｉｅｎｔｓ．ＴｈｅｍｅｄｉａｎｌｅｖｅｌｓｏｆｍｉＲ９２ａｉｎＭＭｐａ

ｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｏｒｗｉｔｈｏｕｔｄｅｌ（１３ｑ１４）ｗｅｒｅ２７．３６±２．６１ａｎｄ２１．８７±１５．９８，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ（Ｐ＞０．０５）．Ｗｉｔｈｔｈｅ

ｍｅｄｉａｎｆｏｌｌｏｗｕｐｏｆ１３．５（０．５－７２．５）ｍｏｎｔｈｓ，ｔｈｅｍｅｄｉａｎｄｕｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｆｒｅｅｓｕｒｖｉｖａｌｏｆｐａｔｉｅｎｔｓ

ｗｉｔｈｈｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｍｉＲ９２ａｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｓｈｏｒｔｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｗｉｔｈｌｏｗｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｍｉＲ９２ａ

（４．５ｍｏｎｔｈｓｖｓ１４．０ｍｏｎｔｈｓ，Ｐ＝０．００６）．ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ９２ａｉｎＭＭｃｅｌｌｌｉｎｅｓｉｎｄｕｃｅｓｔｉｍｅｄｅ

ｐｅｎｄｅｎｔｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｃｊｕｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　ＨｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｉＲ９２ａｗａｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｐｏｏｒｐｒｏｇ

ｎｏｓｉｓｉｎＭＭｐａｔｉｅｎｔｓ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｍｉＲ９２ａｗａｓｎｏｔａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｄｅｌ（１３ｑ１４），ａｎｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆ

ｍｉＲ９２ａｏｎｔｈｅｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆＭＭｍｉｇｈｔｂｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｃｊｕｎｐａｔｈｗａｙ．

【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】　Ｍｕｌｔｉｐｌｅｍｙｅｌｏｍａ；　ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ；　Ｇｅｎｅ，ｃｊｕｎ；　Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ

ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０２５３２７２７．２０１３．０４．０１８

基金项目：国家自然科学基金（８１２４１０７４、３０９７１２９４、８１０７１９４６）；江苏省自然科学基金（ＢＫ２０１２４８５）；江苏省“３３３”工程（ＢＲＡ２０１１２１７）；江

苏省医学重点人才（ＲＣ２０１１０４８）；江苏省研究生培养创新工程（ＣＸＺＺ１１０７０３）

作者单位：２１００１９　南京医科大学第一附属医院、江苏省人民医院血液科

通信作者：许家仁，Ｅｍａｉｌ：ｘｕｊｉａｒｅｎ＠ｔｏｍ．ｃｏｍ·２３３·中华血液学杂志

２０１３年４月第３４卷第４期　ＣｈｉｎＪＨｅｍａｔｏｌ，Ａｐｒｉｌ２０１３，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．４ 多发性骨髓瘤（ＭＭ）是浆细胞恶性肿瘤，其疾

