抗黄曲霉毒素B1单链抗体在Sf9昆虫细胞中的表达与性质分析_刘爱平
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AFB1 （ aflatoxin B1，AFB1 ） 可 广 泛 污 染 各 类 农 产 品、食品及动物饲料，对其分析检测极其重要。本研究 在抗 AFB1 scFv2E6VHVL 于 E． coli BL21（ DE3） 表达的 基 础 上，应 用 Bac-to-Bac BEVS 系 统 构 建 抗 AFB1 scFv2E6VHVL 的重组 Bacmid 穿梭载体，并转染 Sf9 细 胞制 备 重 组 病 毒。将 scFv2E6VHVL 在 Sf9 细 胞 中 表 达、纯化，采用 Western blot 和 ELISA 对 scFv2E6VHVL 进行分析，以期为 AFB1 分析检测提供更好的抗体。
中国生物工程杂志 China Biotechnology，2016，36（ 5） ： 40-45 DOI： 10． 13523 / j． cb． 20160506
抗黄曲霉毒素 B1 单链抗体在 Sf9 昆虫细胞中 的表达与性质分析*
刘爱平1，2 李 诚1 刘书亮1 王小红2＊＊ 陈福生2＊＊
（ 1 四川农业大学食品学院 雅安 625014 2 华中农业大学食品学院 武汉 430070）
摘要 目的： 在原核表达抗黄曲霉毒素 B1（ aflatoxin B1，AFB1） 单链抗体（ single chain Fv fragment， scFv） 研究的基础上，为进一步了解和提高抗 AFB1 scFv 的活性，利用 Sf9 昆虫细胞表达抗 AFB1 scFv，并对其活性进行探索研究。方法： 构建 pFastBac 1-scFv2E6VHVL 重组质粒，将重组质粒转化 Escherichia coli （ E． coli） DH10Bac 细胞，进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆。提取相应的重组杆状 病毒穿梭载体 Bacmid 侵染 Sf9 昆虫细胞，表达 scFv，利用镍亲和层析法纯化 scFv，并以 ELISA 检 测 scFv 活性。结果： 蓝白斑筛选后，经菌落 PCＲ 和测序验证挑取的白斑阳性单克隆含有正确的 单链抗体基因。提取相应的重组杆状病毒穿梭载体 Bacmid 侵染 Sf9 昆虫细胞，通过 Western blot 检测得知抗 AFB1 scFv 在 Sf9 昆虫细胞中成功表达。AFB1 对 scFv 的抑制中浓度（ IC50 ） 为 30μg / ml。结论： 与 E． coli BL21（ DE3） 表达系统相比，scFv 灵敏度转好，但仍有较大提升空间。 关键词 AFB1 ELISA Sf9 细胞 scFv 中图分类号 Q511
2016，36（ 5）
Hale Waihona Puke 刘爱平 等： 抗黄曲霉毒素 B1 单链抗体在 Sf9 昆虫细胞中的表达与性质分析
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物有限公司； Easy Taq 酶、Trans2K Plus DNA Marker： 中 国北京全式金生物技术有限公司； Ni-NTA 亲和层析填 料、ECL 显色液： 美国 Thermo 公司； 羊抗小鼠 IgG-HＲP 酶标二抗： 中国华美生物工程公司； 质粒提取试剂盒： 中国 北 京 擎 科 新 业 生 物 技 术 有 限 公 司； PageＲuler Prestained Protein Ladder： 美国 Thermo 公司； DNA 凝胶 回收纯化试剂盒： 中国北京庄盟国际生物基因科技有 限公司。 1． 2 方 法 1． 2． 1 引物设计与目的基因扩增 以课题组保存的 载体 pET-3d scFv2E6VH-linker-2E6V［11］为模板，PCＲ 扩 增 scFv2E6VHVL 基 因 片 段，并 在 目 的 基 因 N 端 加 上 Kozak 序列和信号肽序列。PCＲ 引物由南京金斯瑞生 物科技有限公司合成，序列如下：
