人工合成FGL多肽对大鼠PC-12细胞增殖和凋亡的影响

肌肽对过氧化氢诱导PC12细胞损伤后NF －κB P65表达的影响董晓丽明海霞金戈（甘肃中医学院生理学教研室，兰州甘肃730000）〔摘要〕目的探讨L-肌肽对H 2O 2诱导PC12细胞（大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞）凋亡的保护机制。

方法在H 2O 2诱导PC12细胞凋亡模型的基础上，加入肌肽作用于细胞，采用MTT 比色法检测肌肽对PC12细胞的增殖抑制作用；RT-PCR 法检测凋亡相关基因NF-κB P65mRNA 的表达变化；免疫组化SABC 法检测凋亡相关蛋白Caspase-3和NF-κB P65的表达，流式细胞仪（FCM ）检测细胞凋亡。

结果不同浓度的肌肽对H 2O 2损伤的PC12细胞的存活率有显著的提高作用，20mmol /L 浓度时达最大值（P ＜0.05）。

20mmol /L 的肌肽作用于PC12细胞可降低NF-κB P65的mR-NA 表达，降低NF-κB P65蛋白的表达，流式细胞仪检测显示肌肽可抑制细胞的早期和晚期凋亡率。

结论肌肽对H 2O 2损伤的PC12细胞有保护作用，机制可能是通过抑制NF-κB P65的表达来抑制PC12细胞的凋亡而实现的。

〔关键词〕肌肽；H 2O 2；PC12细胞；NF-κB P65；凋亡〔中图分类号〕R383〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202（2012）11-2332-02；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.11.055第一作者：董晓丽（1975-），女，硕士，讲师，主要从事神经系统疾病中西医结合治疗的研究。

肌肽是继超氧化物歧化酶（SOD ）和维生素E 后又一被发现的天然非酶促自由基清除剂和抗氧化剂〔1〕。

本研究用H 2O 2处理PC12细胞，制备氧化应激损伤致凋亡的模型，采用MTT 法检测肌肽对PC12细胞增殖的影响，观察肌肽是否具有抗氧化应激的神经保护作用；检测肌肽对凋亡相关基因NF-κB P65mRNA 和蛋白表达的影响。

·专题研究１·Ｓｅｉｐｉｎ敲低大鼠ＰＣ１２细胞株的构建和对细胞凋亡的影响吕菊１，２，胡玉梅１，２，任真奎１，２，３，谢鹏１，２，张春林４，焦玲５ ，禹文峰１，２（１．贵州医科大学分子生物学重点实验室，贵州贵阳　５５０００４；２．贵州医科大学地方病与少数民族疾病教育部重点实验室，贵州贵阳　５５０００４；３．黔西南州人民医院检验科，贵州兴义　５６２４００；４．贵州医科大学基础医学院，贵州贵阳　５５００２５；５．贵州医科大学附院神经内科，贵州贵阳　５５０００４）［摘　要］目的：构建大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤（ＰＣ１２）细胞的先天性脂肪代谢障碍２型（ＢＳＣＬ２／Ｓｅｉｐｉｎ）敲低细胞株，探讨Ｓｅｉｐｉｎ敲低后对细胞凋亡的影响。

方法：将ＰＣ１２细胞分为空白感染组和助感染组（加助感染试剂ＨｉｔａｎｓＧ），采用不同慢病毒感染复数（ＭＯＩ）感染细胞进行病毒预感染试验筛选助感染试剂和合适的ＭＯＩ；依据上述感染条件，用阴性对照病毒和Ｓｅｉｐｉｎ ｓｈＲＮＡ目的病毒感染ＰＣ１２细胞作为阴性对照组和Ｓｅｉｐｉｎ敲低组，同时设置正常组（正常ＰＣ１２细胞），采用蛋白质免疫印迹法检测Ｓｅｉｐｉｎ蛋白的表达；将阴性对照组与Ｓｅｉｐｉｎ敲低组细胞用脱氧核苷酸末端转移酶介导的ｄＵＴＰ缺口末端标记（ＴＵＮＥＬ）细胞凋亡染色法和Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８染色法检测细胞凋亡情况。

