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16S rRNA序列分析法在大气微生物检测中的应用周 煜 陈梅玲 姜 黎 孟令英 翟俊辉(北京微生物流行病研究所 北京 100071)摘要 随着微生物核糖体数据库的日益完善,16S rR NA序列分析技术已应用于海洋、湖泊和土壤等环境微生物多样性的分析,但尚未见其在大气微生物菌群分析中的应用报道。
本研究选择5株大气中采集分离的菌株,通过细菌16S rR NA通用引物PCR扩增其对应序列,直接对PCR产物进行测序,分析鉴定其对应细菌的种属,并将该结果同细菌表型鉴定、全自动微生物分析仪以及气相色谱分析结果加以比较。
结果表明16S rR NA序列分析获得的鉴定结果与表型分析和气相色谱分析结果较为一致,该方法具有快速、准确和不依赖于细菌生长状态等优点,说明16S rRNA序列分析法可以作为大气微生物分析的一个有效技术。
关键词 16S rRNA;序列分析;大气微生物Application of16S rRNA sequence analysis for the study of atmospheric bacteriaZhou Yu,Chen Meiling,Jiang Li,Meng Lingying,Zhai Junhui(Beijing Ins titute o f M icrobiolo gy and Epidemiology,Beijing100071)A bstract The rapid increasing data of microbial small subunit rR NA sequences make it possible to use16SrR NA sequence analysis for study the diversity of microbial populations in the natural envir onment suc h as ma-rine,lake and soil.Ho wever,there is no report of using it to study bacteria in the atmosphere as far as I know.The genome DNA of5strains bacteria sampled and isolated fr om atmosphere are amplified using the primers targeted to16S rRNA sequence.Sequences of the PCR products without cloning are analyzed to identi-fy the identity of the correspondent strains.The results are compared with those from morphological characteris-tics and gas chromotography analysis.It reveals that the three methods give essentially the same results.The 16S rRNA method provides the advantages of accurac y,simplicity and independence of the gro wth status of the bacteria.It may be a po werful alternative analysis method for the study of atmospheric bacteria.Key words 16S rRNA;sequence analysis;atmospheric microbe 大气微生物群与自然生态平衡及许多生命现象直接相关,其广泛分布可导致人、动物和植物疾病的发生和传播,给某些工业生产造成危害,因此大气微生物菌群的采样分析十分重要。
微生物 16s16s是一种常用的微生物遗传物质，它是16S rRNA基因的一部分。
16S rRNA基因在细菌和古细菌中广泛存在，具有高度保守性和变异性，因此被广泛应用于微生物分类和物种鉴定。
微生物是一类生活在地球上几乎所有环境中的微小生物。
它们包括细菌、古细菌、真菌、病毒等。
微生物在地球上具有重要的生态和生物化学功能，对地球的生态系统起着重要的调节作用。
16S rRNA基因是微生物中16S rRNA分子所编码的基因，它是细菌和古细菌中的一个高度保守的基因。
由于其具有高度保守性和变异性，16S rRNA基因序列可以用于微生物的分类和鉴定。
通过对16S rRNA基因的测序和分析，可以获取微生物的16S rRNA序列信息，进而进行微生物的分类和鉴定。
基于16S rRNA 序列的相似性，可以将微生物分为不同的菌属、菌种和类群。
