Acr-Bis(30%,291)

SDS-PAGE凝胶电泳测蛋白质分子量一、药剂准备a、SDS-PAGE凝胶配制试剂：1、30%Acr-Bis(29:1) 100ml2、1M Tris-HCL,PH8.8 100 ml3、10%SDS 5ml4、Ammonium persulfate (过硫酸铵) 0.5克先配制成10%的溶液以备用，如0.0625g/625ul无菌水。

可可5、TEMED 0.5 ml6、1M Tris-HCL,PH6.8 15mlb、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）2ml，1ml/管，共2管c、蛋白质分子量标准（200ul）d、SDS-PAGE电泳液（1L）由SDS-PAGE电泳液（粉剂）1瓶，已配置好1L在玻璃大试剂瓶中保存，可重复利用。

（不宜超过两周）e、考马斯亮染色液（250ml）f、考马斯亮染色脱色液（500ml）注：脱色液可按如下比例配制（按说明书）：甲醇或者乙醇乙酸250ml 80ml去离子水补至 1000ml,混匀，备用。

二、器材准备移液枪（绿色：100-1000ul, 蓝色：10-100ul, 白色：2-20ul）,不同规格的微量进样针，电泳仪，电泳槽，烧杯，加热器，培养皿，浮子，镊子三、SDS-PAGE 分析操作过程：1、配制蛋白质溶液用试管配制好0.05g/10ml的蛋白质清液。

确保质量分数为3～5g/L。

试管依次标号1、2、3、4、5。

用保鲜膜和皮筋封口保存备用。

最好当天现配。

2、制分离胶（即下胶层）鉴于本蛋白质的最佳分离范围是10-40kD,所以SDS-PAGE分离胶浓度取15%。

按说明书“SDS-PAGE凝胶配制试剂盒”后表格。

依照15%胶，5ml（打勾）一栏。

如图：注意单位，表格中以ml计，操作时用移液枪以ul计，同时注意移液枪量程。

a. 按上图配方制分离胶，迅速摇匀。

b. 安装好电泳仪，组装模具，沿着固定好的大小玻璃板形成的槽边侧分次用移液枪迅速向槽中注入分离胶，注意勿打入气泡，高度至槽高2/3-3/4。

SDS-PAGE电泳原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。

SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。

因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。

这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。

由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。

TEMED：通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。

过硫酸铵（AP）：提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。

SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。

本实验采用垂直板状不连续系统。

所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。

1.蛋白样品浓缩效应在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，pH8.3)、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(Tris—HCl，pH8.8)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。

在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝6.0，pK a=9.7)只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。

SDS-PAGE1、SDS-PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳2、Acr：丙烯酰胺；配胶时用30%Acr（质量比Acr：Bis=29:1）3、Bis：甲叉双丙烯酰胺4、DDW：超轻水5、SDS：十二烷基硫酸/磺酸钠，阴离子去污剂（配胶时用10%）6、APS：过硫酸铵NH4S2O4配胶时用10%7、TEMED：四甲基乙二胺，促凝剂8、Tris-Hcl：3羟基氨基甲烷盐酸缓冲液，配胶时（分离胶ph=8.8，浓缩胶ph=6.8）9、DTT：二硫苏糖醇，DTT也常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。

10、IMA：碘乙酰胺，碘代乙酰胺用于有机合成，在蛋白组学中组氨酸和半胱氨酸的烷基化试剂，用于多肽测序以及酶抑制剂等，蛋白组学级试剂。

CH>2ICONH>2，是和碘乙酸一样，可通过下列反应不可逆地抑制SH酶类的物质。

1)根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶(即下层胶)：注：如果配制非变性胶，参考上述配方，不加10%SDS即可配制成非变性PAGE胶。

1)按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶)：TBST 缓冲液每2L体积中含：1)抗体去除液每50mL抗体去除液中含：SDS-PAGE电泳的基本原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。

