发酵——染菌
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发酵常见染菌原因及分析
发酵常见染菌原因及分析发酵是一种利用微生物代谢产生特定产物的过程。
在发酵过程中，微生物的生长和代谢活动是至关重要的，因此发酵过程中的染菌问题是不可避免的。
染菌的原因可能有很多，包括环境因素、操作不当、杂菌污染等。
下面将详细介绍一些常见的染菌原因及分析。
1. 空气中存在杂菌空气中存在大量的微生物，包括细菌、真菌和酵母等。
这些微生物可以通过空气传播到发酵系统中，并在适宜的环境条件下生长繁殖，导致发酵过程中的染菌问题。
为了减少空气中的杂菌对发酵系统的污染，可以采取以下措施：- 严格控制发酵环境的洁净度，保持操作区域的干净和无尘。
- 在发酵容器上使用滤器，可以有效阻止空气中的杂菌进入容器。
- 在操作过程中尽量减少容器的开启和移动，以减少空气中的杂菌进入的机会。
2. 操作不严谨对于发酵过程来说，操作的规范性和严密性非常重要。
操作不当往往是染菌的主要原因之一。
以下是一些可能导致染菌的操作不严谨的情况：- 使用不洁净的操作工具或容器，如不经过高温灭菌的培养瓶、试管等。
- 未经过严格的消毒处理，如未进行高温灭菌或化学消毒。
- 制备培养基时没有正确的称量和配比，导致培养基中存在过多或过少的某种成分。
- 操作时没有佩戴干净的实验室服装和帽子，容易将外界的杂菌带入发酵系统。
- 操作时没有对抽取样本的工具进行适当的消毒处理，可能会将外界的杂菌带入样品中。
为了避免操作不严谨导致的染菌问题，应采取以下预防措施：- 在实验室中建立操作规范，并进行培训，确保操作人员熟知并遵守相关操作程序。
- 使用洁净的操作工具和容器，并进行必要的灭菌处理。
- 对操作区域进行定期的清洁和消毒，保持操作环境的洁净。
- 在操作过程中密封容器，减少外界微生物的进入。
- 检查操作工具的消毒情况，确保消毒措施的有效性。
3. 培养基污染发酵过程中，培养基是微生物生长和代谢的基础。
如果培养基本身存在污染，就会导致发酵过程的染菌问题。
常见的培养基污染原因包括：- 培养基配制不当，如配制浓度错误、培养基中存在异物。
发酵生产染菌及其防治-PPT精选全文
积物,在关闭时不会使紧密面轧坏。 4)、检修方便。但须定期检查隔膜有否老化及脱
落。
(2)管路得连接
管子得连接有螺纹连接、法兰连接与焊接三种。
A、 螺纹连接。
需在管端铰出螺纹,安装时在螺纹上涂以白漆并加麻 丝(或聚四氟乙烯薄膜)作填料,密封要求高得可用石墨粉加 少许机油作填料,用氧化铅甘油胶合剂更好。
过滤器器壁腐蚀形成氧化铁层,就是多孔物质,空气 会短路,使空气中带菌并造成污染。
过滤介质变位:
活性炭棉花作为介质得过滤器,活性炭 受到气流得冲击而破碎、灰化、体积减小、 空间增大,上下两端得棉花受空气得顶撞力 而逐渐改变位置。
设备与管件得渗漏一般就是指设备与管件由于腐蚀、 内应力或其她原因形成微小漏孔所发生得渗漏现象。
这些漏孔很小,特别就是不锈钢材料形成得漏孔更小, 有时肉眼不能直接觉察,需要通过一定得试漏方法才能发 现。
1、发酵罐得渗漏
(1)冷却管得渗漏
由于发酵液腐蚀、固体物料摩擦引起管外壁磨损。管 内冷却水得浸泡、冲击、蒸汽冲击导致管内壁磨损。所以 冷却管就是发酵罐中最容易渗漏得部件之一。
截止阀在使用中经常发生以下两个问题:
a 阀心轧坏。物料中得硬质物或焊接施工后得焊渣以 及螺钉零件等被带到阀内,当关闭得,阀心与阀座被上述坚 硬物轧住,能将紧密面轧成凹凸不平得痕迹,就关不严密。
b 填料得渗漏。操作时用扳手过分关紧,会使阀杆弯 曲,弯曲后得阀杆不仅启动费力,并且使填料部分不紧密而 引起渗漏。阀门在使用一定时间后,阀杆磨损或填料损坏 也会引起渗漏,就需要将填料压盖适当拧紧或更换填料。
发酵工厂得有关管路要保持光滑、通畅、密封性 好,以避免与减少管道染菌得机会。
例如:
法兰与管子焊接时受热不匀使法兰翘曲密封面发生 凹凸不平现象就会造成死角。
落。
(2)管路得连接
管子得连接有螺纹连接、法兰连接与焊接三种。
A、 螺纹连接。
需在管端铰出螺纹,安装时在螺纹上涂以白漆并加麻 丝(或聚四氟乙烯薄膜)作填料,密封要求高得可用石墨粉加 少许机油作填料,用氧化铅甘油胶合剂更好。
过滤器器壁腐蚀形成氧化铁层,就是多孔物质,空气 会短路,使空气中带菌并造成污染。
过滤介质变位:
活性炭棉花作为介质得过滤器,活性炭 受到气流得冲击而破碎、灰化、体积减小、 空间增大,上下两端得棉花受空气得顶撞力 而逐渐改变位置。
设备与管件得渗漏一般就是指设备与管件由于腐蚀、 内应力或其她原因形成微小漏孔所发生得渗漏现象。
这些漏孔很小,特别就是不锈钢材料形成得漏孔更小, 有时肉眼不能直接觉察,需要通过一定得试漏方法才能发 现。
1、发酵罐得渗漏