结果：慢病毒ＭＯＩ＝１００时感染效果最强，助感染试剂能增加感染效率；与正常组相比，Ｓｅｉｐｉｎ敲低组Ｓｅｉｐｉｎ蛋白表达水平降低（Ｐ＜０．０５）；与阴性对照组相比，ＴＵＮＥＬ染色结果显示Ｓｅｉｐｉｎ敲低组发红色荧光的凋亡细胞明显增加，Ｈｏｅｃｈｓｔ染色结果显示Ｓｅｉｐｉｎ敲低组细胞的细胞核致密浓染或碎块状致密浓染程度明显增多。

结论：成功构建大鼠ＰＣ１２Ｓｅｉｐｉｎ敲低细胞，下调Ｓｅｉｐｉｎ蛋白表达会增加细胞凋亡。

［关键词］细胞凋亡；帕金森病；ＰＣ１２细胞；神经变性疾病；Ｓｅｉｐｉｎ蛋白；基因干扰［中图分类号］Ｒ７４２．５；Ｒ－３３２ ［文献标识码］Ａ ［文章编号］１０００ ２７０７（２０２０）０３ ０２４９ ０６ＤＯＩ：１０．１９３６７／ｊ．ｃｎｋｉ．１０００ ２７０７．２０２０．０３．００１ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＲａｔＰＣ１２ ＳｅｉｐｉｎＫｎｏｃｋｄｏｗｎＣｅｌｌＬｉｎｅａｎｄｉｔｓＥｆｆｅｃｔｏｎＡｐｏｐｔｏｓｉｓＬＶＪｖ１，２，ＨＵＹｕｍｅｉ１，２，ＲＥＮＺｈｅｎｋｕｉ１，２，３，ＸＩＥＰｅｎｇ１，２，ＺＨＡＮＧＣｈｕｎｌｉｎ４，ＪＩＡＯＬｉｎｇ５，ＹＵＷｅｎｆｅｎｇ１，２（１．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆＧｕｉｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５０００４，Ｇｕｉｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ；２．ＥｄｕｃａｔｉｏｎＭｉｎｉｓｔｒｙＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＥｎｄｅｍｉｃａｎｄＭｉｎｏｒｉｔｙＤｉｓｅａｓｅｓ，ＧｕｉｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５０００４，Ｇｕｉｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ；３．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｐｅｏｐｌｅ＇ｓＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＳｏｕｔｈｗｅｓｔＧｕｉｚｈｏｕＡｕｔｏｎｏｍｏｕｓＰｒｅｆｅｃｔｕｒｅ，Ｘｉｎｇｙｉ５６２４００，Ｇｕｉｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ；４．ＢａｓｉｃＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，ＧｕｉｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５００２５，Ｇｕｉｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ；５．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＮｅｕｒｏｌｏｇｙ，ｔｈｅＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＧｕｉｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ５５０００４，Ｇｕｉｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ）［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｒａｔＢｅｒａｒｄｉｎｅｌｌｉ Ｓｅｉｐｃｏｎｇｅｎｉｔａｌｌｉｐｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ２（ＰＣ１２ ＢＳＣＬ２／Ｓｅｉｐｉｎ）ｋｎｏｃｋｄｏｗｎｃｅｌｌｌｉｎｅａｎｄｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＳｅｉｐｉｎｋｎｏｃｋｄｏｗｎｏｎａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａｃｅｌｌｓ１２（ＰＣ１２ｃｅｌｌｓ）ｗｅｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｈｅｂｌａｎｋｉｎｆｅｃｔｉｏｎｇｒｏｕｐａｎｄＨｉｔａｎｓＧｇｒｏｕｐ（ａｄｄＨｉｔａｎｓＧａｇｅｎｔ），ａｎｄｒｅｃｅｉｖｅｄｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓＭＯＩｆｏｒｖｉｒｕｓｐｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｔｅｓｔｔｏｓｃｒｅｅｎＨｉｔａｎｓＧｒａｇｅｎｔａｎｄａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅＭＯＩ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ＰＣ１２ｃｅｌｌｓｒｅｃｅｉｖｅｄｉｎｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｖｉｒｕｓａｎｄＳｅｉｐｉｎ ｓｈＲＮＡｖｉｒｕｓ，ａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（ｎｏｒｍａｌＰＣ１２ｃｅｌｌｓ）ｗａｓｓｅｔａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅ．ＴｈｅｌｅｖｅｌｏｆＳｅｉｐｉｎｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ．Ｃｅｌｌｓ９４２第４５卷　第３期２０２０年３月 贵州医科大学学报ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＧＵＩＺＨＯＵＭＥＤＩＣＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ Ｖｏｌ．４５　Ｎｏ．３２０２０．３［基金项目］国家自然科学基金（８１３６０１９９）；教育部科学技术研究项目（２０１３０３２Ａ）；贵州省国际科技合作计划项目［黔科合外Ｇ字（２０１３）７０２６］；贵州省创新计划项目［黔教合协同创新中心（２０１４）０６］；贵州省教育厅项目（２０１５年贵州省普通高等学校地方病和少数民族疾病防控创新团队）；贵州省科技厅计划课题［黔科合重大专项字（２０１４）６００８］；贵州省教育厅项目［黔教合外Ｇ字（２０１３）６３］ 通信作者Ｅ ｍａｉｌ：ｊｉａｏｌｉｎｇ５１５１＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ；ｗｅｎｆｅｎｇｙｕ２０１３＠１２６．ｃｏｍｏｆｔｈｅｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｎｄＳｅｉｐｉｎｋｎｏｃｋｄｏｗｎｇｒｏｕｐｗａｓｓｔａｉｎｅｄｂｙＴｄＴ ｍｅｄｉａｔｅｄｄＵＴＰＮｉｃｋ ＥｎｄＬａｂｅｌｉｎｇ（ＴＵＮＥＬ）ａｎｄＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８ｔｏｄｅｔｅｃｔａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｈｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓｗａｓｔｈｅｂｅｓｔｉｎＭＯＩ＝１００，ａｎｄｔｈｅＨｉｔａｎｓＧｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｓ，ｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆＳｅｉｐｉｎｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｈｅＳｅｉｐｉｎｋｎｏｃｋｄｏｗｎｇｒｏｕｐｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌｓ，ｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｏｆＴＵＮＥＬｓｔａｉｎｉｎｇｓｈｏｗｅｄａｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｐｏｐｔｏｔｉｃｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅＳｅｉｐｉｎｋｎｏｃｋｄｏｗｎｇｒｏｕｐ，ａｎｄｔｈｅＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８ｓｔａｉｎｉｎｇｓｈｏｗｅｄｃｏｎｄｅｎｓｅｄｂｒｉｇｈｔｎｕｃｌｅｉａｐｏｐｔｏｔｉｃｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅＳｅｉｐｉｎｋｎｏｃｋｄｏｗｎｇｒｏｕｐ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＰＣ１２Ｓｅｉｐｉｎｋｎｏｃｋｄｏｗｎｃｅｌｌｓａｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ａｎｄｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＳｅｉｐｉｎｐｒｏｔｅｉｎｃａｎｉｎｃｒｅａｓｅａｐｏｐｔｏｓｉｓ．［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｐａｒｋｉｎｓｏｎｄｉｓｅａｓｅ（ＰＤ）；ＰＣ１２ｃｅｌｌｓ；ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｅａｓｅ；ｓｅｉｐｉｎｐｒｏｔｅｉｎ；ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ 帕金森病（ｐａｒｋｉｎｓｏｎｄｉｓｅａｓｅ，ＰＤ）的病理特征是中枢和外周特定神经元群的神经退行性病变和残存的多巴胺（ｄｏｐａｍｉｎｅ，ＤＡ）能神经元内出现的嗜酸性小体－路易小体（ｌｅｗｙｂｏｄｙ，ＬＢ），主要发生在黑质致密部［１］。

