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临床研究用人间充质干细胞质量评价一、引言人间充质干细胞（MSCs）由于其多向分化潜能、免疫调节特性以及易于体外培养等特点，被广泛用于临床研究。
在众多疾病的治疗中，MSCs 都展现出了巨大的潜力。
然而，要确保其在临床研究中的有效性，首先需要对MSCs的质量进行严格控制和评价。
本文将探讨如何评价临床研究用MSCs的质量。
二、MSCs的质量评价标准1、细胞的纯度和活性：这是MSCs质量评价的核心指标。
纯度是指MSCs中目标细胞的比例，而活性则是指MSCs的增殖能力和分化能力。
2、细胞的遗传稳定性：通过基因测序等方法，可以检测MSCs是否存在基因突变，以及是否存在潜在的致癌风险。
3、细胞的免疫调节特性：MSCs具有免疫调节特性，可以通过抑制免疫反应来降低排斥反应的风险。
因此，评价MSCs的免疫调节特性也是非常重要的。
4、细胞的来源和生产过程：MSCs的来源和生产过程也会对其质量产生影响。
例如，来自患者的自身MSCs可能比来自捐献者的MSCs更适合用于治疗。
同时，生产过程中的质量控制，如无菌操作、细胞培养基的质量等，也会影响MSCs的质量。
三、MSCs质量评价的方法1、细胞形态观察：通过观察MSCs的形态，可以初步判断其是否具有正常的形态学特征。
2、生长曲线测定：通过绘制MSCs的生长曲线，可以评估其增殖能力。
3、细胞表面标志物检测：通过检测细胞表面标志物，可以确定MSCs 的纯度和活性。
4、染色体核型分析：通过染色体核型分析，可以评估MSCs的遗传稳定性。
5、免疫调节特性检测：通过检测MSCs对免疫反应的调节作用，可以评估其免疫调节特性。
6、生产过程质量控制：通过监控生产过程中的关键控制点，可以确保MSCs的生产过程符合质量标准。
四、结论人间充质干细胞（MSCs）在临床研究中的应用前景广阔，但其质量评价是关键环节。
通过对MSCs的纯度、活性、遗传稳定性、免疫调节特性以及生产过程的质量控制等多方面的评价，可以确保其满足临床研究的需求。
isct 间充质干细胞鉴定标准理论说明1. 引言1.1 概述在细胞治疗和再生医学领域，间充质干细胞（ISCT）作为一种重要的细胞资源，引起了广泛的关注。
ISCT具有多向分化潜能、免疫调节作用及促进组织修复的能力，被认为是一种理想的干细胞来源。
然而，由于缺乏统一和规范的鉴定标准，在实践应用中存在着不确定性和挑战。
1.2 文章结构本文将对ISCT进行深入探讨，并重点介绍其鉴定标准的理论说明。
文章包括以下几个部分：引言、ISCT间充质干细胞、鉴定标准理论说明、实践应用与挑战以及结论与展望。
1.3 目的本文旨在系统梳理当前关于ISCT鉴定标准的理论知识，并探讨该领域面临的实践应用和挑战。
通过对ISCT表面标记物使用、功能性特征评估方法以及分子生物学检测手段应用等方面原理的介绍，希望能够提供给读者一个全面的理论基础，并展望ISCT鉴定标准未来的发展方向。
同时，对于临床转化前景展望、存在的问题与挑战以及解决方案和研究进展等方面也将进行讨论。
以上是本文“1. 引言”部分的详细内容。
该部分概述了文章的主题和目的，并介绍了本文的结构。
接下来将继续展开描述ISCT间充质干细胞及其鉴定标准相关内容。
2. ISCT间充质干细胞2.1 定义与特征ISCT（国际干细胞治疗学会）定义了间充质干细胞（MSCs）作为一类多潜能的成体干细胞，具有自我更新和多向分化的能力。
这些细胞可以从不同来源获得，包括骨髓、脐带血、脂肪组织等。