(1)冷却管得渗漏
由于发酵液腐蚀、固体物料摩擦引起管外壁磨损。管 内冷却水得浸泡、冲击、蒸汽冲击导致管内壁磨损。所以 冷却管就是发酵罐中最容易渗漏得部件之一。
截止阀在使用中经常发生以下两个问题:
a 阀心轧坏。物料中得硬质物或焊接施工后得焊渣以 及螺钉零件等被带到阀内,当关闭得,阀心与阀座被上述坚 硬物轧住,能将紧密面轧成凹凸不平得痕迹,就关不严密。
b 填料得渗漏。操作时用扳手过分关紧,会使阀杆弯 曲,弯曲后得阀杆不仅启动费力,并且使填料部分不紧密而 引起渗漏。阀门在使用一定时间后,阀杆磨损或填料损坏 也会引起渗漏,就需要将填料压盖适当拧紧或更换填料。
发酵工厂得有关管路要保持光滑、通畅、密封性 好,以避免与减少管道染菌得机会。
例如:
法兰与管子焊接时受热不匀使法兰翘曲密封面发生 凹凸不平现象就会造成死角。
发酵染菌的检查
染菌的检查、原因分析和防止措施染菌的检查、原因分析和防止措施1.染菌的检查与判断在发酵过程中对杂菌污染的及早发现，及时处理，是免除染菌造成严重损失的重要问题。
因此，要求有确切、迅速的方法来检出杂菌的污染，目前常用方法主要有以下几种：（1）显微镜检查通常用革兰氏染色法，染色后在高倍显微镜下观察。
对霉菌、酵母发酵，先用低倍显微镜观察生产菌的特征，然后再用高倍显微镜观察有否染菌存在，根据生产菌与杂菌的特征区别，判断是否染菌。
必要时，可进行芽孢和鞭毛染色。
（2）平板划线培养或斜面培养检查法先将经灭菌的固体培养基倒入灭菌的平板中置培养箱摄氏37度，保温24h检查无菌即可使用。
将需要检查的样品，在无菌平板上划线，分别置摄氏37度、摄氏27度培养，以适应嗜中菌和低温菌的生长，一般在8h后即可观察。
噬菌体检查可采用双层平板培养法，底层同为肉汁琼脂培养基，上层减少琼脂用量。
先将灭菌的底层培养基熔后倒平板，凝固后，将上层培养基熔解并保持摄氏40度，加生产菌作为指示菌和待检样品混合后迅速倒在底层平板上，置培养箱保温培养，经12~20h培养，观察有无噬菌斑。
培养基（PH7.0）葡萄糖（%）牛肉膏（%）蛋白胨（%）氯化钠（%）琼脂（%）上层0.5 1.0 1.0 0.5 1.0下层0.5 1.0 1.0 0.5 2.0（3）肉汤培养检查法将需要检查样品接入经灭菌并经过检查无菌的肉汤培养基中，放置摄氏37度和摄氏27度分别培养24h，进行观察，并取样镜检。
此法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，也可用于噬菌体检查，此时使用生产菌作为指示菌。
葡萄糖酚红肉汤培养基：牛肉膏0.3%，葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，蛋白胨0.8%，1%酚红溶液0.4%，PH7.2。
用以上的检查方法检查未发现污染，还不能肯定未被污染。
除以上方法外，还可以从发酵过程的异常现象来判断是否染菌，如溶解氧、PH值、排气中CO2含量和菌体酶活力等变化来判断。
发酵罐染菌的解决方法
发酵罐染菌的解决方法
1、种子培养期染菌的处理
一旦发现种子受到杂菌的污染，该种子不能再接入发酵罐中进行发酵，应经灭菌后弃之，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。
同时采用备用种子，选择生长正常无染菌的种子接人发酵罐，继续进行发酵生产。
如无备用种子，则可选择一个适当菌龄的发酵罐内的发酵液作为种子，进行“倒种”处理，接人新鲜的培养基中进行发酵，从而保证发酵生产的正常进行。
2、发酵前期染菌的处理
当发酵前期发生染菌后，如培养基中的碳、氮源含量还比较高时，终止发酵，将培养基加热至规定温度，重新进行灭菌处理后，再接入种子进行发酵；如果此时染菌已造成较大的危害，培养基中的碳、氮源的消耗量已比较多，则可放掉部分料液，补充新鲜的培养基，重新进行灭菌处理后，再接种进行发酵。
也可采取降温培养、调节pH值、调整补料量、补加培养基等措施进行处理。
3、发酵中、后期染菌处理
发酵中、后期染菌或发酵前期轻微染菌而发现较晚时，可以加入适当的杀菌剂或抗生素以及正常的发酵液，以抑制杂菌的生长速度，也可采取降低培养温度、降低通风量、停止搅拌、少量补糖等措施进行处理。
当然如果发酵过程的产物代谢已达一定水平，此时产品的含量若达一定值，只要明确是染菌也可放罐。
对于没有提取价值的发酵液，废弃前应加热至120℃以上、保持30min后才能诽
放。
4、染菌后对设备的处理
染菌后的发酵罐在重新使用前，必须在放罐后进行彻底清洗，空罐加热灭菌后至120℃以上、30min后才能使用。
也可用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12h以上等方法进行处理。
发酵的染菌
谢谢观赏
