医学微生物实验-革兰氏染色法

实验革兰氏染色法实验目的1.1 实验器材1.1.1 菌种金黄色葡萄球16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，枯草芽孢杆菌16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物，大肠杆菌16h牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。

1.1.2 溶液和试剂香柏油，革兰氏染液，草酸铵结晶紫染液，卢戈氏碘液，95%乙醇，番红复染液等。

1.1.3 仪器和其他用品普通光学显微镜，擦镜纸，酒精灯，载玻片，接种环，试管架，滴管等。

2 实验现象与分析2.1 实验步骤2.1.1制片取生长活跃期菌种按常规方法涂片（不宜过厚）、干燥和固定。

2.1.2初染滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色1-2min之后倾去染液，水洗至流出水无色。

2.1.3媒染先用卢戈氏染液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min，倾去碘液，水洗至流出无色。

2.1.4脱色将载玻片上残留水用吸水纸吸去，在白色背景下用95%乙醇脱色(20-30s)，当流出液无色时立即用水洗去乙醇。

2.1.5复染将玻片上残留水用吸水纸洗去，用番红复染液染色2min，水洗，吸去残水，晾干。

2.1.6镜检2.1.6.1观察前的准备(1)安置显微镜.(2)将聚光器调到最高位置,调节光源,使视野内光线均与,亮度适宜.(3)根据使用者的个人情况,调节双筒显微镜的目镜.(4)调节聚光器的数值孔径.2.1.6.2显微观察在低倍镜下找到要观察的样品区域后,用粗调节器将镜筒升高,将油镜转到工作位置,然后在待观察的样品区域滴加香柏油。

从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心的降下，使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接，调节聚光器的数值孔径以及视野的照明强度后，用粗调节器将镜筒镜筒徐徐上升，直至视野中出现物象并用细调节器使其清晰聚焦为止。

2.1.6.3显微镜用后的处理(1)上升镜筒，取下载玻片。

(2)用擦镜纸擦去镜头上的镜油，然后用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜头上的油迹，最后用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。

(3)用擦镜纸清洁其他物镜及目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件。

革兰氏染色法实验报告篇一革兰氏染色法是一种常用的细菌染色方法，可用于鉴定细菌的类型和形态。

以下是一份革兰氏染色法的实验报告范例，包含实验目的、实验原理、实验步骤、实验结果和结论等部分。

实验目的： 1.了解革兰氏染色法的原理和步骤； 2.掌握细菌的革兰氏染色方法； 3.观察细菌在革兰氏染色中的反应，并进行鉴定。

实验原理：革兰氏染色法是根据细菌细胞壁的特性而设计的一种染色方法。

细菌细胞在染色过程中会根据细胞壁的结构不同，分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

革兰氏阳性菌具有较厚的细胞壁，含有较多的革兰氏染色阳性物质（如染色时用的紫檀碱），因此在染色后会呈现紫色。

革兰氏阴性菌细胞壁较薄，不含有革兰氏染色阳性物质，染色时使用的碘酒（革兰氏碘化酒）能使它产生复合革兰氏染色阳性物质（碘靛紫），再用酒精脱色，再用洋红着色，使其产生颜色变化，最终呈现红色。

实验步骤： 1.准备好菌液：选取需检测的菌株，用无菌盘收集少量菌落，用少量生理盐水悬浮，制备菌液。

2.片玻璃片：在清洁无菌玻璃片上滴上一滴菌液。

3.烘干：将玻璃片架起，自然风干。

4.固定：将玻璃片的细菌涂片在火焰上迅速烘烤，使其牢固地附着在玻璃片上。

5.染色：将烘烤后的玻璃片放入紫檀液中，染色1分钟。

6.脱色：用酒精脱色10-30秒。

7.洗净：用自来水清洗片上的超染色剂。

8.再染：将片浸入碘靛紫溶液中，染色1-2分钟。

9.脱色：用酒精脱色10-30秒。

10.洗净：用自来水清洗片上的超染色剂。

11.观察：利用显微镜观察和比较细菌的形态和染色情况。

12.记录：记录细菌的形态、颜色等观察结果。

实验结果：通过观察细菌的形态和颜色，我们可以得出以下结论：•革兰氏阳性菌在染色后呈现紫色；•革兰氏阴性菌在染色后呈现红色。

结论：革兰氏染色法是一种常用的细菌染色方法，通过染色反应可以初步鉴定细菌的类型。

本次实验中，我们成功地使用革兰氏染色法对细菌进行了染色和鉴定，观察到了不同细菌的染色结果，并且将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两类。

