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第1讲基因工程1.基因工程的诞生(Ⅰ)2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ)3.基因工程的应用(Ⅱ)4.蛋白质工程(Ⅰ)1.基因的结构与功能。
(生命观念)2.基因工程的操作流程图及蛋白质的流程图等。
(科学思维)3.基因工程的应用和蛋白质工程。
(科学探究)4.正确看待转基因生物与环境安全问题。
(社会责任)基因工程的基本工具及基本程序1．基因工程的概念(1)概念：按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
(2)优点①与杂交育种相比：克服了远缘杂交不亲和的障碍。
②与诱变育种相比：定向改造生物的遗传性状。
2．基因工程的基本工具(1)限制性核酸内切酶(简称限制酶)。
①来源：主要来自原核生物。
②特点：具有专一性，表现在两个方面：识别——双链DNA 分子的某种特定核苷酸序列。
切割——特定核苷酸序列中的特定位点。
③作用：断裂特定的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
④结果：产生黏性末端或平末端。
(2)DNA 连接酶①种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
②质粒的特点⎩⎨⎧ 能自我复制有一个至多个限制酶的切割位点有特殊的标记基因③运载体的作用：携带外源DNA 片段进入受体细胞。
3．基因工程的基本程序(1)目的基因的获取①从基因文库中获取 ②人工合成⎩⎨⎧利用mRNA 反转录合成通过DNA 合成仪用化学方法人工合成③利用PCR 技术扩增(2)基因表达载体的构建——基因工程的核心①目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
②基因表达载体的组成(3)将目的基因导入受体细胞①转化含义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内遗传和表达的过程。
②转化方法生物类型植物动物微生物受体细胞体细胞受精卵大肠杆菌或酵母菌等常用方法农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法显微注射法感受态细胞法方法检测或鉴定目的水平DNA分子杂交技术检测目的基因的有无个体水平分子杂交技术目的基因是否转录抗原—抗体杂交目的基因是否翻译抗虫或抗病接种实验是否具有抗虫抗病特性分子水平(1)原理：DNA双链复制。
里氏木霉纤维二糖水解酶基因cbh1的分子改造陈小玲;张穗生;黄俊;雷富;陈东【摘要】[目的]用分子改造的方法改造里氏木霉(Trichoderma reesei的纤维二糖水解酶基因cbh1,提高其纤维素酶活力,为工业化生产纤维素酶提供参考.[方法]用DNaseI消化里氏木霉cbh1,回收100 bp左右的片段后用T4 DNA连接酶连接,以连接产物作为模板进行PCR扩增,将PCR改造的cbh1基因转化里氏木霉原生质体,使改造的cbh1基因与里氏木霉原有的cbh1基因发生同源重组.通过比较滤纸酶活力的方法筛选纤维素酶活力提高的突变菌株,在NCBI上比对分析突变菌株的cbh1序列.[结果]经克隆测序获得基因片段大小为637 bp,与里氏木霉同属菌株cbh1基因的相似性在88‰98％,确定为里氏木霉cbh1的基因片段.经DNaseI消化15 min、T4 DNA连接酶连接、经PCR扩增获得改造后的cbh1基因.将改造cbh1基因片段转化里氏木霉原生质体,得到cbh1基因突变体库.从cbh1基因突变体库中筛选获得1株纤维素酶滤纸酶活比出发菌株高1.7518倍的突变菌株E2-1.序列比对分析发现,与出发菌株相比,突变菌株E2-1的cbh1基因有14个碱基发生了突变,其中5个碱基为置换突变,8个碱基为缺失突变,1个碱基为插入突变,分布于cbh1基因的9个位置.[结论]改造后的cbhl因能与里氏木霉的染色体DNA发生同源重组,进而提高突变菌株的纤维素滤纸酶活力.【期刊名称】《南方农业学报》【年(卷),期】2014(045)010【总页数】5页(P1739-1743)【关键词】里氏木霉;纤维素酶;纤维二糖水解酶基因;分子改造;碱基突变【作者】陈小玲;张穗生;黄俊;雷富;陈东【作者单位】广西科学院非粮生物质酶解国家重点实验室/国家非粮生物质能源工程技术研究中心/广西生物质炼制重点实验室,南宁530007;广西科学院非粮生物质酶解国家重点实验室/国家非粮生物质能源工程技术研究中心/广西生物质炼制重点实验室,南宁530007;广西科学院非粮生物质酶解国家重点实验室/国家非粮生物质能源工程技术研究中心/广西生物质炼制重点实验室,南宁530007;广西科学院广西近海海洋环境科学重点实验室,南宁530007;广西科学院非粮生物质酶解国家重点实验室/国家非粮生物质能源工程技术研究中心/广西生物质炼制重点实验室,南宁530007【正文语种】中文【中图分类】Q7850 引言【研究意义】地球上每年光合作用的产物主要为植物枝、干、叶等木质纤维素类物质，产量高达1500多亿t。
木聚糖酶生产及酶学性质的研究一、本文概述木聚糖酶是一类能够水解木聚糖及其相关多糖的酶类，广泛存在于自然界中，尤其是在植物、微生物和动物体内。
由于其在生物质转化、食品加工、饲料工业以及医药等领域的重要应用价值，木聚糖酶的研究与生产日益受到关注。