ISCT认为，MSCs应满足以下三个基本标准：1) 在培养条件下，MSCs应具备黏附能力；2) MSCs应表达特定的表面标记物，如CD73、CD90和CD105，并且在同时应该缺乏（或仅有极低水平）CD34、CD45、HLA-DR等造血和免疫相关标记物；3) MSCs应能够分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等不同种类的细胞。
此外，ISCT提出了额外的功能性特点来进一步确认MSCs。
这些功能性特点包括：1) 免疫调节作用：MSCs可以抑制免疫反应，并通过调节T淋巴细胞、B 淋巴细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞的功能来达到免疫调节作用；2) 细胞迁移能力：MSCs具有从注射部位向受损组织迁移的能力；3) 分泌多种生物活性分子：MSCs可以产生多种生长因子、细胞因子和表观遗传调控因子，对损伤修复和组织再生具有重要作用。
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临床研究用间充质干细胞制剂分期检测项目对照表间充质干细胞（MSC）因其来源方便、相对较好的安全性等优点，目前比其他干细胞产品的研发发展更加迅猛。
加拿大、韩国等国家的药品监管机构已批准了超过4种不同来源间充质干细胞制剂作为药物上市，国内也有数家公司正在进行间充质干细胞制剂的注册申报工作，目前有3家获批IND。
间充质干细胞具有跨胚层的多向分化潜能，表现为向骨、软骨、脂肪、肌、神经等细胞分化的能力，而且具有调节免疫应答的特性，在临床研究中主要用于治疗移植物宿主排斥反应（GVHD）、骨关节炎、肝纤维化、糖尿病、结肠炎和红斑狼疮等疾病。
然而，作为细胞治疗产品，间充质干细胞从获取、扩增、体外复杂操作、冻存、使用等不同环节，都可能存在外在和内在的风险因素。
间充质干细胞的分离、培养、扩增等体外操作过程尚缺乏标准化规程，导致不同的间充质干细胞制剂之间的特性，特别是生物学效应差异性较大。
为了更有效地对间充质干细胞制剂进行质量控制，确保其安全、有效和质量可控，我们结合深圳市地方标准《临床研究用人脐带来源间充质干细胞制剂规范》的指导下，整理出了全面的间充质干细胞质量评价体系和相应的检验方法。
以下是临床研究用间充质干细胞制剂分期检测项目对照表：项目分类 | 检测项目 | 标准要求 | 检验段 | 检验类型 |研发阶段 | HBsAg（ELISA法） | HBsAg阴性 | 是 | 出厂检验 |HBcAb（ELISA法） | HBcAb阴性 | 是 | 出厂检验 |HBV-DNA（PCR法） | HBV-DNA阴性 | 是 | 出厂检验 |HCVAb（ELISA法） | HCVAb阴性 | 否 | 既往病史（特别是患有严重传染性疾病）筛查 |HCV-RNA（PCR法） | HCV-RNA阴性 | 否 | 既往病史（特别是患有严重传染性疾病）筛查 |HIV（Ⅰ+Ⅱ）Ab（ELISA法） | HIV（Ⅰ+Ⅱ）Ab阴性 |否 | 既往病史（特别是患有严重传染性疾病）筛查 |HIV-1 RNA（PCR法） | HIV-1 RNA阴性 | 否 | 既往病史（特别是患有严重传染性疾病）筛查 |CMV-IgM（ELISA法） | CMV-IgM阴性 | 否 | 既往病史（特别是患有严重传染性疾病）筛查 |Anti-TP（TRUST或TPPA法） | Anti-TP阴性 | 否 | 既往病史（特别是患有严重传染性疾病）筛查 |EBV-IGM（ELISA法） | EBV-IGM阴性 | 否 | 既往病史（特别是患有严重传染性疾病）筛查 |HTLV | HTLV阴性 | 否 | 既往病史（特别是患有严重传染性疾病）筛查 |生产制备阶段 | ALT | 0—40U/L | 否 | 出厂检验 |间充质干细胞 | 2500到5800 | 是 | 出厂检验 |乳白色至淡黄色的澄明液体，无肉眼可见异物，如沉淀、絮状物等。