简述革兰氏染色方法革兰氏染色方法是一种常用的细菌染色方法，它能够将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两类。

本文将从原理、步骤、应用以及优缺点等方面进行简述。

一、原理革兰氏染色方法是根据细菌细胞壁的化学组成差异而设计的。

细菌细胞壁是由多层薄而紧密的多糖和脂蛋白组成的，其中革兰氏阳性菌的细胞壁含有大量的胞内酶和胞外酶，而革兰氏阴性菌的细胞壁则较薄，胞内酶和胞外酶含量较少。

二、步骤1. 准备细菌涂片：将待染菌液滴于玻璃片上，用铅笔或曲别针将菌液均匀地涂开，然后用火焰烘烤片面，使其固定。

2. 染色：将涂片放在染色架上，先用蔗糖水浸润片面，然后滴加革兰氏紫液，静置1分钟。

3. 洗涤：用自来水冲洗片面，直到洗涤液无色透明为止。

4. 酒精分解：滴加碘酒，静置1分钟，使细菌细胞壁与染色剂形成络合物。

5. 洗涤：用95%乙醇冲洗片面，直到洗涤液无色透明为止。

6. 染色：滴加伊红，静置1分钟，使细菌细胞壁和胞质染成红色。

7. 洗涤：用自来水冲洗片面，直到洗涤液无色透明为止。

8. 干燥：将片面用吹风机吹干，然后用显微镜观察。

三、应用革兰氏染色方法广泛应用于细菌学和临床微生物学领域。

通过革兰氏染色，可以快速区分细菌的类型，对于细菌感染的诊断和治疗具有重要意义。

革兰氏阳性菌常见于致病菌中，如葡萄球菌、链球菌等；而革兰氏阴性菌常见于肠道菌群中，如大肠杆菌、沙门氏菌等。

四、优缺点1. 优点：革兰氏染色方法操作简单、快速，可以在短时间内对细菌进行初步分类。

此外，染色结果直观明确，易于观察和分析。

2. 缺点：革兰氏染色方法对于某些细菌可能存在染色困难或染色效果不明显的情况，这可能会导致结果的不准确。

另外，染色后的细菌仅能观察细胞形态和分布情况，无法提供更详细的细胞结构信息。

总结：革兰氏染色方法是一种简单、快速的细菌染色方法，通过染色结果可以将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两类。

该方法在细菌学和临床微生物学中有着广泛的应用，对于细菌感染的诊断和治疗具有重要意义。

简述革兰染色法的操作步骤革兰氏染色法：也称革兰氏阴性染色法。

属于活细胞染色法，也是初中阶段接触的细菌学基本技术之一。

此法特别适合观察病毒的形态，故常作为临床微生物实验中重要的染色方法。

简述革兰氏染色法的操作步骤一般方法如下：(1)检查试管，将所需的培养基配制好并检查是否均匀。

(2)液体试剂的制备：取无菌的结晶紫注射液0。

5ml，精氨酸0。

5ml， 0。

01%升汞液2。

5ml，蒸馏水150ml混匀后再加蒸馏水至1000ml。

(3)固体试剂的制备：取无菌的结晶紫指示液0。

5ml，精氨酸0。

5ml，蒸馏水50ml混匀后再加蒸馏水至1000ml。

(4)稀释：在试管内分别加入精氨酸0。

5ml，无菌水20ml，再加蒸馏水至9ml，摇匀，用结晶紫指示液染色20分钟，并随时注意结晶紫是否变蓝，必要时可轻轻摇动或加热。

(5)加生理盐水到标线内，使高度恰好达到培养基中最低部位。

(6)加培养液：吸取配制好的液体培养基分别滴到三个试管中，每个试管各加入100μl的纯化蛋白胨培养基，即为含无菌牛血清的生理盐水，分别置于37 ℃温箱中保存备用。

