油橄榄SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

中国兰ISSR—PCR反应体系优化及引物筛选作者：黄晓慧巫伟峰陈春张毅智汪长水徐建球陈发兴陈孝丑来源：《南方农业学报》2018年第07期摘要：【目的】优化中国兰的ISSR-PCR反应体系，并筛选适用于中国兰ISSR分析的候选引物，为ISSR分子标记在中国兰的辅助育种及亲缘关系和遗传多样性分析等提供技术参考。

【方法】以6个中国兰品种为材料，采集其叶片样品，分别用研钵法和研磨仪法进行破碎研磨，比较两种方法提取DNA的效果，利用L25（53）正交试验和单因素试验对DNA模板量、引物浓度、2×Taq Master Mix添加量、循环数和退火温度进行优化，建立最佳ISSR-PCR 反应体系，并从ISSR分子标记通用引物中筛选适用于中国兰的ISSR分析候选引物。

【结果】研磨仪法提取的DNA浓度明显高于研钵研磨法，但二者提取的DNA质量均较好（OD260/OD280为1.7～2.0）。

对ISSR-PCR反应体系扩增结果的影响程度排序为DNA模板量>引物浓度>2×Taq Master Mix添加量。

综合考虑成本和DNA模板量，最佳ISSR-PCR反应体系（20.0 μL）：DNA模板10.0 ng、引物0.8 μmol/L和2×Taq Master Mix 9.0 μL。

最佳循环数为35，最佳退火温度为49.6 ℃。

基于上述优化结果，从100条引物中共筛选出42条适用于中国兰的ISSR候选引物。

【结论】研磨仪法可有效提高中国兰基因组DNA的提取率和质量，且利用优化后的ISSR-PCR反应体系和扩增程序及筛选出的引物，扩增获得的条带清晰、稳定，多样性好，可用于中国兰的遗传多样性和亲缘关系等分析研究。

关键词：中国兰；ISSR；分子标记；反应；引物筛选中图分类号： S682.310.36 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2018）07-1282-070 引言【研究意义】中国兰又称国兰，是中国传统兰花的统称，为兰科（Orchidaceae）兰属（Cymbidium）植物，其味幽香，花色淡雅，素有花中君子和天下第一香之美称，且具有独特的内涵和意境，观赏和经济价值很高（陈心启，2011）。

邵雪花，刘传滨，匡石滋，等．橄榄种质资源遗传多样性分析及指纹图谱构建［Ｊ］．江苏农业科学，２０２３，５１（５）：９４－１０２．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２３．０５．０１２橄榄种质资源遗传多样性分析及指纹图谱构建邵雪花１，刘传滨２，匡石滋１，赖　多１，刘传和１，贺　涵１，肖维强１（１．广东省农业科学院果树研究所／农业农村部南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室／广东省热带亚热带果树研究重点实验室，广东广州５１０６４０；２．潮州市果树研究所，广东潮州５２１０００） 摘要：利用ＩＳＳＲ分子标记技术，对１０１份橄榄种质资源进行遗传多样性分析，并绘制指纹图谱。

从９６条ＩＳＳＲ引物中筛选出１０条引物，对广东省农业科学院果树研究所橄榄资源圃和潮州市果树所资源圃内１０１份资源进行分子标记，使用ＵＰＧＭＡ聚类分析橄榄种质资源遗传多样性，从１０对引物中挑选扩增条带清晰、多态性好的核心引物进行遗传多样性分析，并构建橄榄ＤＮＡ指纹图谱。

分析结果显示，１０条ＩＳＳＲ引物对１０１份橄榄样品进行扩增，共得到１３６条条带，其中多态性条带１３５条，多态率为９９．２６％，平均每条引物扩增得到条带１３．６０条，平均每条引物扩增得到多态性条带１３．５０条，表明供试材料间遗传多样性较高。

通过ＵＰＧＭＡ聚类分析可知，１０１份橄榄种质资源样品间的遗传相似性系数为０．５８～０．９７，表明品种间亲缘关系较近。

在遗传相似性系数为０．６８时，可将１０１份橄榄种质资源分为５组，第１组包含种质４８份，第２组包含种质４５份，第３组包含种质５份，第４组包含种质２份，编号Ｃ７４的大纳甜橄榄单独为第５组，说明该品种与其他样品相比发生了明显的遗传变异。