骨髓间充质干细胞形态骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。
它们存在于人体骨髓、脂肪组织、胎盘、脐带血和其他组织中。
MSCs在维持组织稳态、修复损伤和参与免疫调节等方面起着重要作用。
本文将从形态学角度探讨骨髓间充质干细胞的特点和特征。
骨髓间充质干细胞的形态特征主要体现在细胞形状、细胞质和细胞核结构等方面。
就细胞形状而言，MSCs通常呈长条状或星形状。
它们的细胞质富含丰富的内质网和线粒体，同时还含有一些囊泡和小颗粒。
细胞核通常呈椭圆形或卵圆形，核质比细胞质稍大，核内可见明显的核仁。
此外，骨髓间充质干细胞还具有一定的异质性，不同来源的MSCs在形态上可能存在一定差异。
除了形态特征，骨髓间充质干细胞还具有一系列特殊的表面标记。
常用的MSCs标记物包括CD73、CD90、CD105等阳性标记物，同时不表达CD34、CD45等造血细胞特异性标记物。
这些表面标记物的存在使得我们能够准确鉴定和纯化MSCs。
骨髓间充质干细胞的形态特征与其多向分化潜能密切相关。
MSCs具有分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等多种细胞类型的能力。
在细胞分化过程中，MSCs的形态也会发生相应变化。
例如，当MSCs分化为成骨细胞时，细胞会逐渐变得扁平，细胞质中的线粒体和内质网会增多，同时核内的核仁数量也会增加。
骨髓间充质干细胞的形态也受到环境因素的影响。
一些研究表明，细胞培养基的成分和机械力刺激等因素都能够改变MSCs的形态和功能。
例如，细胞培养基中的生长因子和细胞外基质成分可以影响MSCs的形态和增殖能力。
此外，机械力刺激也能够影响MSCs的形态和分化潜能。
因此，在进行MSCs的培养和应用时，我们需要考虑这些因素对细胞形态的影响。
总结起来，骨髓间充质干细胞具有特殊的形态特征，包括细胞形状、细胞质和细胞核结构等方面的特点。
这些形态特征与MSCs的多向分化潜能密切相关，同时也受到环境因素的影响。
2023全球间充质干细胞治疗的现状与未来｛全文）间充质干细胞（Mesenchymal Stem/ Strama Cells , MSCs）真高广泛地治疗炎症和退行性疾病的潜力。
间充质干细胞己从人类许多真他来源组织中分离和鉴定出来，广泛分布于几乎所高组织（包括胎儿和成人），例如骨髓、血液、脐带、脐血、胎盘、脂肪、羊膜、羊水、牙髓、皮肤、经血等等。
除了天然存在的间充质干细胞，科学家们还利用多能干细胞还分化出了间充质干细胞〈胚胎干细胞和诱导多能干细胞来源的闻充质干细胞已经在国内获批IND，并且分别进入临床试验阶段〉。
01间充质干细胞疗法的兴起1976年，Freidenstein等首次发现在骨髓里存在一君润E造血的骨髓墓质细胞，呈克隆性贴壁生长，形态和成纤维细胞相似。
由于这些细胞真再多能性，可以分化为中胚层组织，如肌肉、肌腥、韧带及脂肪组织等。
1988年，Freidenstein和Owen将真命名为”骨髓墓质干细胞工1992年，美国生物学家Arnold Caplan教搜进一步把这类细胞命名为1司充质干细胞’’。
1995年，人类第一次使用间充质干细胞治疗疾病。
1995年，Arnold Caplan教授从恶性血液病患者骨髓分离培养出贴壁的基质细胞，然后输注到患者体内，观察｜｜伍床效果并验证真安全性。
从此，开启了第一例间充质干细胞的临床应用。