(1)检查试管，吸出液体试剂，吸干，检查。

(2)准确量取需用量(或先倒在烧杯中，再用量筒量)，检查药液浓度。

(3)用酒精灯火焰点燃试管内的培养基，分别在每管中加入1。

0ml培养基，将试管放回37 ℃温箱中培养。

(4)观察并记录细菌生长情况。

第一，培养时间应足够，以获得足够的细菌数量；第二，以提高对细菌生长曲线的观察能力；第三，缩短细菌培养时间有利于分离、纯化细菌。

(5)取出试管，观察染色的结果。

如果菌落周围染色较浅，表明染料被细菌分泌物包绕，菌体呈现模糊状态；反之，菌落周围染色较深，则表明细菌染色质集中，结构明显。

①加生理盐水到标线内，使高度恰好达到培养基中最低部位。

②加培养液：吸取配制好的液体培养基分别滴到三个试管中，每个试管各加入100μl的纯化蛋白胨培养基，即为含无菌牛血清的生理盐水，分别置于37 ℃温箱中保存备用。

革兰氏染色法的过程及原理革兰氏染色法是一种用于细菌分类和鉴定的重要染色方法。

该方法由丹麦细菌学家克里斯汀·革兰发现并发展起来，于1884年首次发布。

革兰氏染色法能够将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类，具有重要的临床和实验室应用价值。

染色：将待检测的细菌接种于玻璃片上，用火焰烘烤杀灭细菌并固定在玻璃片上。

接着，将玻璃片放入甲醇中，用火焰加热将甲醇蒸发。

然后，将玻璃片浸泡在革兰之前的染色液中，染色液由紫色的亚甲基紫和碘化钾组成。

这一步骤的目的是通过紫色染料使细菌固定在玻璃片上。

洗涤：将玻璃片放入碘化钾溶液中洗涤。

碘化钾能与细菌细胞壁上的一些成分形成复合物，使细菌呈现蓝色。

固定：将玻璃片放入醇中洗涤。

醇有助于将紫色染料从革兰阴性菌的细胞壁中洗去。

显微观察：将玻璃片放入显微镜下观察。

在显微镜下，革兰阳性菌呈现紫色，而革兰阴性菌呈现红色。

根据这一特征，可以进行细菌的初步分类和鉴定。

革兰氏染色的原理是基于细菌细胞壁的差异。

革兰氏阳性菌具有较厚的细菌细胞壁，由于其壁中含有较多的肽聚糖和穿过壁的肽聚糖横向支链，革兰阳性菌在染色过程中能够较好地固定紫色染料，显示为紫色。

而革兰氏阴性菌则具有较薄的细菌细胞壁，壁中的肽聚糖和肽聚糖支链较少，使得革兰阴性菌无法固定紫色染料，而显示为红色。

革兰氏染色法的原理还与染色液中紫色染料的结构有关。

紫色染料中的亚甲基紫分子带有正电荷，而革兰阳性菌细胞壁中的较多的负电荷物质使其对亚甲基紫具有亲和力，从而固定了紫色染料。

而革兰阴性菌细胞壁中的负电荷物质相对较少，因此无法固定紫色染料，而被酒精洗去，再经过后续的红色染料染色，显示为红色。

然而，革兰氏染色法也存在一些局限性，比如一些细菌可能失去一些特性，导致染色结果不准确。

此外，一些细菌在真菌的单位时间染色效果不佳，也需要进行其他进一步的鉴定方法。

因此，在细菌分类和鉴定中，革兰氏染色法常常与其他染色方法和生化试验相结合使用，以提高鉴定的准确性和可靠性。

用革兰氏染色实验报告引言革兰氏染色是微生物学中常用的染色方法之一，它是由丹麦微生物学家克里斯蒂安·格拉姆（Christian Gram）于1884年首次提出的。

革兰氏染色方法能够将细菌区分为革兰阳性和革兰阴性两类，对细菌的鉴定和分类具有重要意义。

本实验旨在通过革兰氏染色方法，观察和鉴定所需细菌的性质。

材料与方法实验材料- 细菌培养物- 牛津线- 凝聚试剂（碘酒）- 乙醇- 结晶紫染液- 茚-甲醛染液- 脱色液（95%乙醇）- 尼格拉试剂实验步骤1. 取适量的细菌培养物，均匀涂布在玻片上。