P10生物制药二班 432宿舍
1、国外一抗生素发酵染菌原因的分析
染菌原因 种子带菌 百分率% 9.64 染菌原因 蛇管穿孔 接种管穿孔 阀门泄漏 百分率% 5.89 0.39 1.45
接种时罐压跌 0.19 零 培养基灭菌不 0.79 透
空气系统带菌 Biblioteka 9.96搅拌轴密封泄 2.09 漏 泡沫冒顶 夹套穿孔 0.48 12.36
2、防止设备渗漏
设备和管件的渗漏指设备和管件由于腐蚀、内 应力或其他原因形成微小漏孔发生渗漏现象。 这些漏孔很小，特别是不锈钢材料形成的漏孔更 小，有时肉眼不能直接觉察，需要通过一定的试漏方 法才能发现。 设备上一旦渗漏，就会造成染菌，例如冷却盘管、 夹套穿孔渗漏，有菌的冷却水便会通过漏孔而进入发 酵罐中招致染菌。阀门渗漏也会使带菌的空气或水进 入发酵罐而造成染菌。
原材料储存和保管，如液胨、玉米浆、母液糖 等有机原料——杂菌的数量 发酵罐、培养基配制罐等设备的清洗质量—— 有无灭菌的死角对减少或避免染菌仍然是十分必要 的 5、技术管理不善 技术管理就是要对发酵每个环节严格控制，发 酵中稍有不慎就可能染菌，所以不能有侥幸心理 而放松管理。
发酵过程中染菌的预防
3、防止培养基灭菌不彻底
培养基灭菌方法——高压蒸汽灭菌 分批灭菌 连续灭菌 1210C，30分钟 罐温125－1300C，30－45分钟
4、防止空气引起的染菌
提高空气进风口的高度，减少进口空气含菌数。 及时清除压缩空气中的水、油，提高压缩空气温 度，降低相对湿度，提高介质的过滤效果。 合理设计、选用过滤器及过滤介质，同时应注意 介质装填均匀、平整。避免空气走短路和吹翻介 质，对分过滤器要选用过滤效果较高的过滤器， 并做到使用一次灭菌一次，并定期检查，更换新 的介质。
发酵工程 第十章 发酵染菌及防治
丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自
溶，发酵液粘度增加，过滤困难
处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮 凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采
用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间 极易发生乳化
第二节 发酵染菌的分析
一、 染菌的检查与判断
如何做到不发生染菌？ 发现染菌后如何查明染菌类型及其原因？ 发现染菌后如何尽快控制污染？
思考题：如何筛选或选育抗某种杂菌的新菌株 来预防污染发生？
采取哪些措施能够保持无菌发酵？
物料、培养基、中间补料要灭菌； 发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发
酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌；
好气发酵通入的空气要除菌；
种子无污染；接种无菌操作过关；
为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。
本章小结
掌握有关无菌技术的基本概念 发酵工业污染的原因及其防治策略
二、染菌对不同发酵过程的影响
A．细菌
Байду номын сангаас
谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂 菌，但噬菌体威胁大。
肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养
成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。
二、染菌对不同发酵过程的影响
B. 霉菌
PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发酵 一无所获。
一、污染原因分析
①种子带菌 ②无菌空气带菌 ③设备渗漏 ④灭菌不彻底 ⑤操作失误 ⑥技术管理不善
从污染时间看：早期污染可能与①②④⑤→接种操作 不当有关；后期污染可能与③⑤及中间补料有关。 从杂菌种类看： 耐热芽孢杆菌：与④有关 球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关 浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏 霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问 题 酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长 从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所 污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题，若个别 罐连续染菌，一般是设备问题。