同时，通过对不同微生物样品的16S rRNA序列进行比较分析，可以了解微生物群落的组成和结构。
16S rRNA基因测序技术的发展，使得微生物的分类和鉴定更加快捷和准确。
传统的微生物分类方法需要进行菌落特征观察和生理生化实验，耗时耗力且准确度有限。
而基于16S rRNA的测序技术可以直接获取微生物的遗传信息，不仅可以准确地鉴定微生物，还可以了解微生物的功能和代谢途径。
通过16S rRNA基因测序技术，可以对微生物进行系统发育分析，揭示微生物的亲缘关系和进化历史。
通过构建16S rRNA基因序列的系统发育树，可以比较不同微生物之间的进化距离和进化关系。
除了微生物分类和鉴定，16S rRNA基因测序还可以用于微生物群落的研究。
微生物群落是指在特定环境中共同生活的微生物的总体。
通过对不同环境样品的16S rRNA基因测序，可以了解微生物群落的组成和结构，揭示微生物在生态系统中的功能和相互作用。
16S rRNA基因测序技术的应用已经渗透到了多个领域。
在医学领域中，通过对人体微生物群落的研究，可以了解微生物与人类健康之间的关系，为疾病的预防和治疗提供新的思路。
16s rdna测序原理16s rDNA测序是一种用于研究微生物群落结构和功能的重要技术，它可以帮助科研人员了解微生物的多样性和相互关系，对环境微生物的研究具有重要意义。
本文将介绍16s rDNA测序的原理及其在微生物学研究中的应用。
16s rDNA是细菌和古细菌的小亚基RNA基因的一部分，它在所有细菌和古细菌中都存在，并且在细菌的进化过程中具有高度的保守性。
因此，通过对16s rDNA序列进行测序和比对，可以帮助科研人员了解不同微生物的分类和演化关系。
在进行16s rDNA测序时，首先需要从样品中提取微生物的DNA，然后通过PCR扩增得到16s rDNA的片段。
接下来，对PCR产物进行纯化和测序准备，最常用的方法是通过测序仪进行Sanger测序。
随着高通量测序技术的发展，现在也可以使用Illumina、454或Ion Torrent等平台进行高通量测序，大大提高了测序的效率和速度。
得到16s rDNA序列后，接下来的工作就是对序列进行比对和分析。
科研人员可以利用公开数据库中的16s rDNA序列作为参考，通过比对来确定待测序列的分类地位和系统发育关系。
此外，还可以利用一些生物信息学工具对序列进行多样性分析、物种丰度分析等，从而了解微生物群落的结构和功能。
在微生物学研究中，16s rDNA测序被广泛应用于环境微生物群落的研究。
通过对土壤、水体、空气等不同环境中微生物的16s rDNA进行测序和分析，可以揭示微生物的多样性、分布规律以及其对环境的影响。
此外，16s rDNA测序还可以用于研究人体内的微生物群落，例如肠道菌群的研究，有助于了解微生物与宿主健康的关系。
总之，16s rDNA测序是一种重要的技术手段，它为科研人员提供了解微生物多样性、分类和系统发育关系的重要途径，对微生物学、生态学和生物医学研究具有重要意义。
随着测序技术的不断发展和完善，相信16s rDNA测序在微生物学研究中的应用将会更加广泛和深入。
16srrna基因技术在油藏微生物生态研究中的应用
16S rRNA基因技术是一种用于微生物分类和地球环境微生物
群落结构研究的重要方法。
在油藏微生物生态研究中，16S rRNA基因技术被广泛应用于发现、鉴定和研究油藏中的微生
物群落。
首先，通过对油藏中微生物群落的16S rRNA基因进行测序和
分析，可以获得不同微生物群落的组成和多样性信息。
这有助于了解油藏中微生物的种类、数量和相对丰度等关键生态信息，从而揭示微生物群落的结构和功能。
其次，16S rRNA基因技术可以用于鉴定油藏中的微生物。
通
过比对16S rRNA基因序列数据库，可以确定微生物的分类和
系统发育位置，从而识别油藏中存在的不同微生物种类。
此外，16S rRNA基因技术还可以帮助研究油藏中微生物的代
谢功能和生态作用。
通过分析16S rRNA基因的功能区域，可
以推断微生物的功能特性，如产酸、产气、产聚合物降解酶等，从而揭示微生物对油藏生态系统中有机物转化、油藏酸化和生物降解等方面的影响。
综上所述，16S rRNA基因技术在油藏微生物生态研究中起着
重要作用。
它可以提供关于微生物群落结构、种类、数量和功能等方面的重要信息，有助于深入理解油藏微生物的生态特性和作用机制，为油藏开发和油藏环境管理提供科学依据。
16SrDNA序列在微生物的分类鉴定上的应用摘要随着生物技术的迅速发展，16SrDNA分析技术在微生物分类鉴定及分子检测中得到广泛应用。
根据16SrDNA的保守域和高变域，可以进行种属的鉴定。
16SrDNA分析技术克服了传统生物培养法的限制，操作方便，检测快，准确度高且灵敏度高，已被广泛应用到菌种鉴定、群落对比分析、群落中系统发育及种群多样性的评估，是一种客观且可信度高的分类方法。