2. 用针刺取一根牛津线，先蘸取结晶紫染液，在涂片上涂抹20-30秒。

3. 用蒸馏水轻轻冲洗，使多余的染色剂流走。

4. 再用乙醇逐滴滴在涂片上，持续滴加直到滴下的乙醇不再显色。

5. 再次用蒸馏水洗涤。

6. 接下来用茚-甲醛染液涂抹涂片，静置5分钟。

7. 用蒸馏水轻轻冲洗。

8. 用脱色液（95%乙醇）滴在涂片上，直到涂片待比较清晰为止。

9. 再用蒸馏水洗涤。

10. 用尼格拉试剂滴于涂片上，观察显色情况。

结果与分析通过以上步骤我们得到了染色后的涂片。

观察涂片后的颜色变化，我们可以将细菌划分为革兰阳性和革兰阴性两类。

- 革兰阳性细菌：这类细菌在革兰氏染色后，呈现紫色或紫蓝色。

这是由于细菌细胞壁较厚，染色剂容易进入细胞内部，形成结晶紫复合物，并且乙醇处理后不易脱去。

常见的革兰阳性细菌有葡萄球菌、链球菌等。

- 革兰阴性细菌：这类细菌在革兰氏染色后，呈现粉红色。

这是由于细菌细胞壁较薄，染色剂容易逸出，不能在乙醇处理中保持染色。

常见的革兰阴性细菌有大肠杆菌、沙门菌等。

实验中遇到的问题及解决方法在实验过程中，我们遇到了染色不均匀、显色较弱等问题。

我们通过以下方法解决了这些问题：1. 涂布时要均匀：将细菌涂布在玻片上时，要注意用均匀的手法涂布，尽量避免涂布过厚或者过稀。

2. 染色时间要掌握好：染色液在涂片上的时间过长，会导致染色剂过多，出现混淆；染色液在涂片上的时间过短，会导致染色剂进入细胞内不充分，显色较弱。

革兰氏染色法实验报告革兰氏染色法实验报告引言：革兰氏染色法是微生物学中常用的染色方法之一，它可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。

本实验旨在通过革兰氏染色法的应用，观察不同菌落的染色效果，进一步了解细菌的结构和分类。

实验材料与方法：1. 实验菌株：选择了两种细菌，分别为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

2. 培养基：使用了含有足够营养物质的琼脂培养基。

3. 革兰氏染色试剂：包括结晶紫、碘酒和乙醇。

4. 实验器材：无菌培养皿、移液管、显微镜等。

实验步骤：1. 在无菌培养皿上分别接种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，并在恰当的温度下培养。

2. 将培养皿中的菌落取出，用无菌移液管加入适量的生理盐水，悬浮菌落。

3. 取一滴悬浮的菌液，滴于载玻片上，用火焰消毒玻片。

4. 将滴有菌液的玻片放在炉子中，用火焰烘烤至完全干燥。

5. 滴加结晶紫染色液，静置片面染色1分钟。

6. 用自来水冲洗玻片，直至水洗净。

7. 滴加碘酒，静置片面染色1分钟。

8. 用自来水冲洗玻片，直至水洗净。

9. 滴加乙醇，静置片面脱色30秒。

10. 用自来水冲洗玻片，直至水洗净。

11. 用吸水纸轻轻吸干玻片上的水分。

12. 将玻片放在显微镜下，观察菌落的染色效果。

实验结果与讨论：在显微镜下观察，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

这是因为在革兰氏染色法中，结晶紫染色液可以渗透进细菌细胞的胞质，使细菌呈紫色。

而碘酒可以形成结晶紫-碘复合物，使细菌细胞内的染色物质更稳定，不易被乙醇脱色。

乙醇的作用是脱去细菌细胞外的结晶紫，但革兰氏阳性菌由于细胞壁较厚，结晶紫不易脱色，因此呈紫色；而革兰氏阴性菌由于细胞壁较薄，结晶紫易被脱色，因此呈红色。

通过实验可以发现，革兰氏染色法是一种简单而有效的方法，可以快速区分细菌的类型。

革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在细胞结构上有所不同，革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，含有较多的胞质，而革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，胞质较少。

