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动物肌肉组织中甾类同化激素多组分残留的液相色谱_质谱检测方法

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动物肌肉组织中甾类同化激素多组分残留的液相色谱2质谱检测方法秦　燕　陈　捷3　张美金(广州出入境检验检疫局食品实验室,广州510623)摘　要　建立了不同动物肌肉中甾类同化激素(表睾酮、丙酸睾酮、192去甲基睾酮、甲基睾酮、孕酮、甲羟孕酮、雌二醇、雌三醇、炔雌醇、雌酮)多残留量的LC /M S/M S 确证方法。

样品加醋酸缓冲溶液均质,加酶溶液酶解后,再加甲醇超声提取,用叔丁基甲醚液2液萃取至少2次,之后经反相固相萃取柱净化,以乙腈2水为流动相,经C 18柱分离后进行LC /MS/MS 多反应监测模式下的定性及定量分析。

其中雄激素,孕激素采用正离子扫描,雌激素则采用负离子扫描。

17beta 2NT 、M TS 、ETS 、ME D 、PG 、PTS 、EST 、17beta 2ES 、EES 和ES N 的定量检出限为0.5～1.0μg/kg 。

在1.0μg/kg 的定量检出限添加水平,上述10种激素的平均回收率为55%～77%;相对标准偏差为7.1%～35%。

可实现样本灵敏、准确的定性定量分析。

关键词　甾类同化激素,多残留分析,反相固相萃取,液相色谱2质谱联用　2005205214收稿;2005208219接受本课题为国家科技部“十五”科技攻关项目(No .2001BA804A11)基金资助1　引 言激素(hor mone )是生物体内产生的一类调节机体代谢或生理功能的微量物质。

滥用同化激素,对人和动物健康,对社会和生态环境都会造成直接或潜在的危害。

上世纪80年代以来,许多国家或组织通过立法限制或禁止在食用性动物饲养中使用同化激素。

国外有关尿、血、组织中甾类同化激素(anabolicster oids,ASs )残留检测的文献报道较多[1,2],主要有气/质联用法[3,4]、液/质联用法[5,6]、高效液相色谱法[7～9]等。

我国于90年代起禁止将ASs 用于促生长目的,并开始相关的监测工作。

但目前尚没有成熟的针对动物源性食品中其残留检测的确证方法。

本实验通过对ASs 多残留测定的研究,建立了不同动物肌肉中甾类同化激素多残留的LC /MS/MS 测定方法。

2　实验部分2.1　仪器与试剂I K A T18匀质器(美国U ltra Turrax 公司);Ya mat o8210型水浴超声波发生装置(B rans on 公司);5810型离心机(德国Eppendorf 公司);旋转蒸发仪(德国Heidol ph 公司);氮气浓缩仪(美国Zy mark 公司);M illi 2Q 去离子水发生器(美国M illi pore 公司);12通道半自动固相萃取装置(美国Supelco 公司)。

液相色谱2质谱联用仪(美国AP I 公司);Agilent 1100液相色谱系统(美国Agilent 公司),含G1313A 四元泵、G1313A 自动进样器和G1316A 柱温箱;AP I 3000三级四级杆串联质谱(采用Turbos p ray ESI 电离源)。

标准品见表1。

除ETS 购自Sig ma 2A ldrich 公司外,其余标准品均来自R iedel 2de aen 公司。

配制混合激素的甲醇贮备溶液100mg/L,置于-18℃避光存放。

吸取贮备溶液1.0mL,用甲醇定容至100mL 得到1.0mg/L 的工作溶液,绘制校准曲线时用乙腈/水(V /V =50/50)逐级稀释工作溶液。

甲醇、叔丁基甲醚、乙腈和甲苯,均为HP LC 级(Merck 公司);β2葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶水溶液(EC3.2.1.31+EC3.1.6.1,Helix pomatia,Merck No .4114),W aters T M Sep 2Pak λC 18(500mg/3mL )固相萃取柱;醋酸缓冲溶液(0.04mol/L,pH 5.0):称取43.0g Na Ac ・3H 2O 用水溶解,加入25.2g 冰乙酸用水定容至1000mL 。

