荧光分析法

关系：
E h
式中:
hc

p
h

h——普朗克常数，等于6.626×10-34 J· s; c——光速，等于2.998× 1010cm/s.
在光致激发和去激发光中，价电子可以处在不同的自选状态，
常用电子自旋状态的多重性来描述。 一个所有电子自旋都配对的分子的电子态称为单重态，用S表示， 基态为单重态的分子具有最低电子能，用S0 表示如果电子在跃 迁过程中改变了自旋方向，使分子具有两个自旋平行的电子， 这样的电子态称为三重态，用T表示
3.温度的影响
荧光强度对温度较敏感，因此荧光分析一定要严格控制温度。
温度升高，绝大多数荧光物质的荧光效率降低，荧光强度减低。 因为温度升高，激发态分子与溶剂分子的碰撞频率增大，增加 了外转移的非辐射过程，导致溶液荧光强度降低，因此，可通 过降低温度的方法提高荧光效率和荧光强度。
4.溶液pH的影响
荧光分析法可采用足够强的光源和高灵敏度的检测放大系统，从而 获得比可见光吸光度法高的多的灵敏度。
影响荧光强度的因素
1.溶剂的影响
而增强。
• 荧光峰的波长随溶剂的介电常数增大而增大，强度随极性的增大
• 2.溶液粘度的影响
• 荧光强度随着介质粘度的升高而增强，这是由于介质粘度增强，
减少了分子碰撞，从而减少了能量损失的结果
激发单色器 光源 样品池 垂直
指示器· 放大器 记录器
发 射 单 色 器 检测器
国产970CRT型荧光分光光度计
1.激发光源
荧光测量中所用的光源一般比紫外-可见分光光度计所使用的光
源发光强度大，激发光源通常采用发射强度高的汞弧灯、氢灯
或氙弧灯。氙弧灯产生强烈的连续辐射，其波长范围在
220~700nm之间。
激发三重态：分子吸收能 量，电子自旋不再配对， 为三重态，称为激发三 重态，以T1，T2….表示。
基态：电子自旋配对， 多重度=2s+1=1，为单 重态，以S0表示。
• 荧光效率（fluorescence efficiency):指激发态分子发射荧光的分子 数与基态分子吸收激发光的光子数之比，常用 f 表示
1.基本概念
当某些物质分子被光照射时，会吸收某些波长的光，然后再发
射出波长更长的光，当照射光停止时，发射光也随之消失，这 种光致发射光叫做荧光。 荧光分析法就是利用荧光物质分子所发射的荧光的特性和强度 来进行定性定量分析的方法。 分子荧光分析法（molecular fluorescene analysis,MFA）正在 朝着高效、痕量、微观和自动化的方向发展，其灵敏度、准确 度和选择性日益提高，应用范围工业、农业、医药卫生、环保、 刑侦和科学研究领域。
某些虽能产生荧光，但反应速率很慢，荧光微弱，难以测定。
若在某些金属离子的催化作用下，反应将加速进行，利用这种 催化动力学的性质，可以测定金属离子的含量。可以测定铜、 铍、铁、钴、锇、银、金、锌、铅、钛、钒、锰、过氧化氢及 氰离子
有机化合物的分析
1.脂肪族化合物
脂肪族化合物的分子结构简单，本身产生荧光的很少。但许多脂
无机化合物的分析
1.直接荧光法
主要依赖于待测元素与有机试剂组成能发荧光的配合物，通过
检测配合物的荧光强度来测定该元素的含量。较常用荧光法分 析的元素为铍、铝、硼、镓、硒、镁、锌、镉及某些稀土元素
2.间接荧光法
某些阴离子如F-、CN- 等，他们可以从某些不发荧光的金属有机 配合物中夺取金属离子，而释放出发荧光的配位体，从而测定这些 阴离子的含量
分析可采用直接比较法，即将试样与已知物质并列于紫外线下， 根据他们所发出荧光的性质、颜色和强度，来鉴定他们是否含 有同一荧光物质。但由于许多化合物几乎在同一波长下产生光 致发光，所以荧光分析法很少用作定性分析。
目前荧光分析法主要用于对无机和有机化合物的定量分析。
定量分析方法
1.校正曲线法
F

溶液的荧光强度F与该溶液吸收光强度Ia以及物质的荧光效率φ成
正比F=φIa
F (I 0 I )
根据朗伯比耳定律
I0 F垂直
Ia
I
ECl
I I 0 10 ECl
F I 0(1 10 ) I 0(1 e
=2.3φECl ·I0
2.3 ECl
)
ex-1~x
荧光特性中观察到典型的荧光的EEM（a）渗透（0.076毫摩尔G1；肽 含量TS 20.2 g L1）和（b）纳滤透过液在pH 8（0.125毫摩尔G1；肽 含量TS 0.4 g L1）与热处理大豆蛋白水解物。由α和δ确定的荧光区域 分别代表色氨酸和酪氨酸。瑞利光散射（遥感）区域表示的虚线
分子磷光：当受激分子将至S1的最低振动能级后，经系间 窜跃至T1态，并经T1态的最低振动能级回到S0态的各振动 能级所辐射的光称为磷光。磷光的寿命约为10-4~10 s，光 照停止，仍可持续一段时间
三重态能级低于单重态 （Hund规则）
激发单重态：分子吸收能 量，电子自旋仍然配对， 为单重态，称为激发单 重态，以S1，S2…表示
当入射光强度I0和宽度l一定时，则F=K· C
F=K· C

