下载文档原格式
双光子显微成像原理及近期应用案例双光子显微成像是一种高分辨率的成像技术，它利用两个光子的共同作用实现对生物样本的成像。
该技术在生命科学、医学和材料科学等领域有着广泛的应用。
本文将介绍双光子显微成像的原理，并探讨其在近期的应用案例。
双光子显微成像的原理是基于非线性光学效应。
在传统的荧光显微镜中，利用单光子的激发来激发和探测样品中的荧光信号。
然而，单光子的能量较高，容易导致样品的光化学损伤和细胞的光毒性作用。
而双光子显微成像则采用两个光子的准同步非共线激发，以降低光毒性并增加分辨率。
双光子显微成像的工作原理是通过使用超短脉冲激光来激发样品中的荧光物质。
这种超短脉冲激光具有高能量浓度和高峰值功率，可以实现光穿透较深的样品，如活体组织。
当两个光子同时到达荧光物质并被吸收后，它们的能量叠加，使得荧光物质处于激发态，进而发出荧光信号。
通过检测和记录这些荧光信号，可以获取样品的高分辨率图像。
在生命科学领域，双光子显微成像因其高分辨率和非侵入性的优势而得到广泛应用。
例如，研究者可以利用双光子显微成像技术观察细胞内的亚细胞器、蛋白质分子和细胞结构的变化。
双光子显微成像还可以用于监测神经元活动和细胞信号传导等重要生理过程。
通过对这些生物学过程的观察和研究，我们可以更好地理解生命的本质和疾病的发生机制。
近年来，双光子显微成像在医学诊断和治疗方面也取得了重要进展。
例如，在皮肤科领域，双光子显微成像可以非侵入性地观察皮肤水分含量、胶原蛋白分布和血管结构等，从而帮助医生诊断和治疗各种皮肤病。
另外，双光子显微成像还可以用于术前虚拟操作和手术引导等方面，提高手术的准确性和成功率。
例如，在眼科手术中，医生可以利用双光子显微成像技术精确地观察眼底血管和细胞变化，从而为患者提供更好的治疗方案。
除了生命科学和医学领域，双光子显微成像还在材料科学、纳米技术和能源研究等领域得到广泛应用。
例如，研究者可以利用双光子显微成像技术观察材料中的晶格结构、电子云变化和界面反应等，为新材料的设计和合成提供重要的参考。
激光扫描共聚焦显微镜技术Laser Scanning Confocal Microscope——基础篇李治国细胞的内在生活显微镜的发展史没有显微镜就不可能有细胞学诞生。
1590年，荷兰眼镜制造商J 和Z.Janssen 父子制作了第一台复式显微镜。
1665年，英国人Robert Hook首次描述了植物细胞(木栓，命名为cella 。
1680年，荷兰人A.van Leeuwenhoek成为皇家学会会员，他一生中制作了200多台显微镜和400多个镜头，用设计较好的显微镜观察了许多动植物的活细胞与原生动物。
Made by A.van Leeuwenhoek (1632-1723.Magnification ranges at 50-275x.显微镜的最重要参数——分辨力显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution ）有关。
分辨率是指区分开两个质点间的最小距离各种显微镜的分辨能力光学显微镜（light microscopy）0.2μm电子显微镜 (Electro microscopy 0.2nm扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope 0.2nm以下 1932年，德国人M.Knoll 和E.A.F.Ruska 发明电镜，1940年，美、德制造出分辨力为0.2nm 的商品电镜。
1981年，瑞士人G.Binnig 和H.RoherI 在IBM 苏黎世实验中心（Zurich Research Center）发明了扫描隧道显微镜而与电镜发明者Ruska 同获1986年度的诺贝尔物理学奖。
常用的光学显微镜（light microscopy普通光学显微镜暗视野显微镜相差显微镜偏光显微镜微分干涉显微镜荧光显微镜激光共焦扫描显微镜普通光学显微镜原理普通光学显微镜原理图1. 构成：①照明系统②光学放大系统③机械装置2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。
激光共聚焦显微镜的原理和应用1. 引言激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种高分辨率的显微镜技术，已经广泛应用于生物学、医学和材料科学等领域。
本文将介绍激光共聚焦显微镜的原理和应用。
2. 原理激光共聚焦显微镜通过激光束的共聚焦和通过物体的反射或荧光发射来实现图像的采集。
2.1 激光共聚焦•通过透镜来聚焦激光束•聚焦点在样本表面上产生光斑•样本反射或发射出来的光再次通过透镜，聚焦到探测器上•透镜的位置可以移动，可以扫描整个样本2.2 反射和荧光信号的采集•激光束照射到样本上，经过反射或荧光发射•光学系统收集并聚焦这些发射的光•通过探测器记录下发射光的强度和位置•通过移动透镜和探测器，可以获得样本的三维图像3. 应用激光共聚焦显微镜在许多领域都得到了广泛的应用，以下是其中的几个典型应用。