后来，Arnold Caplan教授成了全球第一家闻充质干细胞公司一一大名鼎鼎的Osiris Therapeutics公司的创始人。
Osiris Therapeutics公司开发的间充质干细胞注射液( Prochymal ）于2012年在加拿大有条件获批，作为药昂上市，用于儿童移植物抗宿主病（GVHD）的治疗。
最初，间充质干细胞的治疗潜力被认为是可以可以迁移到受损组织、进行体内分化苔换受损或死亡细胞。
遗憾的是，间充质干细胞体内分化尚未得到证实，科学家发现真仅仅可以在体外分化。
间充质干细胞通过大动脉内皮细胞时表现稳定的粘合性，表面分布不均、分散性及跨迁移的特征即；趋化因子与切力效应作者：Giselle Chamberlain, Helen Smith, G. Ed Rainger, Jim Middleton 摘要间充质干细胞具有抗炎症，抑制免疫力的性质，或许在如动脉硬化这样的疾病治疗中发挥作用。
间充质干细胞能够进入炎症细胞，然而为了在临床上运用，人们需要阐明他们迁移机制。
本研究探究了鼠类间充质干细胞与其迁移到小鼠动脉内皮细胞的相互关系，以及趋化因子，剪切压力的效应。
通过生理流动条件实验研究鼠类间充质干细胞与MAEC 的相互作用，鼠类间充质干细胞在连续流动条件下没有表现出相互作用。
然而，当流动停止十分钟，再开始，鼠类间充质干细胞慢慢的附着在内皮细胞表面，延展成良好的微绒毛过程（丝足）。
然后他们以不同方向散布在伸展的丝足。
CXCL9显著提高了鼠类间充质干细胞的附着、表面非均匀分散及扩散的比例，剪切压力明显刺激了后两者。
间充质干细胞通过鼠类动脉内皮细胞过程中，CXCL9, CXCL16, CCL20 和CCL25 明显增强了跨内皮迁移。
小鼠间充质干细胞的跨迁移抑制受体CXCR3，CXCR6, CCR6 和CCR9. 本研究促进了对间充质干细胞内皮跨迁移，趋化因子、剪切压力的效应的了解，这与如动脉硬化的炎症息息相关。
介绍间充质干细胞分化成许多不同的细胞谱系的能力，如同他们抗炎及免疫方面的特征，都没有伦理上的争议；培养相对容易使得间充质干细胞在许多炎症与损伤的治疗中成为一种理想的干细胞来源[1]。
间充质干细胞能够在动脉硬化的抗炎治疗中发挥作用，有报道用培养的间充质干细胞治疗心肌梗塞[2–4]；同样，在像中风，脊椎损伤[5,6]、脑脊髓炎[7]、辐射损伤[8]、皮肤损伤[9]和移植物抗宿主疾病情况[10]，间充质干细胞发挥潜在作用。
虽然在治疗像非愈合骨折这样的特点疾病下[11]，间充质干细胞定向移动发挥作用，但是它也与间充质干细胞周身侵泡配合问题有关，如钙化与组织损伤[12]。
周身移动带动多向移动，而且可能比定向传递更少发生侵略性的过程。
为了通过周身递送直接治疗动脉硬化，间充质干细胞需要横穿动脉内皮进入组织发挥抗炎效应，然而通过这样途径间充质干细胞迁移、移植并不非常有效[13]，还需要了解间充质干细胞从血液到组织是怎样迁移的，以至于这样的补充过程能够减少炎症的发生与增强组织修复。
我们已经非常了解多层附着的白血球及这些细胞是如何从循环中迁移到炎症组织中的[14,15]。
白血球在细胞内皮表面进行一系列相互作用，如结合，旋转，激活，捕捉，传递，蠕动，接着进行跨内皮迁移。
然而，我们不知道间充质干细胞是否与内皮细胞发生相似的作用，也不知道哪些因子调控跨内皮迁移。
除此之外，间充质干细胞与内皮细胞相互作用在循环中产生生理作用即流体剪切压力需要得以解决，因为这队白血球非常重要[16].趋化因子受体与配体是重要的组分涉及在白血球细胞移动到炎症位点，最近我们阐明了在标准Boyden-type 小室中，用去掉内皮细胞后，鼠类间充质干细胞上不同趋化因子受体的功能表达。