2.2　样品前处理2.2.1　制样　称取剔除骨、皮的动物肌肉组织样本100～200g,用家庭用搅拌器制样后,于-18℃密封第34卷2006年3月 分析化学(FE NX I HUAXUE )　研究报告Chinese Journal of Analytical Che m istry 第3期298～302保存。

2.2.2　匀质和酶解　称取5.0g 试样(精确至0.1g )至50mL 离心管中,加入10mL 醋酸缓冲溶液,用匀质器于10000r/m in 匀质2×20s 后,加入100μL 酶溶液,混合物于37℃恒温酶解约3～4h 。

进行添加实验时,于匀质后加适量的混合标准溶液至离心管中,室温下静置10～15m in 后加入酶溶液,然后同上进行水解反应。

2.2.3　提取和净化　于酶解后的混合物中加入15mL 甲醇,在旋涡振荡表1　同化激素标准品Table 1　The standard compound of anabolic hor mones同化激素Anabolic hor monesCAS 2No .分子式For mular 纯度(%)Purity 表睾酮Ep itest oster one,EST 48123021C 19H 28O 2>99.0丙酸睾酮Test oster one 172p r op i onate,PTS5728522C 22H 32O 399.8192去甲基睾酮Andr ol one,17β2NT43422220C 22H 32O 399.8甲基睾酮17α2Methyltest oster one,MTS5821824C 20H 30O 299.4孕酮Pr ogester one,PG5728320C 21H 30O 299.5甲羟孕酮Medr oxyp r ogester one,MED52028524C 22H 32O 398.4雌二醇17β2estradi ol,17β2ES 5022822C 18H 24O 299.9雌三醇Estri ol,EST5022721C 18H 24O 399.8炔雌醇17α2Ethinylestradi ol,EES 5726326C 20H 24O 298.7雌酮Estr one,ES N5321627C 18H 22O 299.0　CAS 2No .:Che m ical Abstracts Service number .器上充分涡动混合1m in 后,置于超声波发生器中,室温下超声提取5m in 。

取出离心管,于4000r/m in 离心10m in,将上清液全部转移至另一离心管中,加入20mL 叔丁基甲醚溶液涡动混合后以3500r/m in 离心3m in,移取上清至旋转蒸发瓶中,下层溶液用叔丁基甲醚溶液重复萃取步骤,合并离心后的上清溶液,用旋转蒸发仪于40℃水浴中蒸发至干。

加0.5mL 甲醇溶解残渣,再加水5mL 稀释。

之后用C 18固相萃取柱净化,收集甲醇洗脱液6mL,并在40℃水浴下用氮气浓缩仪将溶剂蒸干。

将残渣用乙腈2水溶液(50∶50,V /V )溶解,并定容至0.5mL,经0.45μm 滤膜过滤,待测。

2.3　分析方法2.3.1　色谱条件　色谱柱:S UPELCO D iscovery λC 18柱,15c m ×2.1mm (i .d .),5μm;柱温:35℃;流动相:乙腈溶液(A )和水溶液(B );流速:0.3mL /m in;进样量:10μL 。

流动相洗脱梯度:雄激素和孕激素:0.01m in A 50%(<),15.0m in A 100%(<);雌激素:0.01m in A 60%(<),15.0m in A 50%(<)。