病过程和预后差异大，呈现明显异质性。分子遗传

学异常是影响ＭＭ预后的重要因素之一。第一个发

现与预后相关的遗传学特征是１３号染色体缺失

［ｄｅｌ（１３）］［１４］。微小ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ，ｍｉＲ）通过与靶

ｍＲＮＡ完全或不完全互补配对，引起ｍＲＮＡ降解或

翻译抑制，从而对基因转录后水平进行调控。

ｍｉＲＮＡ参与调控细胞增殖及分化等生命活动。在很

多肿瘤中均发现ｍｉＲＮＡ表达水平发生改变。

ｍｉＲ９２ａ位于染色体１３ｑ３１．３，在多种恶性肿瘤细胞

中过表达，发挥显著的致癌作用。我们对ｍｉＲ９２ａ

在ＭＭ患者的表达水平及其与ｄｅｌ（１３ｑ１４）和患者

预后的关系，以及ｍｉＲ９２ａ作用的信号通路进行了

探讨，现报道如下。

病例和方法

１．主要材料：ＣＤ１３８磁珠为德国ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ

公司产品；ＴａｑｍａｎｍｉＲＮＡ逆转录试剂盒为Ａｐ

ｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司产品；Ｄｕａｌｌｕｃｉｆｒａｓｅ试剂盒为

Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品；ｍｉＲ９２ａ前体购自Ａｍｂｉｏｎ公司，

ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；检测

ｄｅｌ（１３ｑ１４）的探针Ｄ１３Ｓ３１９购自北京金菩嘉医疗科

技有限公司。

２．病例和细胞株来源：２００９年９月至２０１２年２

月在我院治疗的５３例初诊ＭＭ患者，诊断标准参照

文献［５］。其中男３５例，女１８例，中位年龄６０

（３３～７９）岁。根据ＤｕｒｉｅＳａｌｍｏｎ（ＤＳ）分期和国际

分期系统（ＩＳＳ）分期法分期。ＤＳ分期：Ⅰ期３例，

Ⅱ期２例，Ⅲ期４８例。ＩＳＳ分期：Ⅰ期９例，Ⅱ期１３

例，Ⅲ期３１例；Ｍ蛋白类型分型：ＩｇＧ型３０例，ＩｇＡ

型１１例，κ轻链型９例，λ轻链型３例。ＭＭ细胞株

Ｕ２６６和ＬＰ１由上海长征医院侯健教授惠赠，ＪＪＮ３

细胞由美国阿肯色医科大学田尔明教授惠赠。细胞

培养于含１０％胎牛血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌ青霉素、

１００μｇ／ｍｌ链霉素、２ｍｍｏｌ／Ｌ谷氨酰胺的ＲＰＭＩ１６４０

培养液中，３７℃、５％ＣＯ２、饱和湿度条件下常规培

养。取对数生长期的细胞用于实验。

３．ＣＤ１３８磁珠分选纯化ＭＭ患者骨髓浆细胞：

取ＭＭ患者骨髓１０ｍｌ密度梯度离心法分离单个核

细胞并计数；每５×１０６个细胞加磷酸盐缓冲液

（ＰＢＳ）９０μｌ；每５×１０６个细胞加ＣＤ１３８磁珠１０μｌ，

４℃孵育１５ｍｉｎ；过柱分离浆细胞，涂片检测，浆细

胞纯度中位数为９４％（８５％～９９％）。将纯化的浆

细胞低渗固定处理后收获细胞，－２０℃冻存备用。４．间期荧光原位杂交（ＩＦＩＳＨ）技术检测染色体

ｄｅｌ（１３ｑ１４）：取－２０℃储存的浆细胞，采用Ｄ１３Ｓ３１９

探针参照文献［６］方法进行ＩＦＩＳＨ检测。正常间期

细胞表现为２个红色信号，当出现１个信号时判断

为阳性［即存在ｄｅｌ（１３ｑ１４）］，如图１。计数２００个

浆细胞计算出现阳性信号细胞的百分率，阳性率＞

２０％定为ｄｅｌ（１３ｑ１４）阳性。

５．实时定量ＰＣＲ检测ｍｉＲ９２ａ表达：用ＴＲＩｚｏｌ

试剂提取浆细胞总ＲＮＡ。用核酸蛋白定量仪检测

ＲＮＡ浓度及纯度。采用ＴａｑｍａｎｍｉＲＮＡ逆转录

试剂盒进行逆转录，逆转录反应体系：ＲＮＡ１０ｎｇ，

１０×ＲＴ缓冲液１．５μｌ，１００ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ０．１５μｌ，

５０Ｕ／μｌＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅＴＭ逆转录酶１μｌ，２０Ｕ／μｌＲＮａｓｉｎ

０．１９μｌ，加焦碳酸二乙酯（ＤＥＰＣ）水至７μｌ，相应的

逆转录引物（ｈｓａｍｉＲ９２ａ和ＲＮＵ４４）３μｌ；冰上放置

５ｍｉｎ，逆转录条件：１６℃３０ｍｉｎ、４２℃３０ｍｉｎ、

８５℃５ｍｉｎ。实时定量ＰＣＲ体系：２０×Ｔａｑｍａｎ

ｍｉＲＮＡ（ｈｓａｍｉＲ９２ａ和ＲＮＵ４４）探针１μｌ，

ＴａｑｍａｎｕｎｉｖｅｒｓａｌＰＣＲｍａｓｔｅｒｍｉｘ１０μｌ，逆转录产

物１．６μｌ，ＤＥＰＣ水７．４μｌ；每份标本采用复管。反

应条件：９５℃１０ｍｉｎ、９５℃１５ｓ、６０℃１ｍｉｎ，共４０

个循环。ＲＮＵ４４作为内参校正特异扩增ｍｉＲＮＡ的

表达水平。采用ＡＢＩＰＲＩＳＭ７９００定时定量ＰＣＲ仪

扩增，用仪器配套软件分析。

６．双荧光素酶报告基因检测ｍｉＲ９２ａ对ｃｊｕｎ

的调节作用：采用ＰＣＲ扩增ｃｊｕｎ３′ＵＴＲ，插入ｐＳＩ

ＣＨＥＣＫ２载体（ｐＳＩｊｕｎ），采用大引物突变法构建突

变的ｃｊｕｎ３′ＵＴＲ（ｍｕｔｐＳＩｊｕｎ），以ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ

２０００将及ｍｉＲ９２ａ＋ｐＳＩ空载体、ｍｉＲ９２ａ＋ｐＳＩｊｕｎ、

ｍｉＲ９２ａ＋ｍｕｔｐＳＩｊｕｎ瞬时转染ＪＪＮ３细胞作为实验

组，同时设ｍｉＲＮＡｍｉｍｉｃ阴性对照（对照ｍｉＲＮＡ）＋

ｐＳＩ空载体、对照ｍｉＲＮＡ＋ｐＳＩｊｕｎ、对照ｍｉＲＮＡ＋

ｍｕｔｐＳＩｊｕｎ转染组作为相应对照组，用Ｄｕａｌｌｕｃｉ

ｆｒａｓｅ试剂盒检测各组ＪＪＮ３细胞双荧光素酶活性，以

未转染的细胞作本底加以扣除，以萤火虫荧光素酶

为内参，将各组细胞按照萤火虫荧光素酶活性进行

均一化处理，比较海肾荧光素酶活性（代表ｃｊｕｎ活

性）。每组均设３个复孔，实验重复３次，

７．ｍｉＲ９２ａ前体转染ＭＭ细胞株：ＬＰ１、Ｕ２６６

和ＪＪＮ３细胞分别按２×１０６个／孔均匀接种于６孔

培养板中，利用ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００转染试剂将

ｍｉＲ９２ａ前体转入ＭＭ细胞，参照转染试剂ｌｉｐｏ

ｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００说明书完成转染，将６μｌｌｉｐｏ