将“1． 2． 1”中第三轮 PCＲ 产物以限制性内切核酸酶 BamHI 和 XhoI 进行双酶切，克隆到同样酶切处理的质 粒 pFastBac 1，并转化 E． coli DH5α 细胞。挑取单克隆 进行菌落 PCＲ 验证，选取阳性转化子送至南京金思瑞 生物技术有限公司测序。
1． 2． 3 E． coli DH10Bac 感受态细胞制备 将 E． coli DH10Bac 菌液以 1∶ 250 接种到含 50μg / ml 卡那霉素和 10μg / ml 四环素的 LB 液体培养基，过夜培养后取 20μl 接种于含 50μg / ml 卡那霉素和 10μg / ml 四环素的 5ml 新鲜 LB 液体培养基中，37℃ 振荡培养至 OD600nm 达 0． 5 左右； 将备用的 1． 5ml 离心管和菌液置于冰块中预冷， 吸取 1． 2ml 预冷的菌液至离心管，以 5 000r / min 4℃ 离 心 5min，弃 上 清 液，加 入 800μl 预 冷 的 50mmol / L CaCl2 ，轻轻悬浮并在冰上放置 30min； 于 4℃ 5 000r / min 离心 5min，弃上清液，加 100μl 预冷的 50mmol / L CaCl2 ，轻轻悬浮，加入等体积预冷的 40% 甘油，吹打混 匀后分装，保存在 － 80℃ 。 1． 2． 4 重组杆状病毒穿梭载体 Bacmid 的筛选及鉴定
收稿日期： 2015-11-19 修回日期： 2015-12-13 * 国家自然科学基金（ 31271876） ，中央高校基本科研业务费专项 资金（ 52209-814012） 资助项目 ＊＊通讯作者，电子信箱： wxh@ hzau． edu． cn； chenfs@ hzau． edu． cn
外源 基 因。 BEVS 已 被 广 泛 用 于 生 产 大 量 （ 高 达 1 000mg / ml） 的已适当翻译修饰（ 折叠，二硫键形成、低 聚、糖基化、酰化、蛋白水解裂解） 、具有生物活性的重 组蛋白 。 ［10］
抽提重组质粒 pFastBac 1-scFv2E6VHVL，转化到含有 Bacmid 的感受态 E． coli DH10Bac，而后将适量转化后 的菌液涂布在含有 50μg / ml 卡 那 霉 素、10μg / ml 四 环 素、7μg / ml 庆大霉素、100μg / ml X-Gal （ 5-溴-4-氯-3-吲 哚-β-D-半乳糖苷） 和 40μg / ml IPTG（ 异丙基-β-D-硫代 吡喃半乳糖苷） 的 LB 平板上，37℃ 培养 48h。挑取白色 单菌落，以 Bacmid 上的 M13 引物进行菌落 PCＲ 验证， PCＲ 扩增条件为： 93℃ 预变性 5min，（ 9℃ 变性 30s，55℃ 退火 45s，72℃ 延伸 3min） × 35cycles，72℃ 延伸 10min。 PCＲ 产物经 0． 8% 的琼脂糖凝胶电泳分析。 1． 2． 5 抗 AFB1 scFv2E6VHVL 在 Sf9 细胞的表达与性 质分析
昆虫细胞表达系统是常用的外源蛋白质表达系统 之一［1］，与原核表达系统相比，它能够进行更复杂的翻 译后修饰［2］，表达哺乳动物来源的蛋白质时，更易获得 可溶性蛋白质［3］。昆虫细胞表达系统常用的有果蝇表 达系 统 和 昆 虫 杆 状 病 毒 表 达 载 体 系 统 （ baculovirus expression vector system，BEVS） 。BEVS 能够容纳较大 的外源基因，得到的重组病毒易于筛选，具有完备的翻 译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力 ［4-7］，与 果蝇表达系统相比，其生产周期和便利性更强［8］。
1 材料与方法
1． 1 材 料 AFB1： 瑞 士 Alexis 公 司； 杆 状 病 毒 转 移 质 粒
pFastBac 1、E． coli DH5α、E． coli DH10Bac 和昆虫 Sf9 细胞： 课题组保存； SFM 培养液、Cellfectin 转染试剂： 美 国 Life Technologies 公司； 小牛血清： 中国杭州四季青生
