革胡子鲶抗菌肽hepcidin基因克隆与序列分析

军曹鱼抗菌肽hepcidin的克隆与表达1、立题依据（包括研究目的、意义，国内外研究现状和发展趋势）：抗菌肽(antimicrobial peptides)是具有抗菌活性的肽类的总称，是在诱导条件下，生物机体免疫防御系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质。

它们大多是由20～60个氨基酸组成的多肽，分子量在2000～7000 Da左右。

抗菌肽具有广谱抗菌，热稳定性，一些肽类100℃加热10～15 min仍能保持其一定的活性；多数抗菌肽的等电点在8.9～10.7之间，表现出较强的阳离子特性，对较大的离子强度和pH值均具有较强的耐受性。

此外，部分抗菌肽能够耐胰蛋白酶或胃蛋白酶水解（Zasloff，2002），某些抗菌肽还可以抗病毒、抗真菌、抗肿瘤、刺激单核细胞趋化性和促进伤口愈合等特点，而且不易产生耐药性。

因此被认为是生物体内的主动防御肽，它不仅能在机体受到感染时发挥保护作用，调节控制一系列肽类的表达，还能够影响蛋白质翻译后加工过程。

目前已发现的抗菌肽广泛存在于细菌、真菌、昆虫、被囊动物、两栖动物、甲壳动物、鸟类、鱼类、哺乳动物直至人类，以及植物在内的所有生命中。

1972年瑞典科学家Boman等首先在果蝇中发现抗菌肽并发现其具有免疫功能，后用蜡状芽孢杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕(Hyalophora cecropia)蛹，在1975年产生了世界上第一个抗菌活性多肽——天蚕素，目前已发现的抗菌肽有近1000种（Ganzt，2003）已被测序的抗菌肽达数百种。

鱼类抗菌肽数量和种类繁多，在同一种鱼体内不同组织可能产生不同的抗菌肽；在不同鱼类中，其分子结构和作用机制差异较大。

从已有报道的鱼类抗菌肽氨基酸序列来分析，同源性低，结构上具有一定的共性，如分子带正电，含有较多精氨酸、赖氨酸和疏水氨基酸，分子内易形成α螺旋结构等。

鱼类抗菌肽其结构和组成复杂多样，依据不同的蛋白质序列组成和结构特点，可以把它们简单分成4种基本类型：第一类，不含半胱氨酸，可以折叠成疏水或双亲性α螺旋结构的抗菌肽。

革胡子鲶基因文库的建构白俊杰 徐　辉(中国水产科学研究院珠江水产研究所,热带亚热带鱼类选育与养殖农业部重点开放实验室,广州510380)摘　要　以λEM BL 3为载体构建革胡子鲶(Cla rias ga r iepinus)基因文库。

所得重组子为2×106　pfu ,达到建库要求的理论值。

关键词　基因文库,革胡子鲶,λEM BL 3载体分类号　Q81革胡子鲶(Clar ias gar iepinus )是国外引进的优良水产养殖品种,它具有生长快、个体大、耐低氧、产量高、抗病力强等优点。

