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MstⅡ是⼀种限制性内切酶，它总是在CCTGAGG的碱基序列中切断DNA。
下图显⽰⽤MstⅡ处理后的突变型⾎红蛋⽩基因⽚
段。
镰⼑型细胞贫⾎症的根本原因是⾎红蛋⽩发⽣基因突变，使某⼀处CCTGAGG突变为CCTGTGG。
下列有关叙述错误的是 （ ）
A．利⽤Mst 1I酶进⾏基因诊断，该过程是在细胞外进⾏的
B．将MstⅡ酶⽤于基因诊断，若产⽣四个DNA⽚段，则⾎红蛋⽩基因是正常的
C．在起初的正常⾎红蛋⽩基因中有4个CCTGAGG序列
D．镰⼑型细胞贫⾎症患者的成熟红细胞中没有MstⅡ酶的识别序列
答案C
【解析】：基因诊断的⽅法是DNA分⼦杂交法(即DNA探针法)：⾸先提取受体细胞中的DNA，然后⾼温解成单链，再与同位
素标记的DNA探针杂交；该过程是只能在细胞外进⾏的。
图⽰显⽰MstⅡ处理后的突变型⾎红蛋⽩基因⽚段有3段，正常的
⾎红蛋⽩基因⽐异常的多了⼀个MstⅡ的识别序列，若⽤MstⅡ酶进⾏基因诊断，会多出1个DNA⽚段，说明正常⾎红蛋⽩基因中有3个CCTGAGG序列。
镰⼑型细胞贫⾎症患者的成熟红细胞中没有DNA，更谈不上有MstⅡ酶的识别序列。
机理：镰刀型细胞贫血症是一种遗传性贫血症，属隐性遗传。
是基因突变产生的血红蛋白质分子结构改变的一种分子病。
正常的血红蛋白是由两条α链和两条β链构成的四聚体，其中每条肽链都以非共价键与一个血红素相连接。
α链由141个氨基酸组成，β链由146个氨基酸组成。
镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白的分子结构与正常人的血红蛋白的分子结构不同。
英格兰姆发现镰刀型细胞贫血症是因为链中第六个氨基酸发生变化引起的。
正常健康的人第六个氨基酸是谷氨酸，而患镰刀型贫血症的人则由一个缬氨酸代替谷氨酸。
一般用来诊断及侦测镰刀型贫血症患者的分析测试包括：·全血球计数分析(Complete blood count , CBC) ·S血红素筛选测试(Hemoglobin S screening test) ·血红素电泳分析(Hemoglobin electrophoresis) ·镰形细胞分析测试(Sickle cell test)用聚合酶链反应(PCR)和寡核苷酸探针(ASO)方法或采用PCR和限制性内切酶.疾病检查1.外周血血红蛋白为50～100g/L，危象时进一步降低。
网织红细胞计数常在10%以上。
红细胞大小不均，多染性、嗜碱性点彩细胞增多可见有核红细胞、靶形红细胞异形红细胞、Howell-Jolly小体。
镰状红细胞并不多见，若发现则有助于诊断通常采用“镰变试验”检查有无镰状细胞。
红细胞渗透脆性显著降低白细胞和血小板计数一般正常。
2.骨髓象示红系显著增生，但在再生障碍危象时增生低下，在巨幼细胞危象时有巨幼细胞变3.血清胆红素轻～中度增高，溶血危象时显著增高。
本病的溶血虽以血管外溶血为主，但也存在着血管内溶血。
4.血浆结合珠蛋白降低，血浆游离血红蛋白可能增高。
5.红细胞半衰期测定显示红细胞生存时间明显缩短至5～15天[正常为(28±5)天]6.血红蛋白电泳显示HbS占80%以上HbF增多至2%～15%，HbA2正常，而HbA缺如。
高一生物基因工程生物技术的安全性和伦理问题试题答案及解析1.限制性内切酶的特点是：( )A．只能识别GAATTC序列B．识别特定的核苷酸序列和具有特定的酶切位点C．识别黏性末端D．切割质粒DNA的标记基因【答案】B【解析】限制性内切酶有很多种类，有的能识别序列GAATTC，有的能识别其他序列，A错。
但都能识别特定的序列，B对。
有的能识别粘性末端，有的识别平末端，C错。
实验中，一般不选择切割标记基因的酶，D错。
【考点】本题考查等相关知识，意在考查学生的能力。
2.基因工程是在分子水平上进行设计施工的。