我们和其他人报道了[17–22]在人类间充质干细胞中趋化因子受体表达，其中与一些鼠类相同（如CXCR3,CXCR6 和CCR9因子）。
我们了解有许多白血球附着分子参与细胞横穿内皮组织的迁移过程，有报道其中一些在间充质干细胞上表达[23,24]。
对间充质干细胞附着内皮组织产生重要功能的附着分子对群有CD44, VCAM-1及其相反配基VLA-4和其他b1结合蛋白[25–28]。
然而，人们很少了解间充质干细胞内皮反向迁移的机制与趋化因子在驱动这种机制上的作用。
最近有两个研究实验探究了在体外静态条件，通过内皮细胞与间充质干细胞的共培养下跨内皮迁移过程[27,29]。
他们都发现当内皮细胞被炎症细胞因子刺激，间充质干细胞表现了形态学的变化及与内皮单层细胞结合。
他们也发现间充质干细通过原生质突起进入内皮细胞，分泌MMP-2（基质金属蛋白酶）,它是一种促进造血干细胞运输的基底膜上退化膜酶[30]。
现在研究的目标致力于研究鼠类间充质干细胞附着于鼠类大动脉内皮细胞的趋化因子效应与剪切力效应。
第一次发现与内皮细胞接触时间充质干细胞扩散蠕动，并在趋化因子刺激与剪切力作用下，得以增强。
趋化因子也促进鼠类间充质干细胞横穿大动脉内皮细胞的跨内皮迁移，这将下调被迁移的趋化因子受体细胞。
我们先前提到了小鼠间充质干细胞表达存在于人间充质干细胞一些相同的趋化因子受体。
[17],因此进一步研究选择性趋化因子受体的作用，这些小鼠间充质干细胞可成为在动脉硬化与心肌梗塞体内模型中一种有用的模型。
方法:分离与扩培养小鼠间充质干细胞小鼠间充质干细胞从6-10周大小的小鼠获得，按照相关文献方法分离[17,31] ,这种符合伦理学方法来自英国欧斯威特的RJAH医院。
简单来说，骨髓来自长骨中，细胞来自细胞分离培养基(RPMI-1640 (英国龙沙公司) ，培养基中含有9%FBS，9%血清（两者皆来自英国杰生公司）并在37℃，5% CO2.。
在24小时后没有附着的细胞被去除，四周后，细胞在含有9%FBS，9%马血清的完全扩大培养基(CEM) (Iscove Modified Dulbecco Medium(Lonza)以每平方厘米一百细胞涂布来扩增间充质干细胞。
这些细胞对CD105具有95%的活性，而对CD45和CD34完全失效[17].当在成骨或脂质培养基生长时，分别对碱性磷酸酶与胞内脂质产生活性[17]。
小鼠内皮细胞的培养小鼠动脉内皮细胞株来自日本鹤见牙医大学Hiroko Inoue博士的馈赠。
此细胞株以缺失p53的小鼠动脉上获得的[32]。
细胞株拥有内皮细胞的表型，微贝尔-帕拉德小体，内皮组织标记和粘合分子。
此外，TNFa促进淋巴细胞附着在小鼠动脉内皮组织上，以此提供了在体外研究炎症与白细胞迁移的模型。
在199培养基(英国sigama公司) 37℃，5% CO2培养生长细胞，培养基中含有5%FBS，1U/ml肝素纳和5ng/ml小鼠VEGF （派普泰克公司）。
培养基每3-4天更换一次。
从LGC公司的Promochem (ATCC)(英国物理研究所) 购买了脑内皮细胞株，并起先从BALB/c系小鼠脑部内皮瘤分离得到[33,34]。
通过观察凝血因子的表达与摄取的荧光标记的低密度脂肪确定该细胞的内皮性质。
内皮细胞表达的其他分子也通过像CAM-1 and VCAM-1这样的细胞稳定表达，或者受到肿瘤坏死因子或脂多糖刺激而减少。
比如E-选择蛋白与P-选择蛋白生长在添加有抗体与10%FBS的DMEM 培养基上(Lonza)流动估测小鼠动脉内皮细胞接种在Ibidi 载玻片(Wolf laboratories,Pocklington, UK)，生长聚集，在37℃，用100 ng/ml 的小鼠TNF因子刺激16个小时。