2.3.2　质谱参数　离子源:Turbo I ons p ray ESI 电离源;雾化气、气帘气和加热辅助气为N 2,流量7.5L /m in 。

雾化气(NEB ):12;气帘气(CUR ):8;离子源温度(TE M ):550℃;碰撞气(CAD ):7.0;入口电压(EP ):10V 。

在正离子模式下,电离电压(I S ):3000V;去簇电压(DP ):40V;聚焦电压(FP ):210V;池出口电压(CXP ):15V 。

在负离子模式下,电离电压(I S ):-4000V;去簇电压(DP ):-90V;聚焦电压(FP ):-380V;池出口电压(CXP ):10V 。

监测模式:采用MR M 多反应监测方式。

母离子(Q1)/子离子(Q3)离子对均设为单位分辨。

雄激素和孕激素在正离子模式下监测,各离子对的驻留时间(dwell ti m e )均为100m s 。

雌激素在正离子模式下监测,各离子对的驻留时间(dwell ti m e )均为150m s 。

各种雄激素、孕激素和刺激素的特征监控离子见表2和表3。

3　结果与讨论3.1　色谱分离在用质谱检测之前,先用液相色谱对激素分离进行了条件实验选择了D iscovery C 18柱(250mm ×416mm ,i .d .,5μm )为分离柱,乙腈2水为流动相,通过梯度运行。

用质谱检测时发现,单纯在正离子模式或负离子模式下监测10种激素时,10种激素不能够同时达到最高响应值。

通过实验,采用正离子模式监测雄激素和孕激素,采用负离子模式监测雌激素,并对离子源和气体的相关参数进行了优化,得到的液2质联用总离子色谱图,见图1和图2。

由图中可以看出各种激素得到了满意的分离及响应。

3.2　M S /M S 特征诊断离子的选择同化激素极性中等,脂溶性较高。

虽然采用大气压化学电离(APC I )作为离子源其响应灵敏度会更高,但电喷雾电离(ESI )离子源在满足检出限要求的基础上,更易操作和维护,因此选用ESI 源。

由于激素分子结构的差异,雄激素和孕激素的分子离子为正电离模式下获得的[M +H ]+,雌激素因含有酚羟基结构(苯甲酸雌二醇BES 例外),其分子离子峰为负电离模式下获得的[M -H ]-。

见图3和图4。

以乙腈2水(50∶50,V /V )为基准流动相,采用“T ”三通方式,分别获得的各个雄激素、孕激素和雌激992第3期秦　燕等:动物肌肉组织中甾类同化激素多组分残留的液相色谱2质谱检测方法素的分子离子诱导产生的特征碎片离子扫描图。

结合基质空白和基质标准液的离子扫描图,优化参数,从而相应地确定了各种激素在多反应监测模式下信号采集的特征离子对,见表2和表3。

表2　MR M 监测模式下雄激素和孕激素的特征诊断离子Table 2　The diagnostic i on of andr ogens and p r ogestins acquired in multi 2reacti on monitering (MR M )mode组分Compound 母离子Q1Parent i on Q1m /z [M +H ]+保留值R f(m in )诊断离子Q1/Q3D iagnostic i ons Q1/Q3(op ti m ised collisi on energy,CE,unit:eV )17β2NT 275.4 2.88109.1(40) 257.0(25) 239.3(25)MTS 303.0 3.8097.3(40) 109.1(40) 285.4(25)ETS 289.3 4.1497.3(38) 109.1(38) 253.3(28)MED 345.2 5.4297.3(40) 123.1(40) 327.4(25)PG 315.37.2797.3(39) 109.1(39) 297.4(25)PTS345.211.3297.3(40) 109.1(40) 253.3(27)表3　MR M 监测模式下雌激素的特征诊断离子Table 3　The diagnostic i on of estr ogens acquired in MR M mode组分Compound 母离子Q1Parent i on Q1m /z [M -H ]+保留值R f(m in )诊断离子Q1/Q3D iagnostic i ons Q1/Q3(op ti m ised collisi on energy,CE,unit:eV )EST 287.1 2.06171.2(50)　145.2(55)　183.1(55)17β2ES 271.1 4.82145.2(55)　183.1(55)　169.0(60)EES 295.1 6.30145.2(58)　159.0(47)　183.1(58)　199.0(55)ES N269.06.82145.2(55)　159.0(50)　183.1(50)3.3　样品处理条件的选择及优化3.3.1　ASs 轭合物的酶解　肌肉中的ASs 残留以原型药物为主,还有一定比例的轭合物残留。