3.1 细胞生物学•可以观察细胞的形态和结构•可以追踪细胞内的生物分子运动•可以观察细胞的生物化学过程3.2 分子生物学•可以观察和定量细胞器的分布和聚集情况•可以观察和测量分子的扩散速率•可以研究蛋白质的合成和代谢过程3.3 医学研究•可以观察和诊断组织和器官的病理变化•可以研究疾病的发生和发展机制•可以评估治疗方法的有效性和副作用3.4 材料科学•可以观察材料的微观结构和表面形貌•可以研究材料的热力学和力学性质•可以评估材料的耐久性和可靠性4. 总结激光共聚焦显微镜是一种高分辨率的显微镜技术，通过激光束的共聚焦和物体的反射或荧光发射来实现图像的采集。
它在细胞生物学、分子生物学、医学研究和材料科学等领域都有着广泛的应用。
利用激光共聚焦显微镜，科研人员可以观察和研究生物和材料的微观结构、功能和相互作用，为科学研究和应用提供了强大的工具。
激光共聚焦扫描显微镜成像的基本原理激光共聚焦显微镜（LCM）是近年来发展起来的一种高分辨率荧光显微成像技术。
它通过将样品置于激光束的焦点处，利用高灵敏度的探测器记录样品发出荧光信号，从而实现对样品内部结构的高分辨率成像。
本文将详细介绍LCM的基本原理、成像途径、成像原理及优缺点等方面的内容。
一、激光共聚焦显微镜的基本原理激光共聚焦显微镜基于利用激光束在三维空间内聚焦成极小的点状光斑，对样品进行扫描成像的技术原理。
在聚焦点位置，通过聚焦光斑的极高光密度，激活样品中的荧光染料，荧光染料则针对特定的结构在荧光信号波长处发出荧光信号，被高灵敏度荧光探测器探测并记录下来，然后通过计算机处理、分析和重建，生成高质量的高分辨率图像。
与普通显微镜最大的区别在于，普通显微镜由于透过整个样品并以相位差效应成像，而激光共聚焦显微镜由于仅仅聚焦于样品表面的非常窄的一点，信号只能从聚焦点的附近探测到，而且该点在扫描过程中会不断变换位置。
换言之，成像并不是透过整个样品实现，而是在样品上面扫描得到，并聚焦于单个点上。
对于毫米量级的样品，其层面精度可以达到25nm。
二、激光共聚焦显微镜成像途径激光共聚焦显微镜的成像途径目前有两种，分别为单光子激发型和双光子激发型。
1、单光子激发型单光子成像模式是利用激光束在荧光染料上发生的单光子激发效应进行成像的一种方式。
在单光子激发光下，荧光染料的各自精细结构会发生辐射跃迁产生能量并发射荧光，同时发射时间对荧光能量的传递产生影响，可以通过荧光转移速率反映。
荧光束在被激活后，将以光子流的形式反射回来，被共聚焦显微镜探测并捕捉。
2、双光子激发型双光子成像模式使用了两次光子激发效应，产生高到对比度的图像，并最小化了样品在激发时所受的损伤输出功率。
双光子成像所需条件包括至少两个光子激发、空间和时间上的集中在样品特定区域。
在这种情况下，激光光束相互作用，将样品中转运载分子激发成放射的谐振态发生荧光发射。
激光共聚焦显微镜的原理与应用范围讲解激光共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope, CLSM）是一种高分辨率的显微镜技术，它利用激光束进行点扫描，将样品的不同深度处的信息获取并合成，从而实现三维图像的获取。
本文将对激光共聚焦显微镜的原理和应用范围进行详细介绍。
首先是激光扫描。
激光束通过空气透镜和扫描镜反射，聚焦在样品上。
扫描镜以一个固定的频率和幅度来快速振动，使得激光束扫描在样品表面，形成二维扫描像。
其次是共焦原理。
共焦显微镜利用一个空孔径光阑（pinhole）来调整激光束的直径，只允许经过焦平面的光通过，其他散射光被阻挡。
这样可以消除在光路上不同深度处的散射光干扰，提高图像的纵向分辨率。
同时，由于只有通过焦平面的光才能进入探测器，所以可以采集不同深度处的信息，合成三维图像。
最后是探测技术。
通常激光共聚焦显微镜会配备一个光电探测器，并通过探测器来收集散射和荧光光信号。
散射光可以用来形成反射式图像，而荧光光信号则可以用来观察标记了特定分子或细胞的样品。
通过调整激光的波长和探测器的设置，可以实现不同特定分子和结构的成像。
1.细胞和组织成像：激光共聚焦显微镜可以提供高分辨率的细胞和组织成像。
通过荧光标记特定蛋白质或细胞结构，可以观察和研究细胞内部的生物过程和结构。
2.神经科学：激光共聚焦显微镜在神经科学中的应用得到了广泛关注。
可以观察和追踪神经元的形态和功能，研究神经网络的连接和活动，揭示神经系统的工作机制。
3.生物医学研究：激光共聚焦显微镜在生物医学研究中也扮演着重要的角色。
可以用于癌症细胞的培养和观察，研究癌症的发生和发展机制。
还可以用于研究哺乳动物早期发育过程中的细胞分化和组织形态的变化。
4.材料科学：激光共聚焦显微镜可用于对材料的表面和内部结构进行观察和分析。