PC12细胞转化为神经元样细胞的培养、鉴定及氧糖剥夺模型的制备何金婷;莽靖;郭洪亮;梅春丽;胥桂华;陈罕;徐忠信【摘要】@@ 本实验采用PC12细胞是由大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤分离并建立起的细胞系,其在体外经NGF刺激诱导后可向交感神经元分化,最终导致PC12细胞在生理、生化方面具有神经元样的功能,同时应用体外氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)来模拟体内脑缺血过程,为探讨缺血缺氧状态下对神经元的活力、凋亡、信号通路机制的研究定物质基础.【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(016)005【总页数】3页(P769-771)【作者】何金婷;莽靖;郭洪亮;梅春丽;胥桂华;陈罕;徐忠信【作者单位】吉林大学中日联谊医院,神经内科,吉林,长春130033;吉林大学中日联谊医院,神经内科,吉林,长春130033;吉林大学中日联谊医院,神经内科,吉林,长春130033;吉林大学中日联谊医院,神经内科,吉林,长春130033;吉林大学中日联谊医院,神经内科,吉林,长春130033;吉林大学中日联谊医院,神经内科,吉林,长春130033;吉林大学中日联谊医院,神经内科,吉林,长春130033【正文语种】中文本实验采用PC12细胞是由大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤分离并建立起的细胞系，其在体外经NGF刺激诱导后可向交感神经元分化，最终导致PC12细胞在生理、生化方面具有神经元样的功能，同时应用体外氧糖剥夺（oxygen－glucose deprivation，OGD）来模拟体内脑缺血过程，为探讨缺血缺氧状态下对神经元的活力、凋亡、信号通路机制的研究定物质基础。

1 材料和方法1.1 实验细胞大鼠PC12细胞株购自北京金紫晶生物医药技术有限公司（中国医学科学院肿瘤细胞库）。

鼠神经生长因子（NGF）（Sigma公司，美国）。

1.2 实验方法1.2.1 PC12细胞的培养、传代将细胞悬液加入含有DMEM完全培养基，培养液2－3天更换一次。

天麻对PC12细胞的神经保护作用张鹏;张韫欢;孙宇囡;刘琳【摘要】天麻Gastrodia elata Bl,是一种名贵中药,具有平肝息风、止痉之功效.大量研究表明天麻具有神经保护的作用.而大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞系(pheochromocytomacells,PC12)是一种很好的研究神经细胞生理、病理及药理的模型.目前很多关于天麻神经保护机制的研究都将PC12细胞作为对象,本文就近年来天麻及其复方对PC12细胞的神经保护作用作一综述.【期刊名称】《黑龙江医药》【年(卷),期】2013(026)003【总页数】2页(P466-467)【关键词】天麻;PC12;神经保护【作者】张鹏;张韫欢;孙宇囡;刘琳【作者单位】哈尔滨商业大学药学院, 哈尔滨,150076;哈尔滨商业大学药学院, 哈尔滨,150076;哈尔滨商业大学药学院, 哈尔滨,150076;哈尔滨商业大学药学院, 哈尔滨,150076【正文语种】中文【中图分类】R285PC12细胞是从可移植的大鼠嗜铬细胞瘤克隆而来，其原发肿瘤是由新英格兰Deaconess医院大鼠种系经诱变产生并携带[1]。

PC12细胞具有嗜铬细胞瘤和肾上腺嗜铬细胞相关的表型，因此，PC12细胞能合成、贮存并释放适量的儿茶酚胺（主要是多巴胺和去甲肾上腺素，该细胞仅合成痕量、无法检测到的肾上腺素）。