关键词16SrDNA 微生物分类鉴定传统的微生物分类是根据菌落的形态特征和生理生化特性，对菌种进行纯培养分离，然后从形态学、生理生化反应特征及免疫学特性加以鉴定。
但近几十年来，传统微生物分类鉴定得到了巨大的革新，许多新技术和方法在微生物分类中得到广泛应用，使微生物分类鉴定从一般表型特征的鉴定，深化到遗传特性的鉴定。
1.微生物形态比较分类法的局限性1.1 不能正确反映微生物形态由于微生物菌群在进行纯培养时，不可避免地会造成菌株的富集或衰减，人为地改变了原始菌群的微生物生态构成，对研究结果造成了较大的偏差①。
这样在应用上就只能局限于对简单环境下的微生物的研究，而对复杂环境下的微生物不能加以有效分析，严重影响了微生物基因组的研究。
1.2微生物资源大量丢失许多研究研究表明，在自然环境中有相当多的菌种（约90%～99%）用纯培养方法无法培养出来。
同时，纯培养分离方法采用配制简单的营养基质和固定的培养温度，忽略了气候变化和生物相互作用的影响，这种人工环境与原生境的偏差使得可培养的种类大大减少，仅占环境微生物总数的0.1%～1%②。
因此，由于绝大多数微生物无法培养得到，丢失了大量微生物资源，对微生物多样性的认识较片面。
1.3不能保证分类的准确性和科学性对形态特征、理化特征、菌体某些化学成分等特征完全相同时，可较准确的分类，但是对某特性中有某些差异的，往往难以判断。
而且，方法繁琐耗时。
2. 16SrDNA及其鉴定依据2.1 16SrDNA简介16SrDNA是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16SrRNA)的基因,长度约1500bp,是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”, 其序列包含10 个可变区( variable region ) 和与之相间的11 个恒定区( constantregion) ,可变区因细菌而异,且变异程度与细菌的系统发育密切相关。
16s rDNA序列是细菌和古细菌特有的一种特征序列，是通过测定16s rDNA基因所编码的16s rRNA的序列而得到的。
在分子生物学和微生物学领域，16s rDNA序列被广泛应用于微生物分类、微生物多样性研究和微生物系统进化研究中。
本文将从以下几个方面对16s rDNA 序列进行介绍和分析。
一、成因和结构16s rDNA序列是细菌和古细菌特有的一种特征序列，它是细菌和古细菌核糖体小亚基rRNA基因的一部分，通常有约1500个核苷酸碱基对，可由16s rRNA基因编码。
这一序列在细菌和古细菌的核糖体RNA中起着重要的作用，它能够稳定地与核糖体蛋白结合，形成核糖体的小亚基，并参与到细菌和古细菌的蛋白质合成过程中。
二、意义和应用1. 微生物分类16s rDNA序列在微生物分类中具有重要意义，通过对16s rDNA序列进行测序分析可以鉴定和分类细菌和古细菌的种属和亚属。
这是因为16s rDNA序列在不同种属和不同亚属的细菌和古细菌之间存在一定的变异，可以作为分子生物学特征用于分类鉴定。
2. 微生物多样性研究通过对环境样品中的16s rDNA序列进行测序分析，可以了解微生物裙落的组成和结构，揭示微生物在自然界的分布和多样性。
这对于研究微生物的生态学、环境适应性和生态功能具有重要意义。
3. 微生物系统进化研究利用16s rDNA序列进行系统进化研究，可以揭示细菌和古细菌的系统发育关系和演化过程，为了解细菌和古细菌的起源、多样性和进化提供重要的分子学证据。
三、研究方法1. PCR扩增通常情况下，从细菌或古细菌的DNA中提取16s rDNA序列，然后利用PCR技术进行扩增。
通过选择适当的引物和反应条件，可以特异性地扩增出16s rDNA序列，为后续的测序分析做准备。
2. 测序分析测序是获取16s rDNA序列信息的关键步骤，目前常用的测序方法包括Sanger测序和高通量测序。
通过测序分析，可以获得16s rDNA 序列的具体碱基序列信息，用于后续的分类鉴定和系统进化研究。
16s rdna序列16s rrna基因序列-回复16s rDNA序列，也称为16s rRNA基因序列，是细菌和古细菌中高度保守的基因序列，广泛应用于系统发育学、微生物多样性研究和环境监测等领域。
本文将一步一步回答有关16s rDNA序列的问题，从基础知识到应用领域进行讨论。
第一部分：16s rDNA序列的概述首先，我们需要了解什么是rDNA和rRNA。
rDNA是指能够编码特定类型的RNA的DNA区域，例如编码rRNA的基因。
rRNA则是核糖体的主要组成部分，负责蛋白质合成过程中的RNA酶活性和结构支持。
16s rDNA序列指的是编码16s rRNA的基因序列。
16s rRNA是细菌和古细菌中的一种rRNA，其具有高度保守性，不同物种之间的差异主要在其中嵌入的可变区域。
这种高度保守性使得16s rDNA序列成为一种常用的分子标记，用于研究生物分类和演化关系。