下列有关说法不正确的是A．基因工程的出现使人类有可能按照自己的意愿定向改变生物的遗传性状B．重组DNA分子的获得所需的工具酶是限制性内切酶和DNA连接酶C．质粒是基因工程中常用的运载体，其化学本质是能自主复制的小型环状RNAD．科学家利用基因工程和植物组织培养技术相结合，成功培育出了抗虫棉【答案】C【解析】基因工程可以定向改造生物的遗传性状，故A正确；重组DNA分子的工具酶为限制酶和DNA连接酶，故B正确；质粒是最常用的运载体，其化学本质是能自主复制的小型环状DNA 分子，故C错误；科学家培育抗虫棉时，利用了基因工程和植物组织培养技术，故D正确。
【考点】本题考查基因工程的有关知识，意在考查考生识记能力和理解所学知识的要点，把握知识间的内在联系的能力。
3.利用转基因奶牛乳腺生物反应器可生产人的生长激素，根据下图回答有关问题。
（1）基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有、以及标记基因等。
（2）在体外受精前，要对精子进行处理，对于牛的精子常采用。
（3）图中①过程常采用，图中②过程的培养液成分比较复杂，除一些无机盐和有机盐类外，还需要添加维生素、、氨基酸、核苷酸等成分，以及等物质。
（4）早期胚胎发育到才进行移植。
【答案】（1）启动子终止子（2）获能化学诱导法（或化学法）（3）显微注射法（1分）激素血清（4）桑椹胚或囊胚【解析】（1）基因表达载体的组成，包括目的基因，标记基因，启动子，终止子等，基因表达载体的构建，是基因工程的核心。
第 1～6 章1、现代分子生物学的开端：1953 年，Watson 和 Crick 提出了 DNA 双螺旋构造，标志着现代分子生物学的兴起，为揭开人类生命现象的本质奠定了根底。
2、临床分子生物学检验：是分子生物学技术在临床检验诊断应用中进展起来的，以疾病为中心、以生物分子标志物为靶标的一代临床检验诊断技术，是临床分子生物学的重要组成局部。
3、应用到临床的分子标志物包括基因组 DNA、各种 RNA、蛋白质和各种代谢物。
4、分子标志物：是指可以反映机体生理、病理状态的核酸、蛋白质〔多肽〕、代谢产物等生物分子，是生物标志物的一种类型。
5、核酸分子标志物包括：基因突变，DNA 多态性，基因组 DNA 片段，RNA 和循环核酸等多种形式。
6、DNA 一级构造〔直径，两个碱基之间的距离，一个螺距，一个螺旋有多少个核苷酸〕：DNA 一级构造就是指各核苷酸单体沿多核苷酸链排列的挨次。
7、DNA 二级构造〔右手螺旋—B 型最常见，左手螺旋—Z 型〕：DNA 的二级构造是双螺旋构造，主要特征是①主干链反向平行：DNA 分子是一个由两条平行的脱氧多核苷酸链围绕同一个中心轴盘曲形成的右手螺旋构造，两条链行走方向相反，一条链为5’→3’走向，另一条链为3’→5’走向。
磷酸基和脱氧核糖基构成链的骨架，位于双螺旋的外侧；碱基位于双螺旋的内侧。
碱基平面与中轴垂直。
②侧链碱基互补配对：两条脱氧多核苷酸链通过碱基之间的氢键连接在一起。
DNA 双螺旋的直径为 2nm，一圈螺旋含 10 个碱基对〔一个螺旋有 20 个核苷酸〕，每一碱基平面的轴向距离为 0.34nm，故每一螺距为 3.4nm，每个碱基的旋转角度为36°。
8、DNA 三级构造〔真核生物 DNA 三级构造是染色质或染色体〕：DNA 双螺旋进一步盘曲形成更加简单的构造，称为三级构造。
超螺旋是 DNA 三级构造的最常见的形式。
9、真核生物的 DNA 形成染色质的包装过程〔4 步〕：①形成核小体：构成染色质的根本单位是核小体。
1.现有一长度为3000碱基对(bp)的线性DNA分子，用限制性核酸内切酶酶切后，进行凝胶电泳，使降解产物分开。
用酶H单独酶切，结果如图l。
用酶B单独酶切，结果如图2。
用酶H和酶B同时酶切，结果如图3。
该DNA分子的结构及其酶切图谱是（）2.在DNA 测序工作中，需要将某些限制性内切酶的限制位点在DNA上定位，使其成为DNA 分子中的物理参照点。
这项工作叫做“限制酶图谱的构建”。
假设有以下一项实验：用限制酶Hind Ⅲ，BamHⅠ和二者的混合物分别降解一个4kb（1kb即1千个碱基对）大小的线性DNA 分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，如下图所示。