（ 1） 昆虫 Sf9 细胞转染、重组杆粒制备及抗 AFB1 scFv2E6VHVL 预表达测试。将处于对数生长期的 Sf9 细胞悬浮，并以 1． 5 × 106 cell / ml 接种到 6 孔细胞培养 板，27℃ 培养 2h，倒置显微镜下观察 90% 以上细胞已贴 壁，弃去培养液，并用 2ml 不含小牛血清的 SFM 培养液 洗涤两次。抽提“1． 2． 4”中阳性克隆子的重组杆粒，以 两个不同质量的重组 Bacmid 杆粒 DNA 进行细胞转染。 首先分别将 1μg 和 2μg 两个不同量的杆粒 DNA 用不 含小牛血清的 SFM 培养液稀释至 100μl，同时相对应的 转染试剂 Cellfectin（ 分别为 5μl 和 9μl） 稀释至 100μl。 将稀释的 Cellfectin 试剂滴加到稀释的杆粒 DNA，轻轻 吹打混合，室温孵育 15 ～ 30min。加入 0． 8ml 不含小牛 血清的 SFM 培养液，轻轻混匀，将混合物加至含有细胞 的孔中，27℃ 培养 5h，弃去混合物。加入含 5% 小牛血 清的 SFM 培养液，培养至出现明显的病毒感染症状。 收集上清液，以 1 000r / min 离心 5min，分别取上清液， 此即为 P1 代病毒株（ 将 1μg 杆粒 DNA 对应的 P1 代病
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中国生物工程杂志 China Biotechnology
Vol． 36 No． 5 2016
毒命名 为 AP1 ，2μg 的 命 名 为 BP1 ） 。连 续 感 染，获 得 AP2 和 BP2 病毒株，并将收集的 Sf9 细胞和培养上清液 用于预表达测试验证。
采用 Western blot 对 scFv 的预表达情况进行测试 分析。将 Sf9 细 胞 悬 浮 在 上 样 缓 冲 液 中 经 煮 沸 5 ～ 10min 直接上样。对于细胞上清 液，取 1ml，与 经 PBS 缓冲溶液洗涤的 80μl 镍柱亲和层析填料在室温孵育 0． 5h，再经 1ml PBS 缓冲溶液洗涤 3 次，将镍柱亲和层 析填料在 上 样 缓 冲 液 中 经 煮 沸 5 ～ 10min 直 接 上 样。 经 SDS-PAGE 后，转印 PVDF 膜，以 5% 牛奶封阻 PVDF 膜，采用羊抗小鼠 IgG-HＲP 酶标二抗孵育，并利用 ECL 显色液显色，观察结果。
中国生物工程杂志 China Biotechnology，2016，36（ 5） ： 40-45 DOI： 10． 13523 / j． cb． 20160506
抗黄曲霉毒素 B1 单链抗体在 Sf9 昆虫细胞中 的表达与性质分析*
刘爱平1，2 李 诚1 刘书亮1 王小红2＊＊ 陈福生2＊＊
（ 1 四川农业大学食品学院 雅安 625014 2 华中农业大学食品学院 武汉 430070）
摘要 目的： 在原核表达抗黄曲霉毒素 B1（ aflatoxin B1，AFB1） 单链抗体（ single chain Fv fragment， scFv） 研究的基础上，为进一步了解和提高抗 AFB1 scFv 的活性，利用 Sf9 昆虫细胞表达抗 AFB1 scFv，并对其活性进行探索研究。方法： 构建 pFastBac 1-scFv2E6VHVL 重组质粒，将重组质粒转化 Escherichia coli （ E． coli） DH10Bac 细胞，进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆。提取相应的重组杆状 病毒穿梭载体 Bacmid 侵染 Sf9 昆虫细胞，表达 scFv，利用镍亲和层析法纯化 scFv，并以 ELISA 检 测 scFv 活性。结果： 蓝白斑筛选后，经菌落 PCＲ 和测序验证挑取的白斑阳性单克隆含有正确的 单链抗体基因。提取相应的重组杆状病毒穿梭载体 Bacmid 侵染 Sf9 昆虫细胞，通过 Western blot 检测得知抗 AFB1 scFv 在 Sf9 昆虫细胞中成功表达。AFB1 对 scFv 的抑制中浓度（ IC50 ） 为 30μg / ml。结论： 与 E． coli BL21（ DE3） 表达系统相比，scFv 灵敏度转好，但仍有较大提升空间。 关键词 AFB1 ELISA Sf9 细胞 scFv 中图分类号 Q511