溶，发酵液粘度增加，过滤困难
处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮 凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采
用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间 极易发生乳化
第二节 发酵染菌的分析
一、 染菌的检查与判断
如何做到不发生染菌？ 发现染菌后如何查明染菌类型及其原因？ 发现染菌后如何尽快控制污染？
思考题：如何筛选或选育抗某种杂菌的新菌株 来预防污染发生？
采取哪些措施能够保持无菌发酵？
物料、培养基、中间补料要灭菌； 发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发
酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌；
好气发酵通入的空气要除菌；
种子无污染；接种无菌操作过关；
为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。
本章小结
掌握有关无菌技术的基本概念 发酵工业污染的原因及其防治策略
二、染菌对不同发酵过程的影响
A．细菌
Байду номын сангаас
谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂 菌，但噬菌体威胁大。
肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养
成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。
二、染菌对不同发酵过程的影响
B. 霉菌
PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发酵 一无所获。
一、污染原因分析
①种子带菌 ②无菌空气带菌 ③设备渗漏 ④灭菌不彻底 ⑤操作失误 ⑥技术管理不善
从污染时间看：早期污染可能与①②④⑤→接种操作 不当有关；后期污染可能与③⑤及中间补料有关。 从杂菌种类看： 耐热芽孢杆菌：与④有关 球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关 浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏 霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问 题 酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长 从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所 污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题，若个别 罐连续染菌，一般是设备问题。
发酵灭菌、染菌知识(发酵篇)
• 2.1.3在灭菌过程中要控制好培养基的泡沫 灭菌时，随着罐温的上升，培养基中的有机氮源 因配比、品种、装量的差异，或者由于用汽不当会产 生大量的泡沫。这些泡沫的内部是空气，由于空气的 比热大，液体的比热小，泡沫便成为隔热层，蒸汽热 量难以穿透，杂菌不易被杀灭。尤其是发生泡沫顶罐 逃液，或在培养液表面形成厚厚的泡沫层都易使培养 基灭菌不彻底，是灭菌操作应防止的弊病。选择适当 的原料配比和培养基装量，提高原材料质量，消前适 量补加油脂或者化学消泡剂，讲究合理的用汽操作可 以防止在培养基灭菌过程中泡沫失控。
实消过程中常见的问题
• 1) 实消过程中罐压上升缓慢是什么原因? 实消过程中加热升温升压的时间一般控制在 30～40分钟，即可使蒸汽压力到达0.1MPa，温度达 到118~120℃。这是正常的控制范围。如果超出以上 时间，仍然达不到要求，需进行如下检查： (1)总蒸汽压力是否低于0.2Mpa。 (2)罐上夹层或蛇形管进水阀、回水阀是否泄漏。 (3)夹层或蛇管内冷水能否畅通排除。 (4)进汽支管及阀门有无堵塞。 (5)罐上压力表是否灵敏。 (6)各支管进汽量控制是否适当。
• 4) 如何防止灭菌过程中发酵罐玻璃视镜破裂? （1）灭菌过程中严禁超压工作。 （2）经常检查发酵罐压力表灵敏度，防止失灵。 （3）视镜紧固螺丝应受力均匀，不偏紧。 （4）预热时，要待罐温上升后再开冲视镜蒸汽阀进汽。 （5）灭菌时，视镜上应有遮盖物。 （6）严禁在灭菌过程中贴着透视镜窥视。