本文旨在全面综述木聚糖酶的生产方法、纯化技术以及酶学性质的研究进展，以期为木聚糖酶的进一步研究和应用提供理论支持和实践指导。
本文将对木聚糖酶的生产方法进行详细阐述。
这包括从天然来源中提取木聚糖酶，以及通过微生物发酵、基因工程等生物技术手段生产木聚糖酶。
在此基础上，还将探讨不同生产方法的优缺点，以及影响木聚糖酶产量的关键因素。
本文将关注木聚糖酶的纯化技术。
纯化是获得高质量、高活性木聚糖酶的关键步骤，本文将介绍常见的纯化方法，如硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析等，并分析各方法的优缺点及适用范围。
本文将重点研究木聚糖酶的酶学性质。
这包括木聚糖酶的分子量、最适pH值、最适温度、动力学参数等基本性质，以及酶的稳定性、抑制剂和激活剂等影响因素。
通过对这些酶学性质的研究，可以更深入地了解木聚糖酶的作用机制和催化性能，为其在各个领域的应用提供理论依据。
本文旨在通过系统研究木聚糖酶的生产及酶学性质，为木聚糖酶的进一步研究和应用提供全面、深入的理论支持和实践指导。
二、木聚糖酶的生产方法木聚糖酶作为一种重要的工业酶，其生产方法主要包括微生物发酵法、化学合成法和基因工程法。
其中，微生物发酵法因其产量高、成本低、条件温和且易于工业化生产等优点，成为目前木聚糖酶生产的主要方法。
微生物发酵法生产木聚糖酶主要利用能够产生木聚糖酶的微生物，如真菌、细菌和放线菌等，通过优化培养基成分、发酵条件和菌种选育等手段，提高木聚糖酶的产量和活性。
目前，黑曲霉、米曲霉和里氏木霉等真菌是木聚糖酶的主要生产菌种。
在发酵过程中，碳源、氮源、无机盐和生长因子等营养成分对木聚糖酶的产量和活性具有重要影响。
常用的碳源包括木聚糖、葡萄糖、果糖等，氮源则包括蛋白胨、酵母粉、豆饼粉等。
植物病理学报ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA㊀42(3):334-336(2012)收稿日期:2011-04-25;修回日期:2012-02-10基金项目:国家自然科学基金资助项目(30971949);教育部高校博士点专项基金(20090073110048);公益性行业(农业)科研专项(200903056);上海市科委重点项目(09391910900);上海市科委重大科技攻关项目(09dz 1900103);现代农业产业技术体系专项(CARS-02)通讯作者:陈捷,教授,博士生导师,主要从事植物病理学和环境微生物工程研究;E-mail:jiechen 59@㊂췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍췍研究简报绿木霉Sm 1基因的克隆㊁原核表达及蛋白纯化朱洁伟,吴琼,陈捷*(上海交通大学农业与生物学院农业部都市农业(南方)重点开放实验室,上海200240)Sm 1gene cloning from Trichoderma virens ,prokaryotic expression and protein purification ㊀ZHU Jie-wei ,WU Qiong ,CHEN Jie㊀(School of Agriculture and Biology and Key Laboratory ofUrban Agriculture (South )of Ministry of Agriculture ,Shanghai Jiao Tong University ,Shanghai 200240,China )Abstract :Trichoderma spp.have been recognized as the agents for the biocontrol of plant disease.They produce or release a variety of compounds that induce localized or systemic resistance responses in plants.In this study ,Sm 1gene was cloned from Trichoderma virens (YZ2612).Sequence analysis showed that the cD-NA fragment had an ORF with length of 414bp encoding 138amino acid residues.The recombinant prokar-yotic expression vector pET-28a (+)-Sm 1was constructed ,and then transformed into Escherichia coli BL21(DE3).IPTG concentration ,induction time and temperature were optimized for enhancing fused protein ex-pression ,It was revealed that the best expression was achieved under conditions of 24ħand 1mmol /L of IPTG for 4hours.The recombinant protein was solubilized ,denatured ,refolded ,and purified.These results might offer an important gene resource for being used to construct transgenic resistant lines of plants and to prepare new kind of protein biofungicide.Key words :Sm 1gene ;Trichoderma ;prokaryotic expression ;protein purification文章编号:0412-0914(2012)03-0334-03㊀㊀木霉菌(Trichoderma spp.)