2016，36（ 5）
Hale Waihona Puke 刘爱平 等： 抗黄曲霉毒素 B1 单链抗体在 Sf9 昆虫细胞中的表达与性质分析
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物有限公司； Easy Taq 酶、Trans2K Plus DNA Marker： 中 国北京全式金生物技术有限公司； Ni-NTA 亲和层析填 料、ECL 显色液： 美国 Thermo 公司； 羊抗小鼠 IgG-HＲP 酶标二抗： 中国华美生物工程公司； 质粒提取试剂盒： 中国 北 京 擎 科 新 业 生 物 技 术 有 限 公 司； PageＲuler Prestained Protein Ladder： 美国 Thermo 公司； DNA 凝胶 回收纯化试剂盒： 中国北京庄盟国际生物基因科技有 限公司。 1． 2 方 法 1． 2． 1 引物设计与目的基因扩增 以课题组保存的 载体 pET-3d scFv2E6VH-linker-2E6V［11］为模板，PCＲ 扩 增 scFv2E6VHVL 基 因 片 段，并 在 目 的 基 因 N 端 加 上 Kozak 序列和信号肽序列。PCＲ 引物由南京金斯瑞生 物科技有限公司合成，序列如下：
将“1． 2． 1”中第三轮 PCＲ 产物以限制性内切核酸酶 BamHI 和 XhoI 进行双酶切，克隆到同样酶切处理的质 粒 pFastBac 1，并转化 E． coli DH5α 细胞。挑取单克隆 进行菌落 PCＲ 验证，选取阳性转化子送至南京金思瑞 生物技术有限公司测序。
1． 2． 3 E． coli DH10Bac 感受态细胞制备 将 E． coli DH10Bac 菌液以 1∶ 250 接种到含 50μg / ml 卡那霉素和 10μg / ml 四环素的 LB 液体培养基，过夜培养后取 20μl 接种于含 50μg / ml 卡那霉素和 10μg / ml 四环素的 5ml 新鲜 LB 液体培养基中，37℃ 振荡培养至 OD600nm 达 0． 5 左右； 将备用的 1． 5ml 离心管和菌液置于冰块中预冷， 吸取 1． 2ml 预冷的菌液至离心管，以 5 000r / min 4℃ 离 心 5min，弃 上 清 液，加 入 800μl 预 冷 的 50mmol / L CaCl2 ，轻轻悬浮并在冰上放置 30min； 于 4℃ 5 000r / min 离心 5min，弃上清液，加 100μl 预冷的 50mmol / L CaCl2 ，轻轻悬浮，加入等体积预冷的 40% 甘油，吹打混 匀后分装，保存在 － 80℃ 。 1． 2． 4 重组杆状病毒穿梭载体 Bacmid 的筛选及鉴定
收稿日期： 2015-11-19 修回日期： 2015-12-13 * 国家自然科学基金（ 31271876） ，中央高校基本科研业务费专项 资金（ 52209-814012） 资助项目 ＊＊通讯作者，电子信箱： wxh@ hzau． edu． cn； chenfs@ hzau． edu． cn
外源 基 因。 BEVS 已 被 广 泛 用 于 生 产 大 量 （ 高 达 1 000mg / ml） 的已适当翻译修饰（ 折叠，二硫键形成、低 聚、糖基化、酰化、蛋白水解裂解） 、具有生物活性的重 组蛋白 。 ［10］