3﹑染菌的后果﹑预防及 处理
总之，实罐灭菌时必须注意操作过程中的合理用汽。 (1)预热升温不宜太快，升温至100℃一般不少于40 分钟，尽量排尽罐内冷空气。 (2)避免蒸汽压力的骤增骤减，维持蒸汽压力的稳定 和防止泡沫顶罐逃液。 (3)保温时应注意各路蒸汽进汽的压力，使之均匀畅 通无短路无堵塞。 (4)保温过程中，罐压和温度应相对应，防止产生假 压力和假温度。 (5)进排汽的流量控制恰当，注意节约用汽。 (6)严防高温高压闷罐导致培养基营养成份的破坏。
工业发酵染菌原因
不同染菌途径对发酵的影响：1、种子带菌：种子带菌可使发酵染菌具有连续性；2、空气染菌：空气染菌也是发酵染菌具有连续性，导致染菌范围扩大至所有发酵罐；3、培养基或设备灭菌不彻底：一般为孤立事件，不具有连续性；4、设备泄露：这种途径造成染菌的危害性较大；发酵染菌的防止一、种子带菌的原因及防止1.带菌的原因（1）无菌室的无菌条件不符合要求；（2）培养基灭菌不彻底；（3）操作不当。
2.种子带菌的防止种子带菌是发酵前期染菌的原因之一。
在每次接种后应留取少量种子悬浮液进行平板、肉汤培养，借以说明是否种子中带杂菌。
种子培养的设备和装置有无菌室、灭菌锅和摇瓶机等。
（1）无菌室接种、移种等无菌操作需要在无菌室内进行。
无菌室面积不宜过大，一般约4~6米2，高约2.6米。
为了减少外界空气的侵入，无菌室要有1~3个套间（缓冲过道）（参照下图）。
无菌室内部的墙壁、天花板要涂白漆或采用磨光石子，要求无裂缝，墙角最好做成圆弧形，便于揩擦清洗以减少空气中微生物的潜伏场所，室内布置应尽量简单，最好能安装空气调节装置，通入无菌空气并调节室内的温湿度。
无菌室的每个套间一般都用紫外线灭菌。
通常用30瓦紫外线灭菌灯照射20~30分钟即可。
紫外线杀菌的效率还与室内的空气性质有光；空气温度高杀菌效率高，空气中灰尘多杀菌效率低，而相对湿度高则紫外线灯的使用寿命长。
紫外线能穿过石英但不能透过玻璃。
配合使用的化学灭菌药剂有：用作喷洒或揩擦的（以揩擦为主）有75%酒精、0.25%新洁尔灭（季铵盐）、0.6~1%漂白粉、0.5%石炭酸、0.5%过氧乙酸、1%煤酚皂（来苏尔）、0.5%高锰酸钾、300单位/毫升土霉素、50单位/毫升制霉菌素等；用作熏蒸的有甲醛（每立方米空间约用10毫升）或硫磺（每立方米空间约用2~3克）。
要根据不同的情况采用不同的灭菌剂。
如检查出无菌室中潜伏的的微生物中细菌较多，用石炭酸、土霉素等灭菌较好；如无菌室中霉菌多可以采用制霉菌素；如有噬菌体则用甲醛、双氧水或高锰酸钾等较好。
发酵灭菌、染菌知识
定时观察试管内肉汤培养基的颜色变化,同时进行显微镜观察。 耐受高温及压力，不易损坏。
菌,均作“染菌”论处。 设备、管道等存在死角有以下几种可能：发酵设备由于如焊接等制作不当引起的死角，管道安装不当造成的死角，罐底部堆积的固形
物形成硬块从而包埋脏物，罐底的加强板长期受压缩空气顶吹而腐蚀受损或裂缝等造成灭菌不彻底的死角。 在发酵的中后期染菌,一是加入适量的杀菌剂,如呋喃西林或某些抗生素,抑制杂菌的生长。
染菌后的处理 把该肉汤接入无菌肉汤，37℃恒温培养48小时，肉汤仍不变色。
分析案例－－大观霉素
另外，如果杂菌繁殖的代时较长，计算出的杂菌在发酵罐中生长到一定浓度所需的时间已超过了发酵罐的培养时间，就要考虑一次性
有大量杂菌进入嗨哟种子带菌的可能性了。
❖ 污染杂菌的处理 把杂菌接入空白发酵瓶，在不同培养时间取样，进行平板菌落计数，计算出发酵瓶内的菌体数。
针形阀
❖ 一般是用来控制微量调节的小型阀门，它的 一般通径有15mm和10mm两种。
❖ 优点：耐受高温、高压、不易腐蚀；易于控 制微量流速和流加、滴加补料；操作方便， 易于更换。缺点：易于损坏，尤其是阀头容 易掉头；因为结构小，通道小，所以容易被 堵塞。
旋塞阀
❖ 也称考克，是一种不耐受高温和高压，但又 易于操作的阀门。材质一般以铸铁为主，这 就决定了它不能耐受高温（一般要求小于等 于100 ℃）和高压，不能猛力开关，以免扭 断、变形。
1.1.2 连续灭菌
❖ 连续灭菌的加热、保温和冷却 3 个阶段分别 在不同的专有设备中进行。
❖ 板式热交换器连续灭菌装置的特点是单位体积 的热交换器具有较高的传热面积 ,且可根据生产 需要改变其换热面积的大小;蒸汽喷射连续灭菌 装置的特点是加热、冷却极为短暂 ,缺点是培养 基会被蒸汽的冷凝水稀释。下面是组合式
菌,均作“染菌”论处。 设备、管道等存在死角有以下几种可能：发酵设备由于如焊接等制作不当引起的死角，管道安装不当造成的死角，罐底部堆积的固形