该细胞重要的生物学特征之一是可对NGF产生反应，在暴露于NGF数天之后，PC12细胞的表型竟发生显著的变化，并获得许多交感神经元特有的生物性质。

例如，经NGF处理的细胞将停止增殖，生长出神经突起，具有电兴奋性并有许多与神经细胞分化有关的组分变化。

即PC12细胞同时具有神经分泌细胞和神经元的性状[2]。

在过去的20多年中，许多实验室已经将PC12细胞株作为一种模型，用于有关神经细胞分化、离子通道、受体、递质分泌的各种研究。

该细胞株之所以被广泛应用，是因为它具有相当高的稳定性和同质性，分化程度高，对NGF有很强的反应，可进行遗传学操作等，并且已具备大量关于PC12细胞生物学特征的背景材料[3]。

细胞与分子生物学胰岛素样生长因子-1对氯化钴诱导的PC12细胞凋亡的抑制作用马珂1，2，徐会友1，2，赵飞2，张健1，2，江继鹏1，2，代晨1，2，王仁杰2，陈旭义2△摘要：目的探讨胰岛素样生长因子-1（IGF-1）对氯化钴（CoCl2）诱导的肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞凋亡的作用及机制。

方法取对数生长期的PC12细胞，分别以10、20、40、80µmol/L的CoCl2溶液和100、200、400µg/L的IGF-1溶液处理细胞，CCK-8法检测细胞活力，得出CoCl2和IGF-1最佳干预浓度。

根据选定的实验条件，应用CoCl2处理PC12细胞建立HIE细胞模型，实验分为对照组、CoCl2处理组、IGF-1+CoCl2处理组。

分组处理24h后采用CCK-8法检测细胞存活率；TUNEL染色检测细胞凋亡情况；Western blot检测各组细胞Bax、Bcl-2及Caspase-3的蛋白的表达水平。

最后在上述实验的基础上，设CoCl2处理组、CoCl2+IGF-1处理组、HIF-1α抑制剂2-甲氧雌二醇（2-MeOE2）+ CoCl2组和CoCl2+2-MeOE2+IGF-1组，Western blot观察IGF-1、2-MeOE2及两者共用对PC12细胞HIF-1α及Bax的表达水平的影响。

结果CCK-8检测结果显示，40µmol/L CoCl2和200µg/L IGF-1为最佳干预浓度。

利用以上浓度分组干预细胞24h后，与CoCl2组相比，IGF-1+CoCl2处理组细胞存活率明显提升，TUNEL阳性细胞数和细胞比例降低，同时抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3，HIF-1α表达下调，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

应用2-MeOE2对细胞进行预处理后，CoCl2+2-MeOE2组与2-MeOE2+IFG-1组HIF-1α和Bax蛋白表达差异无统计学意义，但均较CoCl2+IGF-1组明显下调（P＜0.01）。

注射用脑蛋白水解物相关论文注射用脑蛋白水解物对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞增殖与氧化损伤的影响[摘要] 目的：探讨注射用脑蛋白水解物对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞的增殖与过氧化氢氧化损伤的影响。

方法：采用MTT法，观察不同浓度的注射用脑蛋白水解物对体外培养的大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞（PC12）生长及过氧化氢损伤保护的作用。

结果：注射用脑蛋白水解物对PC12细胞的增殖及氧化损伤的保护作用存在量效关系。

结论：注射用脑蛋白水解物可促进PC12细胞生长，并可保护细胞减轻过氧化氢的损伤。

[关键词] 注射用脑蛋白水解物；大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞；MTTEffects of cerebroprotein hydrolysate for injection on PC12 pheochromocytoma cells proliferation and oxidative damage JIANG Yuhui, LIANG WeiyangGuangdong Institute for Drug Control, Guangzhou 510180, China[Abstract] Objective: To explore the biological effects of cerebroprotein hydrolysate for injection on the proliferation and oxidative damaged rat pheochromocytoma cells (PC12). Methods: Thiazoly blue (MTT) colorimetric assay was used to determine the proliferation and oxidative damaged protection of PC12 cells after different doses ofcerebroprotein hydrolysate for injection were added into the culture medium. Results: The proliferation and protection effects on PC12 cells of cerebroprotein hydrolysate for injection were depended on its doses. Conclusion: Cerebroprotein hydrolysate for injection may promote the proliferation and protect the PC12 cells injured from oxidation.[Key words] Cerebroprotein hydrolysate for injection; Rat pheochromocytoma cells; MTT注射用脑蛋白水解物为健康乳猪脑经酶水解制成的无菌冻干制剂，含75%~80%游离氨基酸和20%~25%小分子肽。