这种区别导致了革兰氏染色法的染色效果不同。

革兰氏染色法的原理革兰氏染色法是一种微生物学常用的染色方法，主要用于检测细菌的结构和特性。

它是由丹麦细菌学家克里斯蒂安·格拉姆（Christian Gram）于1884年发明的。

革兰氏染色法可以把细菌分成两种类型：革兰氏阳性和革兰氏阴性。

其中，革兰氏阳性细菌染色后呈紫色或深蓝色，而革兰氏阴性细菌染色后则呈红色或粉色。

这两种细菌的差异在于其细胞结构和化学成分的不同。

革兰氏染色法是通过染色剂与细菌细胞壁之间的相互作用来实现的。

整个染色过程可以分为四个步骤：脱脂、染色、酒精洗和次染色。

下面我们分别来看一下每个步骤的具体原理。

步骤一：脱脂在这个步骤中，一些挥发性脱脂剂例如乙醚、丙酮等被用来去除细菌表面的脂肪酸和脂类物质。

这使得染色剂能够更容易地渗透进入细胞壁和胞质，从而更好地染色。

同时，这个步骤也可以使得革兰氏阴性菌表面的脂膜被去掉，暴露出细胞壁，便于下一步染色。

步骤二：染色此步骤是革兰氏染色的关键步骤。

常用的染色剂是结晶紫，它是一种碱性染料，会与革兰氏阳性菌细胞壁上的多聚糖染色。

染色剂被涂到细菌表面上，紫色染料会渗透进入细胞壁和细胞质，使得细胞全部变为紫色。

这个步骤中染色剂可以明显区分革兰氏阴性和阳性菌，因为革兰氏阴性菌在这里不会被染成紫色。

步骤三：酒精洗这个步骤叫做脱色，因为它涉及到去除紫色染料。

酒精被用来冲洗已经染过色的细菌，去除革兰氏阴性菌细胞壁上的颗粒状物质（如唾液酸），以及脱掉染色剂丝状外露的部分，从而使得染色剂从细胞壁中漏出来。

此时，革兰氏阳性菌细胞的细胞壁关键成分――胞外十字连的多聚糖，比革兰氏阴性菌细胞壁的成分――薄层的类脂和多糖要厚，它们锁住染色剂，使颜色不易溶解，成为定色基团，从而不受脱色的影响并保持紫色。

步骤四：次染色次染色是将革兰氏阴性菌染色为红色或粉色的步骤。

主要采用舒尔茨墨汁或法斯丹染料。

这些染色剂是酸性染料，只会沉淀附着在革兰氏阴性菌的细胞壁上。

当染色剂沉积时，革兰氏阳性菌仍然保持紫色，而革兰氏阴性菌则变成了红色。

革兰氏染色法的原理和步骤革兰氏染色法是一种常用的细菌染色方法，它可以将细菌区分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

这种染色方法是由丹麦微生物学家Christian Gram于1884年首次提出的。

革兰氏染色法的原理是利用细菌细胞壁的特性来区分不同类型的细菌。

细菌细胞壁的主要成分是多聚糖和肽聚糖，革兰氏氏染色法通过不同的处理步骤，使得细菌细胞壁的特性在染色过程中显现出来。

革兰氏染色法的步骤如下：1. 准备细菌涂片：首先，从培养基中取一小块细菌培养物，涂抹在玻璃片上，形成细菌涂片。

2. 固定：将细菌涂片在空气中晾干，然后用火焰快速烘烤，使细菌固定在玻璃片上。

3. 染色：将固定的细菌涂片放入革兰染色液中浸泡几分钟。

革兰染色液主要由紫晶染料和碘酒组成。

紫晶染料可以渗透进入细菌细胞壁，而碘酒可以固定染色物质。

浸泡时间过长会导致革兰氏阳性菌染色过度。

4. 洗涤：用蒸馏水冲洗细菌涂片，以去除多余的染色剂。

5. 差染：将细菌涂片放入酒精-醋酸溶液中浸泡几秒钟，然后用蒸馏水冲洗。

这一步是为了除去革兰氏阴性菌表面的染色剂。

6. 洗涤：再次用蒸馏水冲洗细菌涂片。

7. 对比染色：将细菌涂片放入苏木精染色液中浸泡几分钟。

苏木精染色液会将革兰氏阴性菌染成红色。

8. 洗涤：用蒸馏水冲洗细菌涂片。

9. 干燥：将细菌涂片放入通风处晾干。

通过上述步骤，革兰氏染色法可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

革兰氏阳性菌在染色后呈紫色，而革兰氏阴性菌在染色后呈红色。

革兰氏染色法的原理基于细菌细胞壁的差异。

细菌细胞壁是由多聚糖和肽聚糖组成的。

革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，含有大量的多聚糖和肽聚糖，而革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，含有较少的多聚糖和肽聚糖。