利用筛选得来的６条核心引物组合成功构建了橄榄ＤＮＡ指纹图谱，为供试的１０１份橄榄品种编写了一套唯一的指纹图谱编码。

研究结果成功构建了１０１份橄榄种质的指纹图谱，为橄榄种质资源的挖掘、利用和创制新品种等提供理论依据。

第38卷第1期2013年2月林业调查规划Forest Inventory and Planning Vol．38No．1Feb．2013doi ：10.3969/j.issn.1671-3168.2013.01.010油橄榄研究进展王有兵，严毅，周庆宏（昆明市海口林场，云南昆明650114）摘要：油橄榄(Olea europaea L.)是著名的木本油料兼果用树种，原产于地中海沿岸。

我国20世纪60年代开始大量引种栽培，其果实含油率高，鲜榨油可以直接食用。

目前我国橄榄油主要靠进口。

系统地阐述油橄榄形态特征、地理分布、扦插繁殖、嫁接繁殖、化学成分、遗传特性、良种选育以及引种历史等方面的研究进展或成果，分析油橄榄产业发展中存在的问题，并提出了发展建议。

关键词：油橄榄;橄榄油;遗传特性;良种选育;研究进展中图分类号：S565.7文献标识码：A文章编号：1671－3168（2013）01－0039－06Research Progress of Olea europaeaWANG You-bing ，YAN Yi ，ZHOU Qing-hong（Haikou Forest Farm ，Kunming 650114，China ）Abstract ：Olea europaea ．is one famous tree specie of both oil and fruit use ，which originated in the Mediterranean coast．China has introduced Olea europaea plants since 1960s ，it has the characteristics of high oil rate ，and the oil extracted from fresh fruits is directly edible．However ，olive oil is mainly impor-ted currently in China．This paper researched the morphological characteristics ，geographical distribu-tion ，cutting and grafting propagation ，genetic ，chemical component of Olea europaea ，moreover ，ana-lyzed the problems of industry development of Olea europaea ，and proposed corresponding development suggestions．Key words ：Olea europaea ；olive oil ；hereditary property ；fine seed breeding ；research progress 收稿日期：2012－10－30.作者简介：王有兵（1986－），男，硕士。

虉草ISSR-PCR反应体系优化与引物筛选张永亮;刘鹏;骆秀梅;刘杨【摘要】22个虉草基因组DNA为ISSR-PCR扩增模板,采用单因素试验方法,对影响PCR扩增体系中dNTP、引物浓度、Taq酶和模板DNA用量4个因素及引物退火温度进行梯度试验,优化得到最佳的ISSR-PCR反应体系,即20μL反应体系中分别加入0.3μL Taq DNA聚合酶(5 U/μL),2μL 10×PCRBuffer(mg2+ plus),1.5 μL dNTP (2.5 mmol/L),1.5 μL引物(10 pmol/μL),50 ng模板DNA,ddH2O补足体积.以此体系对24条引物进行筛选,最终获得了多态性高,重复性好的引物12条.引物UBC808、809、811、815、818、820、826的适宜退火温度为55℃,引物835,841和842的适宜退火温度为56℃,而引物810和834的适且退火温度分别为52℃和54℃.12条引物共扩增总条带数192条,其中,多态性条带数173条,多态位点百分率89.81％.【期刊名称】《草原与草坪》【年(卷),期】2016(036)003【总页数】7页(P1-6,11)【关键词】虉草;ISSR-PCR反应体系;引物筛选【作者】张永亮;刘鹏;骆秀梅;刘杨【作者单位】内蒙古民族大学,内蒙古通辽028042;内蒙古民族大学,内蒙古通辽028042;内蒙古民族大学,内蒙古通辽028042;内蒙古民族大学,内蒙古通辽028042【正文语种】中文【中图分类】S543;Q786虉草(Phalaris arundinacea)，属于禾本科(Gramineae)、虉草属植物，别名草芦、园草芦。