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超高效液相色谱-串联质谱法测定动物肌肉组织和鸡蛋中残留的11种甾体激素类药物

超高效液相色谱-串联质谱法测定动物肌肉组织和鸡蛋中残留的11种甾体激素类药物


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文 章 编 号 ：1 0 0 0 8 7 1 3 ( 2 0 0 8 ) 0 6 0 7 1 4 0 6
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栏 目 类 别 ：研 究 论 文
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高效液相色谱-串联质谱法建立同时测定肌肉组织中4种药物残留的方法及其确认

高效液相色谱-串联质谱法建立同时测定肌肉组织中4种药物残留的方法及其确认

高效液相色谱-串联质谱法建立同时测定肌肉组织中4种药物残留的方法及其确认HPLC-MS/MS法具有较高的灵敏度和特异性，能够同时对多种物质进行定量分析，具有准确性高、分析速度快、操作简便的特点，在药物残留的监测分析中具有广泛的应用前景。

本文将着重介绍HPLC-MS/MS法在同时测定肌肉组织中4种常见药物残留的方法建立以及其确认的过程。

1.试验材料与试剂（1）仪器设备：Agilent 1290高效液相色谱系统，AB SCIEX Qtrap5500质谱仪；（2）色谱条件：色谱柱为C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-水，梯度洗脱 eluent A（0.1%甲酸水溶液）、eluent B（乙腈）,洗脱程序为：0-2 min,5% B;2-10 min, 5%-95% B; 10-12 min, 95% B；12-14 min, 5% B,流速为0.8mL/min,进样体积为10μL；（3）质谱条件：离子源为电喷雾（ESI）离子源，离子源温度为400℃，离子源电压为5500V，干燥气体流量为10L/min，正离子模式进行多反应监测/多级三重四级杆透射扫描。

2.样品的制备与预处理（1）待测肌肉组织样品，取适量样品称重，将其置于50 mL离心管中；（2）加入10倍体积乙腈溶液，加标内标溶液，造成终浓度为0.1 μg/mL；（3）超声振荡10 min，1000转/min；（4）15000×g离心10 min；（5）取上清液过滤入样瓶即可进行HPLC-MS/MS检测。

3.方法验证（1）线性范围：制备不同浓度的混合标准溶液，进行定量分析，并绘制药物残留浓度与响应值的标准曲线；（2）灵敏度：测定限（LOD）和定量限（LOQ）；（3）精密度和重现性：测定不同浓度水平的样品进行10次测定，计算相对标准偏差RSD；（4）稳定性：对同一样品进行连续6次测定，检测其稳定性；（5）准确度：进行回收率试验，添加不同浓度的标准品进行测定。