然后用基质清洗；用100 ng/ml 小鼠CXCL9(MIG) 处理30分钟(Peprotech)（此步骤选作）。
在37℃注射器泵以一定的速率吸取载玻片液体以进行流量分析，同时通过相对的显微镜观察可以见到载玻片中细胞[35]。
在没有血清的培养基上小鼠间充质干细胞以(1*106/ml) ，0.1Pa，4分钟灌注微管中，然后用基质以同样的流速清洗15分钟。
记录影像过程分析间充质干细胞的行为。
小鼠间充质干细胞也以4*106/ml添加到微管中，然后无血清的培养基以0.1pa进行2小时的灌注。
自始至终每15秒拍摄照片来检查间充质干细胞与内皮组织的相互作用。
跨内皮趋化性试验具有8mm孔径滤膜器涂有来自Sigma公司的人类质粒的纤练蛋白(4 ug/ml in PBS) ，转移至24槽平板用sigmacote处理，以避免附着迁移的细胞。
将近4*105小鼠动脉内皮细胞将接种在每一个半透膜过滤网上，以100%聚集两天，再用无血清基质上的小鼠TNFa 因子在37℃培养4小时来激活该细胞。
留下三个没有刺激的样作为对照。
用含有8 mm Calcein-AM (Molecular Probes, Invitrogen)的pBS在37℃培养30分钟可获得小鼠间充质干细胞。
同时，含有（或无）小鼠CXCL9 (MIG), CCL20 (MIP3a), CCL25 (TECK) 和CXCL16 (Peprotech)培养基以不同的比例添加到具有24孔的平板上的滤膜器，每种条件做三次重复。
600,000 小鼠间充质干细胞添加到每一个滤膜器的上层37℃在无血清培养基悬浮，平板放置在37℃，5% CO2 和90% 湿度过夜16小时培养。
已经迁移至底层的小鼠间充质干细胞的数目用FLX800微板荧光阅读器(Bio-tek Instruments Ltd, Potton, UK)（本设备已建立荧光与细胞数比例的标准曲线）来计算。
所使用的每一个趋化因子数目是10 ng/ml。
这是基于先前所作的实验(0–1000 ng/ml) 即在Boyden-type趋化性评估中使用同样小鼠间充质干细胞[17]。
结果显示特别能刺激间充质干细胞迁移的最有效浓度是10 ng/ml 或100 ng/ml；低于10 ng/ml或高于500 ng/ml 的趋化因子不能刺激迁移[17]。
因此，在目前跨内皮迁移实验中使用10ng/ml和100ng/ml 的趋化因子，发现前者浓度对刺激间充质干细胞效果明显而后者产生重要结果。
液式细胞计检查来自跨内皮趋药实验或从含有胰蛋白酶与EDTA的烧瓶中分离得到的间充质干细胞在4℃在PBS与2%BSA的缓冲液中重悬60分钟。
缓冲液中含有10%的血清来阻止非特异结合。
通过台盼蓝鉴定到细胞具有超过95%的活性。
用饱和合适的含有第一抗体的缓冲液的间充质干细胞在冰上放置30分钟培养，清洗。
再用合适的第二抗体进行染色。
放置冰上30分钟后清洗；最后用链霉亲和素与聚乙烯共轭标记染色30分钟[17]。
作为阴性对照，细胞也可用相同类型免疫球蛋白替代先前的抗体进行染色，同上文所述第二抗体与链霉亲和素相同。
抗体有抗鼠CCR6,CCR9，CXCR3，CXCR6因子，小鼠IgG2a和IgG2b 阴性对照，(英国阿宾顿的安迪生物公司) ；生物素化的抗鼠免疫球蛋白和链霉亲和素与聚乙烯共轭物（来自英国牛津的BD Pharmingen公司）。
在跨内皮趋化因子实验中，间充质干细胞对每个趋化因子受体活性百分比由在FITC/FL1 通路中钙黄绿素标记细胞所决定，这种控制也用于在免疫球蛋白对照后平均荧光强度。
统计为了了解小鼠间充质干细胞在在趋化因子存在下跨内皮迁移在机制，我们使用方差分析，方差分析用一系列合适数据对比，用Dunnett测评来作为对照。