是土壤内普遍存在的习居菌,具有多种生物防治功能,其中诱导植物免疫反应是重要的生物防治功能之一[1]㊂木霉菌Sm1蛋白(small one protein )是从绿木霉(Tri-choderma virens )中分离得到的一种低分子量㊁富含半胱氨酸的疏水性蛋白,属于蛋白类激发子,与Cerato-platanin 基因家族有很高的同源性,具有诱导植物免疫抗性的作用[2]㊂该小分子蛋白对植物和微生物无毒,能诱导棉花㊁水稻活性氧的释放以及葡聚糖酶㊁几丁质酶和过氧化物酶等防御反应基因的局部和系统表达[3]㊂关于木霉Sm 1基因表达特性研究国内外报道较少,本研究从华东地区分离到的绿木霉菌株中克隆Sm 1基因,通过该基因的原核表达获得纯化的融合蛋白质,为今后利用Sm 1进行转基因抗性育种㊁创制新蛋白农药和揭示木霉菌诱导植物免疫分子机理提供参考㊂1㊀材料与方法1.1㊀供试菌株本实验室木霉资源库菌株Trichoderma virens(YZ2612)1.2㊀主要酶等分子试剂原核表达载体pET-28a (+)及其宿主菌㊀㊀3期㊀㊀朱洁伟,等:绿木霉Sm1基因的克隆㊁原核表达及蛋白纯化E.coli BL21(DE3)均为本实验室保存㊂限制性内切酶Bam HⅠ㊁XhoⅠ㊁T4DNA连接酶㊁蛋白标准分子量均购于北京经科宏达生物技术有限公司上海分公司㊂Premix Taq Version2.0购于大连宝生物公司㊂1.3㊀引物设计根据已克隆的木霉菌Sm1基因全长cDNA序列,分析限制性酶切位点,并根据原核表达载体pET-28a(+)的特点,在Sm1基因全长cDNA ORF 区域的5ᶄ和3ᶄ末端分别设计上下游引物Sm1-F (5ᶄ-CGC GGATCCATGCAACTGTCCAACATC-3ᶄ)和Sm1-R(5ᶄ-CCG CTCGAGGAGACCGCAGTTCT-TAA-3ᶄ)㊂在上下游引物的5ᶄ端分别加入Bam H Ⅰ和XhoⅠ酶切位点和保护碱基(下划线部分为酶切位点,斜体部分为保护碱基)㊂1.4㊀Sm1基因的克隆及融合表达载体的构建利用Trizol法提取木霉菌株Trichoderma vi-rens(YZ2612)的总RNA㊂利用Oligo(dT)18引物逆转录合成第一链cDNA,按TaKaRa公司Pri-meScript TM RT reagent Kit操作㊂以第一链cDNA 产物为模板,Sm1-F/Sm1-R为引物对,用Premix Taq酶对Sm1基因全长cDNA ORF区序列进行PCR扩增㊂反应条件为:94ħ预变性5min;94ħ30s,58ħ30s,72ħ30s,33个循环;72ħ延伸8 min㊂将双酶切回收的目的片段,连接到同样双酶切的原核表达载体pET-28a(+),转化E.coli BL21(DE3)㊂利用M13通用引物对阳性克隆进行测序,融合表达载体命名为pET-28a(+)-Sm1㊂1.5㊀融合表达载体pET-28a(+)-Sm1的诱导表达和SDS-PAGE电泳分析1.5.1㊀重组细胞的培养及诱导表达㊀挑取重组菌单菌落,接种至20mL含有100mg/L卡那霉素的LB培养基中,37ħ,220rpm,培养至OD600约为0．6,取1mL阴性菌液作为对照㊂设置IPTG诱导浓度(1mmol/L)及不同的诱导温度(37ħ㊁28ħ㊁24ħ),诱导表达4h后,各取菌液1mL,6000 rpm,离心5min,收集菌液沉淀,用40μL ddH2O 重悬菌体,加入10μL5ˑSDS-Loading Buffer,煮沸3min,室温高速离心1min,取上清液,进行10%SDS-PAGE电泳鉴定㊂1.5.2㊀目的蛋白的可溶性分析㊀100μL过夜培养的阳性菌液转接到100mL LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)中,37ħ,200rpm,培养至OD600约为0．6,IPTG诱导4h㊂用50mL大离心管,6000rpm,离心5min,弃上清㊂沉淀用20mL冰冷的Lysis buffer(50mmol/L Na3PO4㊁300 mmol/L NaCl,pH8.0)溶液吹散,进行冰上超声:超5s,停10s,超100次,功率200W㊂电泳确定表达形式:取100μL超声后的菌悬液,4ħ,10000 rpm,离心10min㊂取40μL上清液至另一EP管,同时将沉淀用40μL Lysis buffer(pH8.0)溶液吹散,两管分别加入10μL5ˑSDS-Loading buffer, 100ħ煮3min,10%SDS-PAGE检测㊂1.6㊀目的蛋白的纯化及Western blotting参考Ren[4]等方法,对蛋白进行复性纯化及Western blotting㊂2㊀结果与分析2.1㊀融合表达载体pET-28a(+)-Sm1的诱导表达和SDS-PAGE表达分析设置不同的诱导温度(37ħ㊁28ħ㊁24ħ)诱导表达4h,观察蛋白诱导表达的差异情况(图1),结果发现随着诱导温度的降低,目的蛋白诱导表达量逐渐增加㊂28ħ和24ħ时目的蛋白的表达量大于37ħ时诱导的蛋白表达量,说明低温诱导有助于增加重组蛋白的产率㊂Fig.1㊀SDS-PAGE