主要分布于欧洲、北美和亚洲，在我国主要分布于东北、华北、华中、华东等地区。

虉草耐盐碱、耐湿涝，又耐旱，生长快，营养繁殖能力强，产草量高、叶量丰富，蛋白质含量高，被广泛用于饲草、人工湿地植物、生物能源材料或造纸原料等[1-2]。

杧果SC-SSR分子标记反应体系的建立与优化作者：覃昱茗张宇黄国弟莫永龙罗世杏荣涛来源：《农业研究与应用》2021年第03期摘要：采用正交设计方法，对影响PCR反应体系的5个因素（Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTPs、引物和模板DNA）进行了优化，建立了适用于杧果的SC-SSR-PCR反应体系。

结果表明，总反应体系25 μL中，包含模板DNA用量100 ng·mL-1、Mg2+浓度2.00 mmol·L-1、引物浓度0.40 μmol·L-1、Taq DNA 聚合酶浓度1.00 U、dNTPs浓度0.15 mmol·L-1。

利用优化的杧果SC-SSR-PCR反应体系对10对SC-SSR引物进行验证，均能扩增出清晰、明亮、特异的电泳条带。

因此，优化的杧果SC-SSR-PCR反应体系适用于杧果种质鉴定和亲缘关系分析。

关键词：杧果 SC-SSR 正交设计体系优化中图分类号：S667.7 文献标识码：A杧果（Mangifera indica L.）为漆树科重要常绿经济果树，原产印度，其果实风味极佳[1]。

国内海南、广东、广西、福建、云南、贵州、四川均有栽培[2-3]。

起始密码子-微卫星扩增多态性（start codon simple sequence repeat，SC-SSR）标记是郭大龙等结合SCoT和ISSR分子标记技术开发出来的一种既能将标记位点与表达序列紧密联系，又具有相对较高多态性的新型分子标记[4]。

目前，SC-SSR标记已应用于猕猴桃遗传多态性分析及其指纹图谱构建，但在其他物种中的应用研究在国内并不多[5]。

由于杧果高度异花授粉，种子高度杂合，且生产交易中往往存在同物异名和异物同名等问题，给杧果育种工作带来了诸多阻碍[6-8]。

SC-SSR分子标记在种质鉴定方面具有独特的优势，但在杧果中尚未有报道。

基于这些问題，本研究较全面地建立并优化杧果的SC-SSR反应体系，为其在杧果种质资源评价、遗传多样性分析等领域的应用提供技术参考。

SSR引物的筛选步骤（1）利用琼脂糖凝胶电泳对引物可扩增性进行筛选摸索PCR反应体系和扩增条件，确定以下程序进行扩增。

25µl反应体系：30 ng DNA样品，2.0 mM MgCl2，0.2 mM dNTP，0.1 µM引物，1.0U Taq DNA聚合酶，1 × PCR缓冲溶液。

扩增条件：94℃预变性2.5min，随后94℃30s，45℃～60℃（依引物的退火温度而定）30s，72℃30s，循环30～40次，最后在72℃延伸20 min。

（可根据自己的实验改变反应条件）利用以上扩增产条件，选取三个居群的三个体，对引物的可扩增性进行筛选，并经1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

（2）利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对引物的多态性进行筛选试剂配制：8%非变性聚丙烯酰胺凝胶配制（25ml）：15ml的去离子水H2O，5ml 的5×TBE，5ml 的40%（W/V）聚丙烯酰胺溶液，180ul的10%（W/V）过硫酸铵（APS），16 ul的TEMED。

5×TBE的配制：54g的Tris base，27.5g的硼酸，20ml0.5 mol/L的EDTA，最后定容至1L。

40%（W/V）聚丙烯酰胺的配制（100ml）：38.5g丙烯酰胺（Acrylamide），1.5g甲叉双丙烯酰胺（Bis-acrylamide），加100ml去离子水搅拌溶解，棕色瓶4℃保存。