当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

sds-page凝胶配方及制胶[最新] SDS-PAGE凝胶配方及制胶12%分离胶体积试剂 5ml 8ml 10ml 15ml 25ml 30ml 60ml 90ml 120ml30%Acr-Bis(ml) 2 3.2 4 6 10 12 24 36 481.5M Tris-HCl 1.25 22.53.75 6.25 7.5 15 22.5 30 PH8.8(ml)ddH2O(ml) 1.65 2.64 3.3 4.95 8.25 9.9 19.8 29.7 39.610%SDS(ul) 50 80 100 150 250 300 600 900 120010%APS(ul) 50 80 100 150 250 300 600 900 1200TEMED(ul) 3 4.8 6 9 15 18 36 54 725%浓缩胶体积试剂 4ml 6ml 8ml 12ml 16ml 20ml 24ml 36ml 48ml30%Acr-Bis(ml) 0.66 0.99 1.32 1.98 2.64 3.3 3.96 5.94 7.921M Tris-HCl 0.5 0.75 1 1.5 2 2.5 3 4.5 6 PH6.8(ml)ddH2O(ml) 2.74 4.14 5.48 8.28 11.02 13.7 16.56 24.84 33.1210%SDS(ul) 40 60 80 120 160 200 240 360 48010%APS(ul) 40 60 80 120 160 200 240 360 480TEMED(ul) 4 6 8 12 16 20 24 36 481、按顺序加溶液，每加完一个溶液摇匀一下。

2、TEMED要在通风橱中加，加入后混匀30秒左右后再注胶;吸打时枪头不出液面，以减少气泡3、分离胶配好后要用水封顶，聚合至少40min(也可聚合一夜)4、加入浓缩胶后插梳子(要洗干净)，梳子倾斜插入，避免产生气泡。

1 SDS-PAGE电泳试剂配制30% Acr/Bis：Acr 29.2 g，Bis 0.8 g，混匀后加蒸馏水，37℃溶解，定容至0.1 L，棕色瓶存于4℃。

1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）：Tris base 18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调pH至8.0，定容至0.1 L，4℃保存。

1M Tris-HCl（pH 6.8）：Tris base 12.11g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8，定容至0.1 L，4℃保存。

10% SDS：电泳级10 g加蒸馏水68℃助溶，浓盐酸调至pH 7.2，定容至0.1 L。

10% APS：1 g过硫酸铵加蒸馏水至10 mL。

电泳缓冲液（pH 8.3）：Tris 3.02 g，Gly 18.8 g，10% SDS 10 mL加蒸馏水溶解，定容至1 L。

电泳上样缓冲液Loading Buffer：1M Tris-HCl（pH 6.8）1 mL， -巯基乙醇1 mL，SDS 0.4 g，甘油2.0 mL，0.1% 溴酚蓝1.0 mL，蒸馏水5.0 mL。

考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R250 0.15 g，甲醇45 mL，冰醋酸10 mL，ddH2O 45 mL。

脱色液：甲醇45 mL，冰醋酸10 mL，蒸馏水45 mL。

15%分离胶配方：蒸馏水2.3 mL，30% Acr/Bis 5.0 mL，1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）2.5 mL，10% SDS 0.1mL，10% 0.1 mL，TEMED 4 uL。

5%浓缩胶配方：蒸馏水3.3 mL，30% Acr/Bis 4.0 mL，1.0 M Tris-HCl（pH 6.8）0.38 mL，10% SDS 0.03 mL，10% AP 0.03 mL，TEMED 3.0 uL。

2 SDS检测原核蛋白的表达（1）组装胶架：玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

一、材料准备1M Tris-HCl, pH8.8、10% SDS、Ammonnium persulfate (过硫酸铵)和1M Tris-HCl, pH6.8室温保存。

30% Acr-Bis (29:1)和TEMED 4℃避光保存。

过硫酸铵配制成10%溶液后，分装成小管-20℃保存，通常半年内有效。

1.10%十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子去污剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。