据此构建这两种限制性内切酶在该DNA分子上的“限制酶图谱”如乙图，请判断正确的标示是（）A. 2.8B. Hind ⅢC. 0.3D. BamHⅠ3.现有一长度为1000碱基对（bp）的DNA分子，用限制性核酸内切酶EcoRI酶切后得到的DNA 分子仍是1000bp，用KpnI单独酶切得到400bp和600bp两种长度的DNA分子，用EcoRI、KpnI 同时酶切后得到200 bp和600 bp两种长度的DNA分子。
该DNA分子的酶切图谱正确的是的（）4.基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。
已知限制酶I的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶II的识别序列和切点是—↓GATC—。
根据图示判断下列操作正确的是（）A．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割B．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割C．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割D．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割5.细菌蛋白质在极端环境条件下可通过肽链之间的二硫键维持稳定。
已知不同的多肽产物可因分子量不同而以电泳方式分离。
下列左图是一个分析细菌蛋白的电泳结果图，“-”代表没加还原剂，“+”代表加有还原剂，还原剂可打断二硫键，“M”代表已知分子量的蛋白质，右侧数字代表蛋白质或多肽的相对分子量。
利用限制性内切酶分析法检测镰刀型细胞贫血症
限制性内切酶分析法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。
当待测DNA序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段的状态在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。
如：（2005湖北3）镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生了改变。
检测这种碱基序列改变必须使用的酶是
A.解旋酶
B.DNA连接酶
C.限制性内切酶
D.RNA聚合酶
解析：根据碱基互补配对原则可采用DNA分子杂交原理或DNA探针的方法。
采用加热等一定的技术手段将患者的DNA分子片段与正常人的DNA分子片段单链放在一起，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离的单链。
解旋酶的作用是DNA分子在复制或转录时将DNA双链解开，在本题中加热也可以解开达到目的，所以不是必须的酶；DNA连接酶和限制性内切酶都是基因工程的工具酶，一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子的基本骨架上脱氧核糖和磷酸之间的磷酸二酯键，DNA连接酶的作用和它正好相反，是将限制酶切开的缺口缝合起来。
而RNA聚合酶则是在基因转录过程中促进核糖核苷酸形成mRNA分子的酶，本题就是采用限制性内切酶分析法解题的。
必须使用的酶就是限制性内切酶，故选C。
根据DNA分子杂交原理知，将患者的DNA分子片段与正常人的DNA分子片段单链放在一起，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离的单链，有无双链便是区别，为什么又要用限制性内切酶将其切开再杂交呢？回答这个问题我们先看看。
2008天津30-Ⅰ下图为人β-珠蛋白基因与其mRNA杂交的示意图，①-⑦表示基因的不同功能区。
从本题看出基因的单链的编码区与其转录的成熟的mRNA之间可以杂交形成杂合链，但是它们两者之间不仅不是完全互补，相反有两个内含子对应的单链部分——③⑤所含有的上百个核苷酸，mRNA根本没有对应互补的部分，这就说明它们之间相差很大也能够杂交，只不过结果有突起部分而已，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因只有一个碱基发生突变，难道用正常基因转录的mRNA就不能与只突变一个碱基的基因杂交形成杂合链吗？应该是肯定可以,如果这样来检测，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因的检测结果是相同的，就找不到区别，无法鉴别。