气相色谱—质谱法在食品检测中的应用

气相色谱—质谱法在食品检测中的应用

【关键词】气象色谱； 质谱法； 食品检测 【作者简介】蒯霞，江苏省宝应县疾病预防控制中心助理工程师
目前通过立法来禁止或限制在食用性动物养殖中使用 同化激素，但由于 利 益 驱 动，在 世 界 范 围 内 同 化 激 素 仍 在 被 大量滥用。国外有关组织、血、尿中 ASs 残留检测的文献报 道较多，多集中在分析屠宰现场采集的高浓度靶组织或活体 动物的尿液。用于 ASs 检测的方法主要有气相色谱 － 质谱 法、气相色谱 － 质谱联用法、高效液相色谱法等。我国于 20 世纪 90 年代起开始禁止将甾类同化激素 ASs 用于促生长目 的，并开始相关的监测工作。但目前在国内尚没有成熟的针
产业与科技论坛 2012 年第 11 卷第 3 期
气相色谱 － 质谱法在食品检测中的应用
□蒯 霞
【摘 要】随着社会的发展，人们对健康的关注程度也是不断的提高，对食物的质量的要求更是不断的提高。与此同时，气象色 谱 － 质谱法在各种食物质量的检测中的应用也逐渐的得到了广泛的应用与推广。本文将以气象色谱 － 质谱法检测 动物肌肉组织中残留的甾类同化激素为例，对气象色谱 － 质谱法在食品检测中的应用进行研究。建立不同动物肌肉 中甾类同化激素残留的气相质谱、色谱检测方法。将样品经过组织组织捣碎、酶解和超声提取后，用反相固相萃取和 叔丁基甲醚萃取柱净化，进一步衍生后进行气象色谱 － 质谱分析，分别测定甲基睾酮、19—去甲基睾酮、丙酸睾酮、雄 激素和苯甲酸雌二醇、雌酮、炔雌醇、雌三醇、雌激素。实验结果表明，MTS、ETS、17fl—NT、PTS、17fl—ES、EES 、BES、 ESN 和 EST 的定量检测限为 1． 0 ～ 2． 0 微克 / kg。在 2． 0 微升 / kg 的定量检测低限添加水平，上述 9 种激素的平均回 收率为 62． 5% ～ 80． 5% ，相对标准偏差为 12． 5% ～ 26． 8% 。该法可实现对样品进行准确、灵敏的定性定量分析。
高效液相色谱-串联质谱法建立同时测定肌肉组织中4种药物残留的方

高效液相色谱-串联质谱法建立同时测定肌肉组织中4种药物残留的方

DOI：10.16661/ki.1672-3791.2020.03.230高效液相色谱-串联质谱法建立同时测定肌肉组织中4种药物残留的方法及其确认①夏玲玲(南京市高淳区综合检验检测中心 江苏南京 211300)摘 要：目的 研究与分析高效液相色谱-串联质谱法建立同时测定肌肉组织中4种药物残留的方法及其确认情况。

方法 采取高效液相色谱-串联质谱分析方法来同时建立测定肌肉组织中新霉素、多黏菌素B、灰黄霉素、喹乙醇以及其代谢物3-甲基喹啉-2-羧酸，同时采取外标法定量。

结果 在质量浓度1.0~200.0g/L范围内，4种药物均表现出良好的线性关系，且R 2均超过0.9980。

喹乙醇及MQCA的方法检出限为0.5g/kg，灰黄霉素、新霉素以及多黏菌素B的方法检出限为5.0g/kg，4种药物在阴性样品中的加标回收率为82.1%~98.5%。

结论 采取高效液相色谱-串联质谱法来进行处理，操作简单便捷，对结果干扰性较小，可以加以广泛应用。

关键词：高效液相色谱-串联质谱法 肌肉组织 药物残留中图分类号：X824 文献标识码：A 文章编号：1672-3791(2020)01(c)-0230-02随着药物的滥用，在动物肌肉组织中会残留很多药物，目前已经有部分报道了灰黄霉素、喹乙醇、黏菌素以及新霉素等药物的检测方法，很多法律法规也对各类药物的检测方法进行了规定[1]。

该文对高效液相色谱-串联质谱法建立同时测定肌肉组织中4种药物残留的方法及其确认情况进行研究与分析，现报道如下。

1. 材料与方法1.1 材料和试剂试验样品选取购买自市场的8份猪肉，4份兔肉以及8份鸡肉。

试剂选取德国Dr.Ehrenstorfe公司生产的纯度＞99.0%的MQCA、纯度＞99.0%的喹乙醇、纯度＞84.0%的硫酸多黏菌素B、纯度＞98.0%的灰黄霉素、纯度＞90.0%的硫酸新霉素标准品。

德国Merck公司生产的乙腈以及甲醇。

此次试验均为超纯水，同时该实验使用甲酸为上海安谱实验科技股份有限公司生产，分析纯为广州化学试剂厂生产。