由于SDS带有大量负电荷，当与蛋白质形成复合物后好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖，即消除了蛋白质分子之间电荷差异。

作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

配制方法：10g SDS，用双蒸水溶解并定容至100ml，室温保存。

2.10%过硫酸铵（Ap）：引发剂。

能产生自由氧基，使丙烯酰胺聚合。

配制方法：0.1 g过硫酸铵溶解于 1ml双蒸水中。

过硫酸铵会缓慢分解，应新鲜配制。

过硫酸铵配制成10%溶液后，应当-20℃保存。

同时应尽量减少室温存放时间，以防失效。

3.N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED）：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固，其碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。

TEMED易挥发，使用后请盖紧瓶盖。

另外凝胶凝聚的速度和温度及光照关系密切，可通过适当调节TEMED的用量，控制在不同的室内环境下凝胶凝聚的速度。

配制方法：原液使用。

应使用电泳级TEMED。

4.30%丙烯酰胺凝胶贮液（Arc-Bis贮液） :含有29的丙烯酰胺和1的甲叉基聚丙烯酰胺。

丙烯酰胺单体（Arc）在交联剂作用下形成聚丙烯酰胺。

N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis），交联剂。

丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关。

SDS-PAGE凝胶制备试剂盒使用说明书产品货号：SK6010储存条件：Acr-Bis溶液2-8℃储存，其它常温储存。

有效期2年。

产品组成：Components SK6010-50SK6010-250保存条件30%Acr-Bis(29:1)100ml500ml2-8℃分离胶缓冲液100ml500ml RT浓缩胶缓冲液50ml250ml RTAPS（过硫酸铵）5×0.1g5×0.5g RT TEMED1ml5ml RT/避光说明书1份注意：过硫酸铵（APS）为固体粉末，使用前配制成10%APS溶液（0.1g APS加1ml双蒸水；0.5g APS 加5ml双蒸水）。

APS溶液最好现配现用，通常4℃可保存两周，-20℃能保存半年。

产品简介：本产品包括SDS-PAGE凝胶制备所需全部试剂，只需自备蒸馏水，即可制备各种浓度的变性及非变性PAGE凝胶，方便、快捷、安全、实惠。

本试剂盒在分离胶缓冲液和浓缩胶缓冲液中已加入10%SDS，使用时无需另外加入，分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液放置2-8℃可能出现絮状，为SDS析出，常温下放置一会溶液恢复澄清，可继续使用。

因为制备凝胶浓度不同，本品只给出大概制胶数量。

操作步骤：根据目的蛋白分子量大小选择合适的PAGE分离胶配制浓度，最佳胶浓度请参考附表1。

一、灌制分离胶（各试剂使用量请参考附表3）1．参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。

注：加入上层筛板有助于加样时保持填料与样品均匀接触，是否加入上层筛板可根据实际情况选择。

2．将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。

3．加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。

4．在凝胶模具中灌入适量分离胶溶液（对于mini-gel，凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳齿约0.5cm即可，然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层1-5cm的水层，使凝胶表面保持平整。