物形成硬块从而包埋脏物，罐底的加强板长期受压缩空气顶吹而腐蚀受损或裂缝等造成灭菌不彻底的死角。 在发酵的中后期染菌,一是加入适量的杀菌剂,如呋喃西林或某些抗生素,抑制杂菌的生长。
染菌后的处理 把该肉汤接入无菌肉汤，37℃恒温培养48小时，肉汤仍不变色。
分析案例－－大观霉素
另外，如果杂菌繁殖的代时较长，计算出的杂菌在发酵罐中生长到一定浓度所需的时间已超过了发酵罐的培养时间，就要考虑一次性
有大量杂菌进入嗨哟种子带菌的可能性了。
❖ 污染杂菌的处理 把杂菌接入空白发酵瓶，在不同培养时间取样，进行平板菌落计数，计算出发酵瓶内的菌体数。
针形阀
❖ 一般是用来控制微量调节的小型阀门，它的 一般通径有15mm和10mm两种。
❖ 优点：耐受高温、高压、不易腐蚀；易于控 制微量流速和流加、滴加补料；操作方便， 易于更换。缺点：易于损坏，尤其是阀头容 易掉头；因为结构小，通道小，所以容易被 堵塞。
旋塞阀
❖ 也称考克，是一种不耐受高温和高压，但又 易于操作的阀门。材质一般以铸铁为主，这 就决定了它不能耐受高温（一般要求小于等 于100 ℃）和高压，不能猛力开关，以免扭 断、变形。
1.1.2 连续灭菌
❖ 连续灭菌的加热、保温和冷却 3 个阶段分别 在不同的专有设备中进行。
❖ 板式热交换器连续灭菌装置的特点是单位体积 的热交换器具有较高的传热面积 ,且可根据生产 需要改变其换热面积的大小;蒸汽喷射连续灭菌 装置的特点是加热、冷却极为短暂 ,缺点是培养 基会被蒸汽的冷凝水稀释。下面是组合式
发酵过程染菌及其防治
发酵染菌：指在发酵过程中生产菌以外的其他微生物侵入了发酵系统，从而使发酵过程失去真正意义上的纯种培养。
染菌对发酵的影响一、染菌对不同发酵过程的影响1、青霉素发酵过程：由于许多杂菌都能产生青霉素酶，因此不管染菌是发生在发酵前期、中期或后期，都会使青霉素迅速分解破坏，使目的产物得率降低，危害十分严重。
2、核苷或核苷酸发酵过程：由于所用的生产菌种是多种营养缺陷型微生物，其生长能力差，所需的培养基营养丰富，因此容易受到杂菌的污染，且染菌后，培养基中的营养成分迅速被消耗，严重抑制了生产菌的生长和代谢产物的生成。
3、柠檬酸等有机酸发酵过程：一般在产酸后发酵液的pH值比较低，杂菌生长十分困难，在发酵中、后期不太会发生染菌，主要是要预防发酵前期染菌。
4、谷氨酸发酵：周期短，生产菌繁殖快，培养基不太丰富，一般较少污染杂菌，但噬菌体污染对谷氨酸发酵的影响较大。
二、染菌发生的不同时间对发酵的影响1、种子培养期染菌种子培养主要是使微生物细胞生长与繁殖，此时，微生物菌体浓度低，培养基地营养十分丰富，比较容易染菌。
若将污染的种子带入发酵罐，则危害极大，因此应严格控制种子染菌的发生。
一旦发现种子受到杂菌的污染，应经灭菌后弃去，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。
2、发酵前期染菌在发酵前期，微生物菌体主要是处于生长、繁殖阶段，此时期代谢的产物很少，相对而言这个时期也容易染菌。
染菌后的杂菌将迅速繁殖，与生产菌争夺培养基中的营养物质，严重干扰生产菌的正常生长、繁殖及产物的生成。
3、发酵中期染菌发酵中期染菌将会导致培养基中的营养物质大量消耗，并严重干扰生产菌的代谢，影响产物的生成。
有的染菌后杂菌大量繁殖，产生酸性物质，使pH值下降，糖、氮等的消耗加速；菌体自溶，致使发酵液发粘，产生大量的泡沫，代谢产物的积累减少或停止；有的染菌后会使已生成的产物被利用或破坏。
从目前的情况来看，发酵中期染菌一般较难挽救，危害性较大，在生产过程中应尽力做到早发现、快处理。
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（4）发酵后期染菌
发酵后期发酵液内已积累大量的产 物，特别是抗生素，对杂菌有一定 的抑制或杀灭能力。因此如果染菌 不多，对生产影响不大。如果染菌 严重，又破坏性较大，可以提前放 罐。
（二）发酵染菌对提炼和产品质量的影响
1、发酵染菌对过滤的影响 1).对过滤的影响： 发酵液的粘度加大 菌体大多自溶 由于发酵不彻底，基质的残留浓度增加 2)造成的后果： 过滤时间拉长，影响设备的周转使用， 破坏生产平衡 大幅度降低过滤收率
（3）发酵中期染菌 发酵中期染菌会严重干扰产生菌的代谢。杂菌大 量产酸，培养液pH下降；糖、氮消耗快，发酵 液发粘，菌丝自溶，产物分泌减少或停止，有时 甚至会使已产生的产物分解。有时也会使发酵液 发臭，产生大量泡沫。 措施 降温培养，减少补料，密切注意代谢变 化情况。如果发酵单位到达一定水平可以提前放 罐，或者抗生素生产中可以将高单位的发酵液输 送一部分到染菌罐，抑制杂菌。
不 同 产 品