可以研究纳米材料的形貌和组成，观察材料的晶体结构和缺陷。
总之，激光共聚焦显微镜是一种重要的显微镜技术，具有高分辨率、三维成像和可观察特定分子和结构的能力。
共聚焦激光扫描显微镜技术在医学研究中的应用上世纪80年代发展起来的一种先进的细胞生物学分析仪器,是一项具有划时代意义的高科技新产品,是近代生物医学图像分析仪器最重要的发展之一,有细胞“CT”之称。
它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置,利用计算机进行图像处理,使用紫外线或可见光激发荧光探针,从而得到组织内部微细结构的荧光图像,在亚细胞水平上观察诸如Ca2+,pH值、膜电位等生理信号及细胞形态改变,成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代较有力的研究工具。
1 基本构造与原理 CLSM是将光学显微镜技术、激光扫描技术和计算机图像处理技术结合在一起的一种高尖设备。
其主要由计算机系统、激光发射系统、探子系统、X-Y轴台阶系统和Z轴前进马达构成。
计算机系统一般由不同型号的CLSM作相应硬件配置及相应的图像采集、分析、离子测定等软件配置。
激光器通常是氪-氩离子混合激光管,可有多个激光波长。
按工作介质不同,激光器可分为气体、固体、染料和半导体等几种。
而近年来问世的双光子激光器具有更明显的优势。
“双光子”具有更强的穿透力,更为重要的是其比普通的CLSM的激光能量低,因此对活细胞的损伤更小, 同时减少高能量激光对荧光染料的漂白效应,从而使观察活细胞的实验过程延长。
CLSM采用点光源代替传统光镜的场光源,使探测点与照明点相对于物镜焦平面是共扼的。
焦平面以外的点不会在探测点处成像,只有焦平面上的点同时聚焦于探测点和照明点,即共聚焦。
以激光做光源并对样品进行扫描,在此过程中两次聚焦,因此称为共聚焦激光扫描显微镜。
2 主要优点 . 提高了敏感性及分辨率使用荧光素交联的抗体来测定细胞内的某些特异性参数在生物医学研究中已基本普及应用,但常常受到不在同一焦平面上的荧光干扰,而造成本底较高、组织结构细节不易分辨清楚。
CLSM的分辨率高于普通光镜,同时CLSM将高敏感性的光电倍增管合为一体,并应用数字滤过功能, 使信噪比最佳化,尽可能地排除了焦点以外的荧光干扰。
激光共聚焦显微镜的原理和应用李楠王黎明杨军关键词激光; 显微镜; 原理和作用中国图书资料分类法分类号R 318. 51激光共聚焦显微镜是80年代发展起来的一项划时代意义的高科技新产品, 它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置, 利用计算机进行图象处理, 使用紫外或可见光激发荧光探针, 从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象, 在亚细胞水平上观察诸如Ca 2+、pH 值, , 成为形态学, , , 学, 1994, 了目前世界次最高, 功能最全的美国M eridian 公司的产品:A cas 系列U lti m a 型和扫描速度最快的In sigh t 型两台激光共聚焦仪。
仪器自1995年5月份到货安装以来, 已为我院7个科室的10个课题所应用, 目前主要开展的研究内容有:(1 细胞内游离钙的实时监测; (2 细胞通讯的研究; (3 细胞形态学的研究。
1基本原理和功能1. 1基本原理传统的光学显微镜使用的是场光源, 标本上每一点的图象都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰; 激光共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描, 标本上的被照射点, 在探测针孔处成像, 由探测针孔后的光电倍增管(PM T 或冷电耦器件(cCCD 逐点或逐线接收, 迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图象。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭作者单位解放军总医院实验仪器中心, 北京100853的, 焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔, 焦平面以外的点不会在探测针孔处成像, 这样得到的共聚焦图象是标本的光学横断面, 克服了普通显微镜图象模糊的缺点。
在显微镜的载物台上加一个微量步进马达, 可使载物台上下步进移动, 最小步进距离为的0. 1Λm , 能清楚地显示, 实现了的目的, 这就是21. . CT ”功能通过狭缝扫描技术将我们对细胞的研究由多层迭加影像推进到真正的平面影像水平, 使图像更加清晰, 从而为分子细胞生物学的深入研究拓宽了视野。