wb分离胶比例
在进行WB实验时，分离胶的选择需要根据目的蛋白的分子量大小来决定。

常用的分离胶浓度有6%、8%、10%、12%，分子量越大，所用的胶浓度越低，蛋白电泳速度越快。

例如，测定100kDa分子量以上的蛋白可选择8%浓度的分离胶；测定20kDa分子量以下的蛋白可选择15%浓度的分离胶，中间的分子量可选用12%浓度的分离胶。

在Western Blot（WB）实验中，SDS-PAGE分离胶通常根据分子量范围的需求来选择不同的浓度。

以下是配制不同浓度SDS-PAGE分离胶的一般比例示例：
以6%的SDS-PAGE分离胶为例（基于提供的信息片段）：
- 凝胶体积为5毫升时：
- 蒸馏水：2.6毫升
- 30%Acr-Bis（丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的混合液，一般比例是29:1）：1毫升
- 4×Tris-HCl-SDS分离胶缓冲液（pH 8.8）：2.4毫升
- 10%过硫酸铵（APS）：适量（催化聚合反应，用量通常是总量的0.1%）
- TEMED（四甲基乙二胺）：几滴（加速凝胶聚合）
若要配制其他浓度如10%或12%的SDS-PAGE分离胶，则需要相应调整30%Acr-Bis母液的使用量，同时保持蒸馏水和缓冲液的比例随着总胶液体积的变化而变化。

对于更精确的配比，请参照具体的实验手册或者试剂盒说明书，因为实际配方可能会因厂家和实验要求的不同而有所差异。

SDS-PAGE电泳原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。

SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。

因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。

这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。

由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。

TEMED：通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。

过硫酸铵（AP）：提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。

SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。

本实验采用垂直板状不连续系统。

所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。

1.蛋白样品浓缩效应在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，、分离胶缓冲液(Tris—HCl，，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。

在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝，pK a=只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。

（1）10%AP（W/V）：:过硫酸铵（AP，引发剂）0.1g，加蒸馏水至1.0mL，最好临时配制。

（2）电泳样品缓冲液：SDS 0.4g，巯基乙醇 1.0ml，甘油 2.0ml，0.5mol/L Tris-HCl (pH6.8) 2.0 ml，0.1%（W/V）溴酚蓝 0.5ml，ddH2O 2.5ml。

（3）30.8%凝胶贮存液：称Acr 30g及Bis 0.8g，溶于蒸馏水中，最后定容至100ml，过滤后置于棕色试剂瓶中，4°C贮存。

(4) 凝胶缓冲液分离胶缓冲液：1.5mol/L pH 8.8 Tris-HCl。

称取18.15gTris，用60ml重蒸水溶解，再用1mol/L的HCl调节至pH8.8，定容至100ml，4°C保存。

浓缩胶缓冲液：0.5mol/L pH6.8 Tris-HCl。

称取6g Tris，用60ml重蒸水溶解，再用1mol/L的HCl调节至pH6.8, 定容至100ml，4°C保存。

（5）10%SDS：将10g SDS溶于80ml蒸馏水中并轻缓搅拌（室温低时需水浴加入溶解）。

（6）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/L Tris-0.384mol/L 甘氨酸缓冲液，pH8.3）：称Tris 3.03g，甘氨酸14.41g，SDS 1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。

(7) 固定液：取50%甲醇455ml。

冰乙酸45ml混匀。

（8）染色液：称考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250ml，过滤后使用。

（9）脱色液：冰乙酸10ml，甲醇75ml，蒸馏水75ml。

（10）95%乙醇。

(11)配胶贮备胶(12.5%) 分离胶 (10%) 浓缩胶(4%)ddH2O 3.4ml 4.2ml 3.1mlBuffer 2.5ml 2.5ml 1.25mlAcr+Bis（30.8%）4ml 3.2ml 0.7ml10%SDS 100ul 100ul 50ulTEMED 6ul 6ul 4ulAP 100ul 100ul 50ul(12)western两种转膜液配方。

（1）Acr-Bis液（丙烯酰胺溶液）500 mL：于800 mL洁净的烧杯中，依次称取双丙烯酰胺4 g，丙烯酰胺146 g，缓慢倒入双蒸水约350 mL，以玻璃棒缓慢搅拌促进溶解。

注意，双丙烯酰胺粉末易漂浮在空气中，所以要称重时注意周围空气流速，称取丙烯酰胺时可以将烧杯中的双丙烯酰胺掩盖。

玻璃棒搅动幅度不要太大以免溶液底部的双丙烯酰胺浮起并扩散到空气中。

完全溶解的溶液应清澈无色透明。

待溶解完全后补加双蒸水至500 mL，倒入无色玻璃试剂瓶中，4℃冰箱可保存10个月。

（2）4×分离胶缓冲液，500 mL：于500 mL洁净的量筒中，依次加入375 mL 2 M Tris-HCl (实测pH 8.9±0.1，25℃)，100 g/L SDS 溶液（冰箱取出后可微波加热促进储存液的溶化）20 mL，最后加入适量双蒸水至500 mL。