如果能分离出该鱼的生长激素基因,并将其转入到生长速度较慢,但经济价值高的养殖品种中去,并在这些鱼的体内整合和表达,从而培育出生长快,价值高的新品种。

为此我们选择了革胡子鲶为材料,用λEMBL 3为载体,构建基因文库。

1　材料与方法1.1　材　料革胡子鲶(Cla rias ga riepinus )购于广州鹤洞市场。

E .coli (LE 392);λ噬菌体,溶原菌BHB 2688,BHB 2690;噬菌体EMBL 3　DN A 。

以上匀取自发育所薛国雄实验室。

限制性内切酶、RN A 酶、T 4DN A 连接酶主要为Boehriger Mannheim 公司产品,部分购自华美生物工程公司。

1.2　方　法(1)用λEMBL 3载体构建革胡子鲶基因文库的步骤基本按Mania tis 等人的方法进行。

(2)革胡子鲶大分子DN A 的制备按华美公司《分子生物学技术》[1]方法并参照文献[2]的方法。

(3)15～20kb “目的”DN A 片段的制备按文献[2]的方法用S a u 3A 部分酶切。

蔗糖密度梯度离心分离按文献[3]的方法。

(4)载体EMBL 3双臂的制备按文献[1]中双酶切法并稍加改进。

先将EMBL 3　DN A 在中盐缓冲液中用过量B am H Ⅰ在37℃消化2h,再将缓冲体系调至高盐,用过量的EcoR Ⅰ37℃消化2h 。

军曹鱼Hepcidin基因全长cDNA克隆及其组织表达分析茅莉娜;张鹤;冯娟;郭志勋;许海东;苏友禄【摘要】本试验采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)的方法,得到714 bp的军曹鱼(Rach ycentron canadum)Hepcidin基因全长cDNA序列.该序列包括213 bp 的5 '末端非编码区(UTR)、228 bp的3'UTR及273 bp的开放阅读框(ORF),编码90个氨基酸,预测其蛋白分子质量约为10.03 ku,等电点为7.54,预测的蛋白包括信号肽、前肽和成熟肽.通过构建Hepcidin氨基酸序列的系统进化树并进行氨基酸同源性比对,结果显示军曹鱼与已知鱼类及哺乳动物Hepcidin氨基酸的同源性在24.4％～85.6％之间.实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测结果显示Hepcidin基因在正常军曹鱼组织中均表达,但表达量在各个组织中有所不同,其中以肝脏表达量最高.经脂多糖(LPS)和甲醛灭活的鲨鱼弧菌(Vibrio carchariae)刺激后,肝脏、头肾、脾脏中Hepcidin基因表达均上调.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2015(042)007【总页数】10页(P1630-1639)【关键词】军曹鱼;Hepcidin基因;全长cDNA;组织表达【作者】茅莉娜;张鹤;冯娟;郭志勋;许海东;苏友禄【作者单位】中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部南海渔业资源开发利用重点实验室,广州510300;广东省疾病预防控制中心,广州511430;中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部南海渔业资源开发利用重点实验室,广州510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部南海渔业资源开发利用重点实验室,广州510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部南海渔业资源开发利用重点实验室,广州510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部南海渔业资源开发利用重点实验室,广州510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部南海渔业资源开发利用重点实验室,广州510300【正文语种】中文【中图分类】Q78Hepcidin也称为铁调素，是肝脏特异性表达的一种阳离子小分子抗菌肽，具有抑制多种细菌、真菌、病毒和原生动物生长繁殖的作用，是机体天然免疫的一种效应分子；同时也是一种信号分子，参与机体铁代谢，通过直接抑制肠上皮细胞铁吸收和单核巨噬细胞铁释放调节机体铁平衡，与炎症性贫血、遗传性血色素沉着病等铁代谢紊乱性疾病的发病机制密切相关。

《水产养殖》2019年第11期资助项目:现代农业产业技术体系专项资金(CARS-46);江苏省农业重大新品种创制项目(PZCZ201741);江苏省现代渔业产业技术体系(JFRS-05);江苏省现代渔业产业技术体系(JFRS-05)。

作者简介:刘洪岩(1986—),女,工程师,主要从事水产病害研究.E-mail :njsfdxliuhongyan@ :陈校辉(1977—),男,研究员,主要从事斑点叉尾鮰育种研究.E-mail :cxiaohui416@ 试验与总结3HepcidinHepcidin 是一种富含半胱氨酸的多肽,最先在人源的hepcidin 中发现其具有抗菌活性。

此后,hepcidin 在许多其他的脊椎动物被陆续发现,包括爬行类,两栖类和鱼类。

在鱼类中,hepcidin 最先从杂交条纹鲈中发现,目前至少已经在37种鱼类中鉴定到了该抗菌肽[1]。

Hepcidin 一般是一个由4个二硫桥形成harpin-折叠,包含8个半胱氨酸,然而鱼hepcidin 序列分析表明,鱼类hepcidin 只含有4,6或7个半胱氨酸[2]。

鱼类hepcidin 基因在进化过程中发生了重复和多样化的过程中,产生了多重基因拷贝的,最多能达到八个之多[2]。

Hepcidin 基因由3个外显子和内含子编码一个信号肽,一个端功能前区和成熟肽。

Hepcidin RNA 转录的肽段大小的范围可以从81到96个氨基酸,而成熟的hepcidin 只有19~31个氨基酸,与分子量约2~3kDa 。

hepcidin 的等电点一般8以上,因此,hepcidin 是阳离子抗菌肽。

不过也有例外,如预测斜带石斑鱼的hepcidin 等电点只有5.4[3]。

鱼有两种hepcidin ,hamp1和hamp2。

然而,hamp1在辐鳍鱼和非辐鳍鱼中都有发现,而hamp2只在辐鳍鱼中有发现。

此外,系统发育研究显示hamp2存在正向选择(但hamp1和哺乳动物中同源的基因却不存在),这表明不同的环境中的适应性进化可能与宿主和病原体的相互作用有关。

革胡子鲶抗菌肽ｈｅｐｃｉｄｉｎ基因克隆与序列分析摘要革胡子鲶生长快、抗病力强，是我国南方重要的水产养殖品种。

应用逆转录和套式PCR方法从革胡子鲶（Clarias lazera）肝脏组织RNA中扩增出抗菌肽hepcidin基因cDNA片段，并克隆测序。

序列全长233bp，该序列与另外6种淡水和海水鱼类的hepcidin序列进行了比较，序列同源性介于45.7％～76.6％之间，平均值为63.25％，说明克隆得到的hepcidin片断序列是正确的。