链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素 等虽不象青霉素发酵染菌那样一无所 得，但也会造成不同程度的危害。如 杂菌大量消耗营养干扰生产菌的正常 代谢；改变pH，降低产量。 灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗 生素抑制霉菌，对细菌几乎没有抑制 和杀灭作用。
不 同 产 品
疫苗生产危害很大。现在疫苗多采用 深层培养，这是一类不加提纯而直接 使用的产品，在其深层培养过程中， 一旦污染杂菌，不论死菌、活菌或内 外毒素，都应全部废弃。因此，发酵 罐容积越大，污染杂菌后的损失也越 大。
操作问题
10.13
10.15
夹套穿孔
12.36
原因不明
24.91
2，国内一制药厂发酵染菌原因的分析
染菌原因 外界带入杂菌（取样、补料带入） 设备穿孔 空气系统带菌 停电罐压跌零 接种 蒸汽压力不够或蒸汽量不足 管理问题 操作违反规程 种子带菌 原因不明 百分率，% 8.20 7.60 26.00 1.60 11.00 0.60 7.09 1.60 0.60 35.00
1，国外一抗生素发酵染菌原因的分析
染菌原因 种子带菌 接种时罐压跌零 培养基灭菌不透 空气系统带菌 百分率，% 9.64 0.19 0.79 19.96 染菌原因 蛇管穿孔 接种管穿孔 阀门泄漏 罐盖漏 百分率， % 5.89 0.39 1.45 1.54
搅拌轴密封泄漏
泡沫冒顶
2.09
0.48
其他设备漏
例如
青霉素发酵：污染细 短产气杆菌比粗大杆 菌的危害大 链霉素发酵：污染细 短杆菌、假单孢杆菌 和产气杆菌比粗大杆 菌的危害大 四环素发酵：污染双 球菌、芽孢杆菌和夹 膜杆菌的危害较大
柠檬酸发酵：污染青霉 菌 肌苷、肌苷酸发酵：污 染芽孢杆菌谷氨酸发 酵：污染噬菌体 高温淀粉酶发酵：污染 芽孢杆菌和噬菌体
2、空气带菌 从日本工业技术院和上海第四制药厂分 析空气带菌而造成的染菌分别为19.96 ％和 26%。国内外空气除菌技术虽已 有较大改善，但仍然没有使染菌率降低 到理想的程度。因为空气除菌系统较为 复杂，环节多，偶遇不慎便会导致空气 除菌失败。
3、种子带菌
种子带菌又分为种子本身带菌和种 子培养过程中染菌。加强种子管理， 严格无菌操作，种子本身带菌是可 以克服的。种子培养过程染菌与发 酵一样有许多因素造成。
原材料储存和保管，如液胨、玉米 浆、母液糖等有机原料——杂菌的数 量 发酵罐、培养基配制罐等设备的清 洗质量——有无灭菌的死角 对减少或避免染菌仍然是十分必要的。
5、技术管理不善
技术管理就是要对发酵每个环节严 格控制，发酵中稍有不慎就可能染 菌，所以不能有侥幸心理而放松管 理
三、无菌状况的检测 1、环境无菌的检查
4、灭菌不彻底 灭菌技术的好坏与灭菌质量很有关系 蒸汽通入培养基，升温快慢、保温时间— —产生过多泡沫 蒸汽总压是否达到要求标准 环境中的杂菌数量因季节而有很大差别。 如上海第四制药厂在卡那霉素生产中，于 炎热的夏季将连续灭菌预热至800C的培养 基采样培养，可发现无法计数的大量的芽 孢杆菌；而在冬季取样的培养中，则仅发 现2～3个芽孢杆菌。故染菌率因季节不同 而发生明显变化。
四、染菌情况分析 染菌的原因有多种，对于实际情况 如何分析呢？ 1、单罐染菌 不是系统问题，而是该罐本身的问 题。如种子带菌、培养基灭菌不彻 底、罐有渗漏、分过滤器失效
2、多罐染菌 系统问题，如空气过滤系统有问题， 特别是总过滤器长期没有检查，可能 受潮失效；移种或补料的分配站有渗 漏或灭菌不彻底 3、前期染菌 种子带菌、培养基灭菌不彻底
造成染菌的主要原因总结 1、设备渗漏 设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种 管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖漏 和其它设备漏等。从日本工业技术院发酵 研究所对染菌原因分析发现，这类染菌占 33.85％，上海三厂的分析这类染菌为37.5 ％。所以说加强设备本身及附属零部件的 严密度检查，对制服染菌是极其主要的， 也是重要的。
（一）染菌对发酵的影响 生产不同的品种，可污染不同种 类和性质的微生物。 不同污染时间，不同污染途径， 污染不同菌量，不同培养基和培养条 件又可产生不同后果
1、发酵染菌对不同品种的影响
不 同 菌
不 同 产 品
放线菌由于生长的最适pH为7左右， 因此染细菌为多，而霉菌生长pH为5 左右，因此染酵母菌为多。 青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能 直接产生青霉素酶，而另一些杂菌则 可被青霉素诱导而产生青霉素酶。不 论在发酵前期、中期或后期，染有能 产生青霉素酶的杂菌，都能使青霉素 迅速破坏。
4、中后期染菌
补料的料液灭菌不彻底或补料管道、阀 门渗漏，一般不会是种子问题