analysis of recombinant protein at different temperature Lane1,3,5:Recombinant protein in the absence of IPTG at 37ħ,28ħ,24ħ;Lane2,4,6:Recombinant protein in the presence of IPTG for4h at37ħ,28ħ,24ħ.533㊀植物病理学报42卷2.2㊀目的蛋白可溶性分析SDS-PAGE 电泳发现(图2),目的诱导蛋白主要集中在沉淀中,而在上清液中几乎没有出现目的蛋白,说明目的蛋白主要以包涵体形式存在于大肠杆菌中,为不可溶㊂2.3㊀目的蛋白的纯化及Western blotting将上清液和沉淀分别加入SDS-上样缓冲液分别进行电泳,结果在沉淀中得到了初步纯化的目的蛋白(图3)㊂对不同含量的纯化蛋白,进行Wes-tern 杂交,检测目的蛋白,结果发现目的条带均能出现杂交信号(图4)㊂Fig.2㊀SDS-PAGE analysis of recombinantproteinM :Marker ;Lane 1:Total cell proteins in non-induced E.coli cells ;Lane 2:Total cell proteins in induced E.coli cells for 4h ;Lane 3,4:Soluble fractions and insoluble fractions of total cell proteins in induced E.coli cells for 4h.Fig.3㊀SDS-PAGE analysis of the purified fu-sion proteinLane M :Marker ;Lane 1:Purified fusionprotein.Fig.4㊀Western blotting of recombined Sm1proteinProtein blots were probed with ne 1:3μL protein ;Lane 2:5μL protein ;Lane 3:10μL protein ;Lane 4:15μL protein.3㊀结论与讨论本文利用原核表达系统对绿木霉Sm1蛋白进行了表达,在IPTG 为1mmol /L ,24ħ诱导4h 时产率较高,可溶性分析显示该蛋白以包涵体形式存在㊂作为有益的生防微生物,木霉菌可产生多种具有诱导抗性功能的激发子,如疏水蛋白㊁次生代谢物㊁有抗菌活性的酶类等㊂近年发现Sm1在功能上属于一种效应因子,可激发宿主植物发生ETI 反应[5]㊂Djonovic [3]等研究表明,在不同营养条件下,Sm1能在真菌整个生长发育过程中表达,利用过表达子处理玉米根系,进行炭疽病菌(Colletotri-chum sp.)的接种,发现木霉菌株的Sm1高水平表达与玉米叶片茉莉酸诱导增加和发病程度下降呈正相关,因此可以将Sm1作为一种免疫诱导因子,使之在田间病害防治中发挥重要作用,并为进一步利用该基因构建转基因抗病品种㊁创制蛋白农药提供重要资源㊂参考文献[1]㊀Hanson L E ,Howell C R.Elicitors of plant defenseresponses from biocontrol strains of Trichoderma virens [J ].Phytopathology ,2004,94:171-176.[2]㊀Djonovic S ,Pozo M J ,Dangott L J ,et al .Sm1,aproteinaceous elicitor secreted by the biocontrol fungus Trichoderma virens induces plant defense responses and systemic resistance [J ].Molecular Plant-Microbe Inter-actions ,2006,19:838-853.[3]㊀Djonovic S ,Vargas W A ,Kolomiets M V ,et al .Aproteinaceous elicitor Sm1from the beneficial fungus Trichoderma virens is required for induced systemic re-sistance in maize [J ].Plant Physiology ,2007,145:875-889.[4]㊀Ren X ,Wu Z Y ,Huang C L ,et al .Expression andpurification of Arabidopsis FT gene in prokaryotic cells (in Chinese )[J ].Biotechnology Bulletin (生物技术通报),2010,3:99-103.[5]㊀Lorito M ,Woo S ,Harman G ,et al .Translational re-search on Trichoderma :from Omics to the field [J ].Annual Review of Phytopathology ,2010,48:395-417.责任编辑:于金枝633。