所以必须采用限制性内切酶分析法来检测才有效，具体是先找到一种限制性内切酶，切开控制镰刀型细胞贫血症基因的对应部位的正常基因，这样就形成两短段，也同同一种酶来切镰刀型细胞贫血症基因，因为镰刀型细胞贫血症基因发生了一个碱基的突变，这样相同的限制性内切酶就无法切开，就还是完整的一长段，在用以上三段对应的已标记的mRNA进行杂交（此过程可以不用任何酶，通过控制温度来打开氢键和连结氢键），然后电泳，如果出现两短段的则是正常基因，如果只出现一长段则是突变基因，如果都有的说明两者都存在，可视为杂合。
利用相关知识点命题的请看如下高考试题。
［2007江苏·38］单基因遗传病可以通过核酸杂交技术进行早期诊断。
镰刀型细胞贫血症是一种在地中海地区发病率较高的单基因遗传病。
已知红细胞正常个体的基因型为BB、Bb，镰刀型细胞贫血症患者的基因型为bb。
有一对夫妇被检测出均为该致病基因的携带者，为了能生下健康的孩子，每次妊娠早期都进行产前诊断。
下图为其产前核酸分子杂交诊断和结果示意图。
图注:↑限制酶酶切点·突变碱基带谱
(1)从图中可见，该基因突变是由于碱基对改变(或A变成T) 引起的。
巧合的是，这个位点的突变使得原来正常基因的限制酶切割位点丢失。
正常基因该区域上有3个酶切位点，突变基因上只有2个酶切位点，经限制酶切割后，凝胶电泳分离酶切片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱，正常基因显示 2 条，突变基因显示 1 条。
(2)DNA或RNA分子探针要用放射性同位素(或荧光分子等) 等标记。
利用核酸分子杂交原理，根据图中突变基因的核苷酸序列(…ACGTGTT…)，写出作为探针的核糖核苷酸序列…UGCACAA…。
(3)根据凝胶电泳带谱分析可以确定胎儿是否会患有镰刀型细胞贫血症。
这对夫妇4次妊娠的胎儿Ⅱ-l～II-4中基因型BB的个体是Ⅱ一l和Ⅱ一4 ，Bb的个体是Ⅱ一3 ，bb的个体是Ⅱ一2 。
解析:比较基因B和和突变后的基因b的碱基组成，发现它们的差别仅是B基因一条链某一位点上的碱基A突变成b基因一条链某一位点上的碱基T（实质上对应的另一条链上的碱基也发生了改变）。
据图观察，正常基因B经限制酶切割后，凝胶电泳分裂酶切片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱都是二条，而突变后的基因b经限制酶切割后，与探针杂交后可显示出不同的带谱都是一条。
所以，在分析推断胎儿Ⅱ-1～Ⅱ-4的基因型时，可以这样认为：基因型Bb的个体同时带有B基因和b基因，所以其应同时含有与B基因对应的二条带谱，与b基因对应的一条带谱（这也可以从Ⅰ-1和Ⅰ-2得到验证）。
符合这个条件的仅有Ⅱ-3。
同理，基因型为BB的个体应仅有与B基因相对应的二条带谱，符合条件的是Ⅱ-1和Ⅱ-4。
bb的个体是只能是含有与b基因相对应的一条带谱，为Ⅱ-2。
作为探针的必要条件之一是要易于识别，所以可用放射性同位素或荧光分子等进行标记。
既可以用脱氧核苷酸链作探针，也可以用核糖核苷酸链作探针，题干中明确要求用核糖核苷酸链，所以，特别要注意当DNA链上的碱基是A时，作探针用的RNA链上的碱基应为U。
通过如上分析可知，限制性内切酶分析法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测的方法，即是酶切和核酸分子杂交两种技术的综合分析方法。
核酸分子杂交技术在体外进行的时候可以不用相关酶，但是限制性内切酶无法用温度等外界环境的控制来代替。
限制性内切酶分析法现在的使用很广泛，如：在柯萨奇B组病毒B1-B6型检测及分型中的应用----利用GCG软件对柯萨奇B1-B6型病毒cDNA全序列进行了限制性内切酶酶切位点的分析，目前从理论上推测该方法几乎可以检测所有遗传病的变异基因，近几年高考试题也是屡屡出现,所以提醒广大师生在高考复习备考过程中应多加重视。