有时发酵罐偶而染菌，原因一时又找不出，一般 可以采取以下措施： (1)连续灭菌系统前的料液贮罐在每年4一10月份 (杂菌较旺盛生长的时间)加入0.2%甲醛，加热 至80°C，存放处理4小时，以减少带入培养 液中的杂菌数。 (2)对染菌的罐，在培养液灭菌前先加甲醛进行空 消处理。甲醛用量每立方米罐的体积 0.12~0.17升。 (3)对染菌的种子罐可在罐内放水后进行灭菌，灭 菌后水量占罐体的三分之二以上。这是因为细 菌芽孢较耐干热而不耐湿热的缘故。
设备染菌率：统计发酵罐或其他设备的染菌率 不同品种发酵的染菌率：统计不同品种发酵的 染菌率，有助于查找不同品种发酵染菌的原因
（二）染菌原因 造成染菌的因素很多，但总结几十年的经 验，对绝大部分罐批染菌的原因是比较清楚 的，但在实际生产中发酵染菌率仍比较高， 可以说产生这种现象大多数是由于工作中 “明知故犯”“不负责任”和“侥幸心理” 所造成的。例如，灭菌的蒸汽压不足不能灭 菌；设备有渗漏不能进罐等等都是众所周知 的，但因为有侥幸心理还是照样灭菌，进罐， 结果以污染杂菌而告终。现将我们收集到的 国内外几家抗生素工厂发酵染菌原因列于下：
五、染菌的防止
1、防止种子带菌 制备种子时对沙土管及摇瓶严格加以种时的无菌操作
子瓶、母瓶的移种和培养
无菌室和摇床间都要保持清洁。无菌室内要 供给恒温恒湿的无菌空气，还要装紫外灯用以 灭菌，或用化学药品灭菌。
无菌室要求
无菌室装有紫外灯，打开紫外灯，照半小时， 关灯后15分钟再接种。 用消毒药水如新洁而灭配成1/1000浓度擦 桌子、拖地，开启超净台的通风， 接种时必须在超净台上操作，超净台装有一 台鼓风机，进风口有一粗过滤器，出风口有 高效过滤器，无菌操作 接种人员必须穿无菌服，戴口罩，手用酒精 棉球擦干净。
3.上海第三制药厂染菌原因分析 项目 百分率% 种子带菌 14.15 盘管穿孔 14.20 阀门渗漏 23.30 空气系统有菌 10.0 管理不善 25.80 其它 7.49 原因不明 5.78
管理不善而染菌的有31个罐批，占25.08％经 分析有下表所列原因： 项目 进罐前未做设备严密度检查 接种违反操作规程 检修质量缺乏验收制度 操作不熟练 配料违反工艺规程 调度不当 百分率% 25.8 25.8 19.35 19.35 6.45 3.25
污染杂菌的种类对过滤的影响程度有 差异，如污染霉菌时，影响较小，而 污染细菌时很难过滤。由于过滤困难， 过滤时间拉长，影响发酵液储罐和过 滤设备的周转使用，破坏了生产平衡。 染菌发酵液还会因过滤困难而大幅度 降低过滤收率，直接影响提炼总收率。
2、发酵染菌对提炼的影响
染菌发酵液中含有比正常发酵液更多的水 溶性蛋白和其它杂质。 采用有机溶剂萃取的提炼工艺，则极易发 生乳化，很难使水相和溶剂相分离，影响进 一步提纯。 采用直接用离子交换树脂的提取工艺，如 链霉素、庆大霉素，染菌后大量杂菌黏附在 离子交换树脂表面，或被离子交换树脂吸附， 大大降低离子交换树脂的交换容量，而且有 的杂菌很难用水冲洗干净，洗脱时与产物一 起进入洗脱液，影响进一步提纯。
（2）发酵前期染菌
发酵前期最易染菌，且危害最大。
原因 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞 争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生 很少，抵御杂菌能力弱。 在这个时期要特别警惕以制止染菌的发生。
染菌措施 可以用降低培养温度，调整补料 量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施 予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消 耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重 新接种再用。
3、不同时间染菌对发酵的影响
污染时间是指用无菌检测方法确准的污染 时间，不是杂菌窜入培养液的时间。 杂菌进入培养液后，需有足够的生长、繁 殖的时间才能显现出来，显现的时间又与 污染菌量有关。污染的菌量多，显现染菌 所需的时间就短，污染菌量少，显现染菌 的时间就长。
（1）种子培养期染菌 由于接种量较小，生产菌生长一开始不 占优势，而且培养液中几乎没有抗生素 （产物）或只有很少抗生素（产物）。 因而它防御杂菌能力低，容易污染杂菌。 如在此阶段染菌，应将培养液全部废弃。
尘埃粒子检测
无菌平板检测
2、种子及发酵液无菌状况检测
①显微镜检查：染色 镜检 ②平板划线检查： 到平板 空培养 待测样品划线 培养观察 ③酚红肉汤培养检查： 无菌肉汤培养基空培养 接入样品 培养观察 其他: 溶解氧 pH值 尾气中CO2含量