抽提重组质粒 pFastBac 1-scFv2E6VHVL，转化到含有 Bacmid 的感受态 E． coli DH10Bac，而后将适量转化后 的菌液涂布在含有 50μg / ml 卡 那 霉 素、10μg / ml 四 环 素、7μg / ml 庆大霉素、100μg / ml X-Gal （ 5-溴-4-氯-3-吲 哚-β-D-半乳糖苷） 和 40μg / ml IPTG（ 异丙基-β-D-硫代 吡喃半乳糖苷） 的 LB 平板上，37℃ 培养 48h。挑取白色 单菌落，以 Bacmid 上的 M13 引物进行菌落 PCＲ 验证， PCＲ 扩增条件为： 93℃ 预变性 5min，（ 9℃ 变性 30s，55℃ 退火 45s，72℃ 延伸 3min） × 35cycles，72℃ 延伸 10min。 PCＲ 产物经 0． 8% 的琼脂糖凝胶电泳分析。 1． 2． 5 抗 AFB1 scFv2E6VHVL 在 Sf9 细胞的表达与性 质分析
昆虫细胞表达系统是常用的外源蛋白质表达系统 之一［1］，与原核表达系统相比，它能够进行更复杂的翻 译后修饰［2］，表达哺乳动物来源的蛋白质时，更易获得 可溶性蛋白质［3］。昆虫细胞表达系统常用的有果蝇表 达系 统 和 昆 虫 杆 状 病 毒 表 达 载 体 系 统 （ baculovirus expression vector system，BEVS） 。BEVS 能够容纳较大 的外源基因，得到的重组病毒易于筛选，具有完备的翻 译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力 ［4-7］，与 果蝇表达系统相比，其生产周期和便利性更强［8］。
1 材料与方法
1． 1 材 料 AFB1： 瑞 士 Alexis 公 司； 杆 状 病 毒 转 移 质 粒
pFastBac 1、E． coli DH5α、E． coli DH10Bac 和昆虫 Sf9 细胞： 课题组保存； SFM 培养液、Cellfectin 转染试剂： 美 国 Life Technologies 公司； 小牛血清： 中国杭州四季青生
（ 1） 昆虫 Sf9 细胞转染、重组杆粒制备及抗 AFB1 scFv2E6VHVL 预表达测试。将处于对数生长期的 Sf9 细胞悬浮，并以 1． 5 × 106 cell / ml 接种到 6 孔细胞培养 板，27℃ 培养 2h，倒置显微镜下观察 90% 以上细胞已贴 壁，弃去培养液，并用 2ml 不含小牛血清的 SFM 培养液 洗涤两次。抽提“1． 2． 4”中阳性克隆子的重组杆粒，以 两个不同质量的重组 Bacmid 杆粒 DNA 进行细胞转染。 首先分别将 1μg 和 2μg 两个不同量的杆粒 DNA 用不 含小牛血清的 SFM 培养液稀释至 100μl，同时相对应的 转染试剂 Cellfectin（ 分别为 5μl 和 9μl） 稀释至 100μl。 将稀释的 Cellfectin 试剂滴加到稀释的杆粒 DNA，轻轻 吹打混合，室温孵育 15 ～ 30min。加入 0． 8ml 不含小牛 血清的 SFM 培养液，轻轻混匀，将混合物加至含有细胞 的孔中，27℃ 培养 5h，弃去混合物。加入含 5% 小牛血 清的 SFM 培养液，培养至出现明显的病毒感染症状。 收集上清液，以 1 000r / min 离心 5min，分别取上清液， 此即为 P1 代病毒株（ 将 1μg 杆粒 DNA 对应的 P1 代病
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中国生物工程杂志 China Biotechnology
Vol． 36 No． 5 2016
毒命名 为 AP1 ，2μg 的 命 名 为 BP1 ） 。连 续 感 染，获 得 AP2 和 BP2 病毒株，并将收集的 Sf9 细胞和培养上清液 用于预表达测试验证。
采用 Western blot 对 scFv 的预表达情况进行测试 分析。将 Sf9 细 胞 悬 浮 在 上 样 缓 冲 液 中 经 煮 沸 5 ～ 10min 直接上样。对于细胞上清 液，取 1ml，与 经 PBS 缓冲溶液洗涤的 80μl 镍柱亲和层析填料在室温孵育 0． 5h，再经 1ml PBS 缓冲溶液洗涤 3 次，将镍柱亲和层 析填料在 上 样 缓 冲 液 中 经 煮 沸 5 ～ 10min 直 接 上 样。 经 SDS-PAGE 后，转印 PVDF 膜，以 5% 牛奶封阻 PVDF 膜，采用羊抗小鼠 IgG-HＲP 酶标二抗孵育，并利用 ECL 显色液显色，观察结果。