第二部分：16s rDNA序列的研究方法了解16s rDNA序列的研究方法对于理解其应用具有重要意义。
常用的16s rDNA序列的研究方法包括PCR扩增、测序和分析。
PCR扩增是首先要进行的步骤，它使用特定的引物将16s rDNA序列从样本中扩增出来，使其成为测序的载体。
随后，扩增的片段将被测序，通常采用Sanger测序或高通量测序技术。
得到16s rDNA序列数据后，接下来需要进行序列分析。
常见的分析方法包括序列校正、比对和构建系统发育树。
比对可以将不同物种的16s rDNA 序列进行对比，找出其中的变异位点，进一步分析不同物种间的差异和相似性。
构建系统发育树则可以帮助我们了解不同物种的进化关系。
第三部分：16s rDNA序列在系统发育学中的应用16s rDNA序列在系统发育学中起着重要的作用。
通过比对和构建系统发育树，我们可以了解不同物种之间的进化关系，并揭示它们的分类位置。
在物种鉴定中，16s rDNA序列可以用于确定未知物种的分类位置。
利用16S rRNA基因序列分析进行微生物分类鉴定【实验目的】1. 了解微生物分子鉴定的原理和应用。
2. 掌握利用16S rRNA基因进行微生物分子鉴定的操作方法。
3. 运用软件构建系统发育树并对微生物进行系统发育关系分析。
【实验原理】长期以来，对微生物的分类鉴定主要采用分离培养、形态特征、生化反应和免疫学等方法。
但这些传统手段均存在耗时长、特异性差、敏感度低等问题，难以满足现代细菌学研究的发展要求。
随着分子生物学技术的迅速发展，特别是聚合酶链式反应( PCR) 技术的出现及核酸研究技术的不断完善，产生了许多新的分类方法，如质粒图谱、限制性片段长度多态性分析、PCR 指纹图、rRNA 基因（即rDNA）指纹图、16S 核糖体核糖核酸（ribosomal RNA，rRNA）序列分析等。
这些技术主要是对细菌染色体或染色体外的DNA 片段进行分析，从遗传进化的角度和分子水平进行细菌分类鉴定，从而使细菌分类更科学、更精确。
其中原核生物16S rRNA 基因（真核18S rRNA 基因）序列分析技术已被广泛应用于微生物分类鉴定。
核糖体rRNA对所有生物的生存都是必不可少的。
其中16 S rRNA在细菌及其他微生物的进化过程中高度保守，被称为细菌的“分子化石”。
在16S rRNA分子中含有高度保守的序列区域和高度变化的序列区域，因此很适于对进化距离不同的各种生物亲缘关系的比较研究。
其具体方法如下：首先借鉴恒定区的序列设计引物，将16S rRNA基因片段扩增出来，测序获得16S rRNA基因序列，再与生物信息数据库（如GenBank）中的16S rRNA 基因序列进行比对和同源性分析比较，利用可变区序列的差异构建系统发育树，分析该微生物与其他微生物之间在分子进化过程中的系统发育关系（亲缘关系），从而达到对该微生物分类鉴定的目的。
通常认为，16S rRNA基因序列同源性小于97 %，可以认为属于不同的种，同源性小于93~95 %，可以认为属于不同的属。
16SrDNA序列在微生物的分类鉴定上的应用
摘要
随着生物技术的迅速发展，16SrDNA分析技术在微生物分类鉴定及分子检测中得到广泛应用。
根据16SrDNA的保守域和高变域，可以进行种属的鉴定。
16SrDNA分析技术克服了传统生物培养法的限制，操作方便，检测快，准确度高且灵敏度高，已被广泛应用到菌种鉴定、群落对比分析、群落中系统发育及种群多样性的评估，是一种客观且可信度高的分类方法。
关键词
16SrDNA 微生物分类鉴定
传统的微生物分类是根据菌落的形态特征和生理生化特性，对菌种进行纯培养分离，然后从形态学、生理生化反应特征及免疫学特性加以鉴定。
但近几十年来，传统微生物分类鉴定得到了巨大的革新，许多新技术和方法在微生物分类中得到广泛应用，使微生物分类鉴定从一般表型特征的鉴定，深化到遗传特性的鉴定。
1.微生物形态比较分类法的局限性
1.1 不能正确反映微生物形态
由于微生物菌群在进行纯培养时，不可避免地会造成菌株的富集或衰减，人为地改变了原始菌群的微生物生态构成，对研究结果造成了较大的偏差①。
这样在应用上就只能局限于对简单环境下的微生物的研究，而对复杂环境下的微生物不能加以有效分析，严重影响了微生物基因组的研究。
1.2微生物资源大量丢失
许多研究研究表明，在自然环境中有相当多的菌种（约90%～99%）用纯培养方法无法培养出来。
同时，纯培养分离方法采用配制简单的营养基质和固定的培养温度，忽略了气候变化和生物相互作用的影响，这种人工环境与原生境的偏差使得可培养的种类大大减少，仅占环境微生物总数的0.1%～1%②。
因此，由于绝大多数微生物无法培养得到，丢失了大量微生物资源，对微生物多样性的认识较片面。
1.3不能保证分类的准确性和科学性
对形态特征、理化特征、菌体某些化学成分等特征完全相同时，可较准确的分类，但是对某特性中有某些差异的，往往难以判断。
而且，方法繁琐耗时。
2. 16SrDNA及其鉴定依据
2.1 16SrDNA简介