这为研究革胡子鲶的抗病机理和hepcidin抗菌肽的开发利用提供了基础。

关键词革胡子鲶；hepcidin；基因克隆革胡子鲶（Clarias lazera）属鲶形目、胡鲶科、胡鲶属，是我国重要的淡水养殖品种之一，目前已在我国南方10多个省市普遍养殖。

革胡子鲶病害少，抗病力强，对养殖水体条件要求不高，能在污水环境中长期养殖也不易发病并正常生长，耐低氧，食性独特，喜食其他动物内脏及腐烂的尸体，表现出极强的抗病特性。

鱼类抗菌肽与其抗病能力密切相关，而hepcidin是种类繁多的抗菌肽中一种重要的免疫因子。

本研究应用RT—PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，逆转录聚合酶链反应）技术得到了革胡子鲶体内的hepcidin基因cDNA片断，并测定其序列，为今后进一步探讨其免疫抗病机理以及通过基因工程方法合成hepcidin开发免疫制剂奠定基础。

1材料与方法1.1材料试验鱼：革胡子鲶活鱼购自南宁市五里亭农贸市场。

宿主菌和质粒：大肠杆菌E.coli DH5a为广西大学遗传育种实验室保存。

克隆质粒pMD18-T Vector购于宝生物（TaKaRa）大连生物工程有限公司。

酶和主要试剂：RNA PCR Kit（AMV）Ver 3.0试剂盒，Trizol试剂、质粒小量提取试剂盒、DNA胶回收纯化试剂盒、T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamH Ⅰ和SalⅠ均购自宝生物（TaKaRa）大连生物工程有限公司；其他试剂为国产分析纯。

高密度养殖下革胡子鲶生长激素mRNA表达的半定量分析王晓梅;戴伟;郭永军;陈承勋;李娜;张茂群【摘要】以β-肌动蛋白(β-actin)mRNA的表达量作为内标,应用半定量RT-PCR 法,对高密度养殖条件下不同月龄革胡子鲶垂体生长激素(Growthhormone,GH)mRNA的相对表达量进行分析.结果显示:3.5,5,6.5月龄试验鱼的GH mRNA的相对表达量分别为3.612～5.965,2.929～4.556和1.360～1.821;平均相对表达量分别为4.346±0.656 0,3.649±0.568 4和1.575±0.135 5.上述数据经方差分析得出,革胡子鲶任意两个不同月龄之间GH mRNA相对表达量的差异达到1%的显著水平.Duncan氏多重比较结果显示,3.5,5月龄试验鱼垂体GH mRNA 的平均相对表达量差异不显著,但均极显著高于6.5月龄.%Using β-actin mRNA expression quantity as an internal reference,the differences of growth hormone (GH) mRNA expression in pituitary of Clarias gariepinus in high density pond culture at different months old were analyzed with the employment of semi-quantitative RT-PCR method. The relative expression quantity of GH mRNA of individuals at 3.5,5 and 6.5 months old were 3. 612 - 5. 965,2. 929 - 4. 556 and 1. 360 - 1. 821 ,respectively, while the mean relative expressions were 4.346 ±0.656 0,3. 649 ±0.568 4 and 1. 575 ± 0. 135 5 separately for 3.5,5 and 6.5 months old. The variance analysis indicated that the significant differences reached 1％ in the relative expression level of the GH mRNA between any two months old. The Duncan's multiple comparison showed that the differences of GH mRNA expression between that at 3.5 and 6.5 months old as well as that at 5 and6.5 months old were extremely significant,but there was no difference of GH mRNA expression between that at 3.5 and 5 months old.【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2011(026)001【总页数】5页(P94-98)【关键词】革胡子鲶;生长激素(GH);半定量RT-PCR【作者】王晓梅;戴伟;郭永军;陈承勋;李娜;张茂群【作者单位】天津农学院,水产科学系,天津市水产生态及养殖重点实验室,天津,300384;天津农学院,水产科学系,天津市水产生态及养殖重点实验室,天津,300384;天津农学院,水产科学系,天津市水产生态及养殖重点实验室,天津,300384;天津农学院,水产科学系,天津市水产生态及养殖重点实验室,天津,300384;天津农学院,水产科学系,天津市水产生态及养殖重点实验室,天津,300384;天津农学院,水产科学系,天津市水产生态及养殖重点实验室,天津,300384【正文语种】中文【中图分类】Q575+.11;S965.128革胡子鲶(Clarias gariepinus)，隶属于鲶形目(Siluriformes)、胡鲶科(Clariidae)、胡鲶属(Clarias)。

Hepcidin研究进展张丽;张连峰【摘要】Hepcidin是肝脏特异性表达的一种小分子抗菌肽,是铁代谢的负调节激素.与炎症性贫血、遗传性血色沉着病等疾病的发病机制密切相关.证据显示,Hepcidin直接抑制肠上皮细胞铁吸收和诱导单核巨噬细胞铁滞留.同时,Hepcidin还具有广谱抗菌活性,与固有免疫密切相关.铁超载、感染、炎症及细胞因子可诱导Hepcidin表达,而贫血和缺氧则抑制其表达.Hepeidin的发现及其相关的铁离子运输机制的研究,将为铁离子吸收及分配的铁稳态调节和炎症性贫血、遗传性血色沉着病中的铁代谢障碍的分子机制探索开辟新的途径.本文就Hepcidin 的分子特征、表达调控及生物学功能等方面研究进展进行综述.【期刊名称】《中国比较医学杂志》【年(卷),期】2010(020)001【总页数】5页(P52-56)【关键词】铁代谢;固有免疫;激素;调控;心脏【作者】张丽;张连峰【作者单位】中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心,卫生部人类疾病比较医学重点实验室,北京100021;中国医学科学院实验动物研究所北京协和医学院比较医学中心,卫生部人类疾病比较医学重点实验室,北京100021【正文语种】中文【中图分类】R-33Hepcidin是 2000年发现的由肝脏特异表达的小分子防御性抗菌肽,但后来的研究表明其不仅具有广谱抗菌活性,而且还参与调节铁吸收,目前被认为是维持铁稳态极其重要的负调节激素[1]。

实验表明,Hepcidin具有抑制小肠对铁的吸收和可能促进铁在网状内皮系统中滞留等作用,介导血色素沉着病、慢性病贫血等多种铁代谢紊乱性疾病,但其作用机制仍停留于假说阶段,迄今为止也还未找到Hepcidin的受体。

因此,Hepcidin功能与作用机制的研究已成为当前铁代谢及相关疾病研究领域中的热点问题之一。

本文就 Hepcidin的分子生物学功能、作用机制及最新的研究进展进行综述。

抗菌肽Diptericin cDNA的克隆及在E.coli中的融合表达陈海旭;胡泰山;王新;屈贤铭
【期刊名称】《中国生物化学与分子生物学报》
【年(卷),期】2001(17)2
【摘要】从果蝇成虫中抽提总 RNA,RT- PCR扩增编码伏蝇素 diptericin的 c DNA,克隆并测定了全序列 .将该 c DNA亚克隆到融合表达载体 p MAL- CR1上 ,转化大肠杆菌 BL2 1菌株 ,进行了高效的可溶性融合表达 .通过离子交换层析纯化融合蛋白 ,经 Xa因子酶切后得到的重组 diptericin具有抗菌活性 .
【总页数】3页(P182-184)
【关键词】伏蝇素;MBP融合蛋白;融合表达;抗菌肽;cDNA克隆
【作者】陈海旭;胡泰山;王新;屈贤铭
【作者单位】中国科学院上海生物工程研究中心
【正文语种】中文
【中图分类】Q78;Q510.3
【相关文献】
1.斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)肝脏表达的抗菌肽-2(LEAP-2)在E.coli中的融合表达 [J], 张虹;陶妍
2.抗菌肽基因在E.Coli JM109中的克隆表达 [J], 李启辉;乐国伟;施用晖;王树英
3.TNF家族的新成员TRAIL cDNA的克隆及其在E.coli中的表达 [J], 胡以平;姚玉成
4.中国家蚕抗菌肽ABP-CM4在E.coli中的融合表达及活性分析 [J], 李保存;陈玉清;刘平;张双全
5.伊氏锥虫HGPRT基因cDNA的克隆及其在E.coli中的表达 [J], 刘全;王祥生因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。