倒入无色玻璃试剂瓶中，4℃冰箱最少可保存12个月。

有时冰箱温度过低会使储存液混浊，微波略微加热使其澄清后即可使用。

（3）100 g/L 过硫酸铵溶液(ammonium persulfate, AP)20 mL：2g过硫酸铵加20 mL 双蒸水，倒入无色塑料试剂瓶中，4℃冰箱最少可保存10个月。

注意配胶时不要交叉污染TEMED，可以以5 mL分装到4个无色塑料试剂瓶中分别保存。

（4）TEMED 成品液：购买后分装成2或5 mL小管装使用可避免母液受到污染。

（5）5×样品缓冲液，100 mL：依次加入50 mL 75%（v/v）甘油，20 mL 100 g/L SDS 溶液，10 mL 10 g/L 溴酚蓝溶液，5 mL 2 M Tris-HCl (实测pH8.9±0.1，25℃)，5 mL巯基乙醇，9 mL 双蒸水。

混合母液倒入无色玻璃试剂瓶中，4℃冰箱至少可保存12个月。

可分装成10 mL 使用，不会使母液受到蛋白污染。

（6）10×电泳缓冲液，1000 mL：称取10 g SDS，30 g Tris base，144g 甘氨酸（事先要明确甘氨酸溶液的颜色，选用溶解后澄清无色的产品）于1000 mL的烧杯中，加水约700 mL 溶解，可微波炉加热（< 80℃）以促进溶解，注意不要使其沸腾，加热至烧杯烫手即可，间歇用玻璃棒搅拌。

超氧化物歧化酶（SOD）活性测定-----氮蓝四唑（NBT）法依据测定的蛋白含量计算出不同品种葡萄所需的酶液量（mL），并按照表2顺序加入试剂，注意核黄素要最后加入，共做6管。

表2 NBT法测定SOD酶活性50mM pH 7.8磷酸缓冲液（mL）130mM甲硫氨酸溶液（mL）750μM氮蓝四唑溶液（mL）100μMEDTA-Na2（mL）蒸馏水（mL）酶粗提液（mL）20μM核黄素溶液（mL）1 3.2 0.6 0.6 0.6 0.4 0 0.62 3.2 0.6 0.6 0.6 0.4 0 0.63 3.18 0.6 0.6 0.6 0.4 0.02 0.64 3.18 0.6 0.6 0.6 0.4 0.02 0.65 3.18 0.6 0.6 0.6 0.4 0.02 0.66 3.18 0.6 0.6 0.6 0.4 0.02 0.6注：1号为不光照对照管，2号为光照对照管各溶液显色反应用量混合后，将1号管置于黑暗处，其余各管置于光照处，反应约10 min（温度低时，反应时间延长；光照强时，缩短反应时间）。

反应结束后，全部移入暗处，以不光照对照管作为空白对照，在560nm处测定吸光度，记录数据。

以每变化0.1个吸光度为一个酶活单位SOD酶活计算公式：SOD（U/Pr.mg)=(Ack-Ae)/(Ack*0.1*C)式中：C-蛋白含量（mg）Ack-用缓冲液代替酶液的照光对照管吸光度Ae-样品管吸光度试剂配制方法：（1）0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。

91.5ml0.05MNa2HPO4（1.638582g）+8.5ml0.05M NaH2PO4(0.06630425g)（2）130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100ml。

（3）750µmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。

SDS-PAGE30%聚丙烯酰胺溶液-----30%（w/v）Acrylamide将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。