16SrDNA是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16SrRNA)的基因,长度约1500bp,是细菌分类学研究中最常用、最有用的“分子钟”, 其序列包含10 个可变区( variable region ) 和与之相间的11 个恒定区( constantregion) ,可变区因细菌而异,且变异程度与细菌的系统发育密切相关。
Woese等③与Olsen等④基于16SrDNA的分析构建了现已被公认的全生命系统进化树。
越来越多的细菌依据16SrDNA 被正确分类或重分类,尤其是许多环境中的细菌⑤、⑥ ,如Funke等将棒杆菌依赖细胞毒性1组及类似棒杆菌重新确定为放线菌的一个新种,即钮氏放线菌种, Bennasar等通过比较14株施氏假单胞菌的7个基因型(DNA2DNA杂交同源
组) ,发现SP1402T( T为模式株)和SL401与施氏假单胞菌模式株明显不同,从而命名为一个新种称巴利阿里假单胞菌( Pseudomonasbalearica) ②。
2.2鉴定依据
原核生物的rRNA含有3种类型:23S、16S和5SrRNA，它们分别含有的2,900,1,540和120个核苷酸。
5SrRNA虽易分析，但核昔酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究，而23SrRNA含有的核苷酸几乎是16SrRNA的两倍，分析较困难。
经过大量的研究证明16SrDNA的全长约为1,540bp，片段长度适中，信息量较大且易于分析⑦。
在相当长的进化过程中，rRNA分子的功能几乎保持恒定，而且其分子排列顺序有些部位变化非常缓慢，以致保留了古老祖先的一些序列，所以从这种排列顺序可以检测出种系发生上的深远关系。
rRNA结构既具有保守性，又具有高变性。
保守性能够反映生物物种的亲缘关系，为系统发育重建提供线索:高变性则能揭示出生物物种的特征核酸序列，是种属鉴定的分子基础。
16SrRNA为核糖体RNA的一个亚基，而16SrDNA是编码该亚基的基因。
在细菌的16SrDNA中有多个区段高度保守，根据这些保守区人们可以设计出细菌的通用引物，可以用来扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16SrDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。
因此，16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子⑧。
随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16SrDNA序列被测定并收入国际基因数据库中，这样用16SrDNA作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。
2.3 16SrRNA/rDNA序列分析
在分类鉴定一些特殊环境下的微生物时，由于分离培养技术的限制，难以获得它们的纯培养进行生理生化学等指标的分析，这样16SrRNA/rDNA序列分析的优越性就体现出来了。
16SrDNA序列分析技术的基本原理就是从微生物样本中提取16Sr1ZNA的基因片段。
通过克降、测序或酶切、探针杂交获得16SrRNA序列信息，再与16SrRNA数据库中的序列数据或其他数据进行比较，确定其在进化树中位置，从而鉴定样本中可能存在的微生物种类⑨。
DNA分析技术是在一系列分子技术的基础上发展起来的，其中RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)、RFLP (Restriction Fragment Lengm Polymorphism)、AFLP(Amplified Restfiction Fragment Polymorphism)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳((TGGE )等技术是分子生物学技术的核心。
⑩
3.结语
传统培养分离方法积累了种群分类的大量数据，为现代分子生物学技术提供了良好的背景材料，在功能特性的认识具有独特的优势。
而以16SrDNA为基础的现代分子生物学技术提高了解析的灵敏度，在基因水平上扩大了物种多样性的视野，可以实现快速，微量、准确简便的对微生物进行分类鉴定。
相信随着分子生物学技术和研究方法的创新的完善，对微生态系统的认识必将不断地深入，并能够合理有效地加以开发和利用，使科学技术切实得以服务十生产实践。
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⑨洪义国，孙谧，张云波，李勃生.16SrRNA在海洋微生物系统分子分类鉴定及分子检测中
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