在染色过程中，革兰染色液中的紫晶染料可以渗透进入细菌细胞壁，并与细菌细胞内的多聚糖和肽聚糖结合，使革兰氏阳性菌呈紫色。

而革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，紫晶染料不能渗透进去，因此在差染过程中被苏木精染色液染成红色。

实验四革兰氏染色法实验教学课题：实验四革兰氏染色法实验教学目的：1学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的革兰氏染色。

2了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。

实验教学重点：细菌革兰氏染色原理和步骤。

实验教学难点：酒精洗脱时间。

实验用品：1大肠杆菌24h的斜面培养物。

2 乳酸菌24h的斜面培养物。

3 简单染色液（美蓝染色液、黑色素液或炭素墨水）4 革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸复红）5 载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。

6 显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。

实验教学方法与手段：板书讲解+演示实验＋学生动手实验教学课时：4课时教学过程：一、实验原理1 简单染色的原理大多数微生物细胞质是带负电荷，简单染色时采用已知的、带正电荷的碱性染料。

染料适用于热固定的涂片，染料与菌体细胞质黏附使菌体着色。

经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明对比。

2 革兰氏染色的原理革兰氏阳性菌的细胞壁主要有肽聚糖形成的网状结构组成，在染色过程中，当用95%乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，细胞壁的通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞壁内而不易脱色，因此呈蓝紫色。

革兰氏阴性菌的细胞壁中肽聚糖含量低，脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物容易被乙醇抽提出来而脱色，然后又被染上了复染剂的颜色，因此呈现红色。

二、实验方法和步骤1、简单染色(1) 涂片:取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作分别挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌于二载玻片的水滴中（每一种菌制一片），调匀并涂成薄膜。

注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。

(2) 干燥：自然气干或酒精灯高处微微加热。

(3) 固定:于火焰上通过2—3次。

(4) 染色：在整个涂面上滴加齐氏石炭酸复红，染色１分钟。

（5）水洗：倾去染液，用自来水细流冲洗至流下的水中无染料颜色为止。

Ⅱ、革兰氏染色法一、实验原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C．Gram所创立的。

革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。

革兰氏染色法的主要步骤是先用结晶紫进行初染；再加媒染剂--碘液，以增加染料与细胞间的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成分子量较大的复合物；然后用脱色剂(乙醇或丙酮)脱色；最后用蕃红复染。

凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色(紫色)者为革兰氏阳性菌，如被脱色后又染上复染剂的颜色(红色)者为革兰氏阴性菌。

该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。

G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。

G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

二、实验器材1、菌种牛肉膏琼脂斜面28℃培养24h的大肠杆菌(Escherichia coli)斜面菌种，牛肉膏琼脂斜面28℃培养16h的枯草杆菌(Bacillussubtilis)斜面菌种；2、仪器显微镜；3、材料载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。

4、染料草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液；三、操作步骤1、涂片在一张载玻片上加两滴蒸馏水后，分别涂布枯草芽孢杆菌和大肠杆菌(注意涂片切不可过于浓厚)。

2、固定将制成的涂片干燥固定，固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。

3、染色⑴初染将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度)，染色1-2min。

倾去染色液，用自来水小心地冲洗。

⑵媒染滴加(Lugol)碘液，染1-2min，水洗。

革兰氏染色法的过程及原理
细菌培养：首先，把细菌样本放入一种适合细菌生长的培养基中。

细
菌可以在培养基中繁殖，并在培养基表面形成一个厚厚的菌膜。

︰等待培养、灭菌：然后等待培养。

一般培养4-24小时，直到细菌
厚度达到均匀的状态。

之后，用70％的乙醇或氯仿灭菌。

分离细菌：之后，用称重的方法将培养基向玻片上移动，或者用分离
到新的玻片上，以便后期染色分析。

染色：最后，细菌玻片进行染色。

革兰氏染色分为单色染色和复合染色。

单色染色使用单一物质染色，复合染色使用一种物质的多种染色剂来
染色细菌。

革兰氏染色的原理主要是应用染色剂对细菌的形态特征，如质壁厚度，膜厚度，细菌颗粒形状，胞素和细菌颗粒大小，以及细菌的生理特性，如
环境的Tolerance，抗生素的Tolerance，等给予染色。

染色剂会在细菌
的膜和质壁上积聚，从而形成不同的染色环境，形成细菌的不同形态及染
色特征。