0.45µm微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存。

严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。

使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。

如有沉淀，可以过滤。

【保存条件】4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存【注意事项】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。

称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。

可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。

1MTris-HCL（pH6.8）(浓缩胶buffer)称量121.1gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加>0.7mL的浓HCL调节所需要的pH 值（7.4-大约0.7mL，7.6-大约0.6mL，8.0-大约0.42mL），将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。

应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

【保存条件】室温保存。

【注意事项】对人体有刺激性，请注意适当防护。

1.5MTris-HCL（pH8.8）(分离胶buffer)称量181.7gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加浓HCL调节所需要的pH值=8.8，将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。

（1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL 混合，加水稀释到100ml终体积。

过滤后40C保存。

）【保存条件】室温保存【注意事项】应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

北京雷根生物技术有限公司
Acr-Bis(30%，37.5:1)
简介：
丙烯酰胺:亚甲基双丙烯酰胺溶液又称Acr-Bis ，最常用的是30%Acr-Bis(29:1)即为含30% Acrylamide-Bisacrylamide 的水溶液，其中Acrylamide 和Bisacrylamide 的比例为29:1，丙烯酰胺的总比例为30%。

Leagene Acr-Bis(30%,37.5:1)中Acrylamide 和Bisacrylamide 的比例为,丙烯酰胺总量为，常用于配制丙烯酰胺凝胶(PAGE 胶)，如SDS-PAGE 胶等，可以用于蛋白或核酸的分离。

组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、因具体实验而异，可以参考SDS-PAGE 凝胶配制的说明。

注意事项：
1、 Acr-Bis(30%,37.5:1)对人体有一定神经毒性，请注意适当防护。

2、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期：12个月有效。

相关：
编号 名称 PE0122 Storage Acr-Bis(30%,37.5:1) 500ml 4℃ 避光 使用说明书
1份 编号 名称
DH0006 苏木素伊红(HE)染色液
NR0001 DEPC 处理水(0.1%)
PE0025 SDS-PAGE 蛋白加样缓冲液(5×)
PE0080 Tris-HCl 缓冲液(1mol/L,pH6.8)
PE0103 Acr-Bis(30%,29:1)
PT0001 BCA 蛋白定量试剂盒
PW0111 Super ECL Plus 超敏发光液
TC0713 葡萄糖检测试剂盒(GOD-POD 比色法)。