荧光强度F与溶液浓度C 成正比，荧光定量分析的基本依据
结论：荧光强度和溶液浓度呈线性关系，只限于极稀的溶液
(ECl<0.02)。对于较浓溶液，会产生自熄灭现象。
由F=2.3φECl ·I0 可知 ， 由于荧光强度和入射光成正比，因此增加I0 可以提高分析灵敏度。
溶液pH值得改变会明显影响带有酸性或碱性官能团的荧光物质
的荧光强度，因此荧光分析中应严格控制溶液pH值。
NH3+
OHH+
NH2
OHH+
NH-
无荧光
蓝色荧光
无荧光
5.荧光的猝灭
由于荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用，引
起荧光强度降低的现象，称为荧光的猝灭。引起荧光猝灭的物 质称为猝灭剂。荧光物质浓度大时，还经常发生自猝现象
发射荧光的光子数 f 吸收激发光的光子数
f 值在0~1之间。 荧光效率大，表示分子产生的荧光能力越强，
喹啉的荧光强度十分稳定，可作为基准物质，硫酸喹啉 （0.5mol/L）溶液的荧光效率φ=.055
荧光条件
：
1.分子必须有产生电子吸收光谱的特征结构
2.较高的荧光效率。许多物质不产生荧光，就是由于该物质吸光后 的分子荧光效率不高，而将所吸收的能量消耗于与溶剂分子或其他 溶质分子之间，因此无法产生荧光。
肪族化合物与某些有机试剂反应的产物具有荧光性质，此时可测 量荧光化合物的荧光强度进行定量分析。
2.芳香族化合物
芳香族化合物具有共轭不饱和结构，大多能发荧光。可以直接进
行测定。氨基酸、蛋白质、维生素、胺类、甾族化合物（胆固醇、 激素）、药物、毒物、农药以及酶和辅酶等，大多数具有荧光， 可用荧光分析法测定研究其结构和作用机理。在现代分离技术中， 以荧光法作为检测手段，常可以测定这些物质的低微含量。
3荧光猝灭法
有些元素虽不与有机试剂组成会发荧光的配合物，但它们可从
其他会发荧光的金属离子-有机试剂配合物中取代金属离子或有 机试剂，组成更稳定的不发荧光配合物或难溶化合物，而导致 荧光强度降低，由降低的程度测定该元素的含量。该法可以测 定氟、硫、铁、钴、镍、铜、钨、钼、锑、钛等元素和氰离子
4.催化荧光法
E
基态
单重态S
三重态T
当激发态分子返回基态时，如果不伴随发光现象，此过程 称为无辐去激，它包括振动弛豫、内转换、系间窜跃
无辐射跃迁
振动弛豫
内转换
系间窜跃
处于S1或T1态的分子返回S0态时伴随发光 现象的过程称为辐射去激
辐射去激
荧光
磷光
分子荧光：分子从S1态或T1态的分子返回S0态各个振动能级 所发生的辐射光称为荧光，他是相同多重态间的允许跃迁， 其概率大，辐射过程快，一般在10-9~10-6 s内完成，因此也 叫快速荧光或瞬时荧光。
碰撞猝灭 静态猝灭 转入三重态的猝灭 荧光物质的自猝灭
M+hv→M*,M*+Q → M+热 M+Q → MQ 非荧光物质 三重态 荧光物质浓度较高
仪器组成
荧光分析法所使用的仪器叫荧光计（fluorometer）。荧光计又
分为简单的光电荧光光度计和复杂的荧光分光光度计。它们通 常由激发光源、单色器、样品池、检测器和放大显示系统等部 分组成。
举例
利用荧光检测的方法快速检测城市污水对饮用水影响的研究
荧光光谱收集主要采用安捷伦卡里荧光分光光度计（米西索加，加拿大）。 处理厂1样品使用珀金埃尔默ls50b荧光分光光度计分析（Woodbridge，加拿大）。最佳的仪器设置进 行了测定，根据以前的研究和内部测试。激发和发射波长范围分别为250至380纳米（10纳米的增量）， 和250至600纳米（1纳米的增量）。与既定的仪器设置，一个样品的数据采集约13分钟。一旦建立了预 测模型，在线荧光系统的反馈将是有限的样本采集时间。在这种情况下，我们保持了仪器设置，使得样 品迅速获得在15分钟内。
2.基本原理
E0是基态能级，E1是第一电 子激发态能级； V是振动能级 无辐射跃迁不会发光：某些 特定结构（如π-π共轭体系） 的分子，当处于基态能级的 分子吸收了一定频率的光， 便被激发至其电子激发态能 级的某个振动能级，然后通 过相互碰撞或和其他分子 （如溶剂分子）碰撞消耗振 动能级间的能量，急剧降至 第一电子激发态的最低振动 能级
成，形状以正方形、长方形为宜，也有用圆形的
4.检测器
荧光的强度很弱，因此要求检测器有较高的灵敏度。荧光分光 光度计一般采用灵敏度高的光电管或光电倍增管做光电转换元 件，为了消除激发光对荧光测量的干扰，在仪器中，检测光路 与激发光路相互垂直。