10%（W/V）过硫酸铵（APS）的配制（20ml）：2gAPS加20ml去离子水后搅拌溶解，于4℃保存，可保存2周，超过期限会失去催化作用。

实验步骤：顺序安装聚丙烯酰胺凝胶电泳仪各部件，灌胶并凝聚2小时。

在电压105V，电流43mA条件下电泳3.5个小时，取下凝胶并进行以下步骤。

（1）固定10分钟，后水洗1次。

（固定液：360ml水，40ml乙醇，2ml乙酸）（2）银染3-10分钟，后水洗1次。

（银染液：400ml水，4ml 20%AgNO3）（3）脱色15-60秒，后水洗2次。

SSR引物筛选实验步骤一.CTAB法提取DNA1.取0.1g嫩叶于研钵中，加少量碳酸钙研磨成浆，加入800μL 65℃预热的CTAB，转移至离心管；2.将离心管置于65℃水浴锅中水浴1h,期间摇5次，混匀；3.取800μL氯仿∶异戊醇（24∶1）加入离心管中，上下颠倒10min,12000rpm离心15min；4.吸取上清液（600~700μL）转移至新的离心管，再加入1/10体积的NaAc（3mol/L）;5.加入等体积-20℃预冷无水乙醇（或异丙醇），轻摇，置于-20℃中10min;6.12000rpm离心10min后弃上清；7.清洗两次：加入500μL 75%乙醇，轻弹，离心5min,再倒出上清液8.清洗两次后晾干，加100μL ddH2O溶解（一般溶解一晚上）；9.溶解后测浓度。

二.8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳1.PCR：测定DNA浓度后将其稀释至100-200（ng/μL）;配10μL PCR体系：4.6μL ddH2O、2.4μL Mix、2μL DNA模板、1μL引物（引物需稀释10倍；前后引物各0.5μL）PCR温度设置：94℃ 2 m94℃ 30s }50℃ 30s } 35cycles72℃ 30s }4℃ ∞PCR结束后将结果置于-4℃2.各溶液配置：（1）8%非变性聚丙烯酰胺凝胶母液:120ML:40% Acr 24mL2% Bis 13mL10×TBE 12mLddH2O 71mL（2）10×TBE：Tris 108g硼酸55gEDTA 7.44g超纯水定容至1L（3）10% AP:称取10g过硫酸铵，ddH2O溶解，定容至100mL （4）电泳缓冲液：1×TBE：取100mL 10×TBE稀释至1L（5）银染液：1g AgNO3加蒸馏水至1L（6）显影液：20g NaOH+0.4g无水Na2CO3+4mL甲醛，加蒸馏水至1L3.清洗玻璃板、胶条与梳子，擦干表面水分；用无水乙醇按一个方向擦拭玻璃板两遍后，将胶条置于大玻璃板底部，将小玻璃板整齐置于大玻璃板上，确保平整后用夹子固定两边及底部；4.制胶：45mL母液+45μL TEMED+450μL 10% AP搅拌后沿着玻璃板一侧匀速灌胶，保证无气泡，放梳子时留2-3mm在外面，注意别产生气泡；凝40min后缓缓拔出梳子；用1×TBE冲洗胶槽，冲洗后移去夹子和胶条，将玻璃板固定于电泳仪器上，在上下槽加入电泳缓冲液。

油葵SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选
房冬梅;吕品;侯建华
【期刊名称】《中国农学通报》
【年(卷),期】2015(31)12
【摘要】为了获得适合油葵的SSR-PCR反应体系,通过采用控制变量法对影响SSR反应体系的主要因素进行优化,研究Mg2+浓度、d NTPs浓度、Taq酶浓度、引物浓度、退火温度等因素。

结果表明各因素的终浓度分别在Mg2+浓度2.5 mmol/L、d NTPs浓度0.2 mmol/L、Taq酶量0.5 U、引物浓度0.4μmol/L及
退火温度为53.9℃时最为适合。

通过试验优化后的体系筛选引物,最终从50对引
物筛得19对多态性好的引物可进行下一步的研究。

【总页数】5页(P205-209)
【关键词】SSR;反应体系;引物筛选
【作者】房冬梅;吕品;侯建华
【作者单位】内蒙古农业大学农学院
【正文语种】中文
【中图分类】S565.5
【相关文献】
1.小豆SSR-PCR反应体系优化及引物筛选 [J], 赵雅楠;王颖;张东杰;姜多
2.油料植物光皮树SSR-PCR反应体系优化及引物筛选 [J], 张路红;蒋丽娟;陈景震;易诗明;黄蓉;夏栗
3.藜麦SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选 [J], 左皓南; 张书苗; 高森; 陈翠萍; 闫殿海; 刘洋
4.二月兰SSR-PCR反应体系的优化及引物筛选 [J], 贾新平;孙晓波;梁丽建;苏家乐;邓衍明
5.油梨基因组DNA提取，SSR-PCR反应体系优化及引物筛选 [J],
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。