SDSPAGE电泳本理：之阳早格格创做散丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 战接联剂N，N’—亚甲基单丙烯酰胺（简称Bis）正在催化剂效率下，散合接联而成的具备网状坐体结构的凝胶，并以此为收援物举止电泳.散丙烯酰胺凝胶电泳可根据分歧蛋黑量分子所戴电荷的好别及分子大小的分歧所爆收的分歧迁移率将蛋黑量分散成若搞条区戴，如果分散杂化的样品中只含有共一种蛋黑量，蛋黑量样品电泳后，便应只分散出一条区戴.SDS是一种阳离子表面活性剂能挨断蛋黑量的氢键战疏火键，并按一定的比率战蛋黑量分子分散成复合物，使蛋黑量戴背电荷的量近近超出其自己本有的电荷，掩盖了百般蛋黑分子间天然的电荷好别.果此，百般蛋黑量SDS 复合物正在电泳时的迁移率，没有再受本有电荷战分子形状的效率，而不过棒少的函数.那种电泳要领称为SDS散丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）.由于SDSPAGE 可设法将电泳时蛋黑量电荷好别那一果素与消大概减小到不妨略而没有计的程度，果此常常使用去审定蛋黑量分散样品的杂化程度，如果被审定的蛋黑量样品很杂，只含有一种具三级结构的蛋黑量大概含有相共分子量亚基的具四级结构的蛋黑量，那么SDS—PAGE 后，便只出现一条蛋黑量区戴. TEMED：通过催化过硫酸铵产死自由基而加速丙烯酰胺与单丙烯酰胺的散合.过硫酸铵（AP）：提供启动丙烯酰胺与单丙烯酰胺所必须的自由基.SDS—PAGE 可分为圆盘状战笔曲板状、连绝系统战没有连绝系统.本真验采与笔曲板状没有连绝系统.所谓“没有连绝”是指电泳体系由二种大概二种以上的缓冲液、pH 战凝胶孔径等所组成.正在没有连绝电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，pH8.3)、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，pH6.8)、分散胶缓冲液(Tris—HCl，pH8.8)，二种凝胶的浓度(即孔径)也没有相共.正在那种条件下，缓冲系统中的HCl 险些局部解离成Cl－，二槽中的Gly (pI＝6.0，pK a=9.7)惟有很少部领会离成Gly 的背离子，而酸性蛋黑量也可解离出背离子.那些离子正在电泳时皆背正极移动.C1—速度最快(开始离子)，其次为蛋黑量，Gly 背离子最缓(尾随离子).由于C1—很快超出蛋黑离子，果此正在其后里产死一个电导较矮、电位梯度较陡的地区，该区电位梯度最下，那是正在电泳历程中产死的电位梯度的没有连绝性，引导蛋黑量战Gly 离子加快移动，截止使蛋黑量正在加进分散胶之前，快、缓离子之间浓缩成一薄层，有好处普及电泳的辨别率.蛋黑量离子加进分散胶后，条件有很大变更.由于其pH 降下(电泳举止常常超出9.0)，使Gly 解离成背离子的效力减少；共时果凝胶的浓度降下，蛋黑量的泳动受到效率，迁移率慢遽下落.此二项变更，使Gly 的移动超出蛋黑量，上述的下电压梯度没有复存留，蛋黑量便正在一个较均一的pH 战电压梯度环境中，按其分子的大小移动.分散胶的孔径有一定的大小，对于分歧相对于分子品量的蛋黑量去道，通过时受到的阻滞程度分歧，纵然洁电荷相等的颗粒，也会由于那种分子筛的效力，把分歧大小的蛋黑量相互分启.SDSPAGE电泳胶配造：SDSPAGE试剂配造：。

SDS-PAGE1、SDS-PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳2、Acr：丙烯酰胺；配胶时用30%Acr（质量比Acr：Bis=29:1）3、Bis：甲叉双丙烯酰胺4、DDW：超轻水5、SDS：十二烷基硫酸/磺酸钠，阴离子去污剂（配胶时用10%）6、APS：过硫酸铵NH4S2O4配胶时用10%7、TEMED：四甲基乙二胺，促凝剂8、Tris-Hcl：3羟基氨基甲烷盐酸缓冲液，配胶时（分离胶ph=8.8，浓缩胶ph=6.8）9、DTT：二硫苏糖醇，DTT也常常被用于蛋白质中二硫键的还原，可用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。

10、IMA：碘乙酰胺，碘代乙酰胺用于有机合成，在蛋白组学中组氨酸和半胱氨酸的烷基化试剂，用于多肽测序以及酶抑制剂等，蛋白组学级试剂。

CH>2ICONH>2，是和碘乙酸一样，可通过下列反应不可逆地抑制SH酶类的物质。

1)根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶(即下层胶)：注：如果配制非变性胶，参考上述配方，不加10%SDS即可配制成非变性PAGE胶。

1)按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶)：TBST 缓冲液每2L体积中含：1)抗体去除液每50mL抗体去除液中含：SDS-PAGE电泳的基本原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。

当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。

SDS-PAGE电泳原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。

聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。

SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。

因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。

这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。

由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。

TEMED：通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。

过硫酸铵（AP）：提供驱动丙烯酰胺与双丙烯酰胺所必须的自由基。

SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。

本实验采用垂直板状不连续系统。

所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。

1.蛋白样品浓缩效应在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，、分离胶缓冲液(Tris—HCl，，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。

在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝，pK a=只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。