建立NF-κB核转位的转基因细胞模型苑玉和;吴苗苗;刘岩;胡金凤;王宏旭;陈乃宏【摘要】目的建立NF-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)转基因细胞模型.方法RT-PCR方法扩增p65基因片段;分子克隆技术构建哺乳动物细胞表达载体;脂质体法转染不同细胞;Western blot验证蛋白表达;利用荧光可视化技术观察p65核转位的情况.结果成功获得与绿色荧光蛋白(GFP)融合的载体;并建立p65转基因细胞模型;转基因组中p65蛋白表达量明显高于对照组,给予LPS刺激BV-2后能够促进p65向细胞核转位;而转染后的PC12细胞,p65的核定位现象则呈现不均一性.结论成功建立p65转基因细胞模型,针对不同细胞建立的模型,可用于相关化合物的筛选.【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2012(028)005【总页数】3页(P726-728)【关键词】NF-κB;p65;核转位;转基因;细胞模型;小胶质细胞【作者】苑玉和;吴苗苗;刘岩;胡金凤;王宏旭;陈乃宏【作者单位】天然药物活性物质与功能国家重点实验室,中国医学科学院药物研究所,北京协和医学院药物研究所,北京,100052;天然药物活性物质与功能国家重点实验室,中国医学科学院药物研究所,北京协和医学院药物研究所,北京,100052;天然药物活性物质与功能国家重点实验室,中国医学科学院药物研究所,北京协和医学院药物研究所,北京,100052;天然药物活性物质与功能国家重点实验室,中国医学科学院药物研究所,北京协和医学院药物研究所,北京,100052;天然药物活性物质与功能国家重点实验室,中国医学科学院药物研究所,北京协和医学院药物研究所,北京,100052;天然药物活性物质与功能国家重点实验室,中国医学科学院药物研究所,北京协和医学院药物研究所,北京,100052【正文语种】中文【中图分类】R329.2;R341.31;R394.2核转录因子-kappa B(nuclear factor-kappa B，NF-κB)是一种广泛表达并发挥重要作用的转录因子，具有调控细胞存活、增殖、分化等功能。

低氧诱导因子-1α在喹啉酸诱导的PC12细胞损伤中的作用李永金;杨开勇;张谊;陈月芳;端礼荣;黄晓佳【摘要】目的：探讨低氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）在喹啉酸诱导大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤 PC12细胞损伤中的作用。

方法用不同浓度的喹啉酸（2．5，5和10 mmol·L －1）处理 PC12细胞24 h 诱导细胞损伤，采用噻唑蓝还原法和乳酸脱氢酶漏出率检测法测定细胞损伤程度，采用丙二醛和超氧化物歧化酶试剂盒检测细胞内氧自由基水平， Hoechst 33258单荧光染色法观察细胞凋亡，免疫荧光染色法检测 HIF-1α在细胞内的表达，免疫印迹法检测细胞HIF-1α、蛋白激酶 B （Akt）、磷酸化 Akt （phosphorylated-Akt，p-Akt）、淋巴瘤／白血病-2（B cell lymphoma／lewkmia-2，Bcl-2）和 Bcl-2相关 X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）的表达。

结果喹啉酸可剂量依赖性地诱导 PC12细胞损伤，导致细胞内氧自由基增多和细胞凋亡。

同时，喹啉酸可使PC12细胞 HIF-1α表达上调并聚集于核内；p-Akt 表达增加， Bax／Bcl-2表达比例增加。

结论HIF-1α和 Akt 介导了喹啉酸诱导 PC12的细胞凋亡；此外，氧化应激过程也可能参与了细胞损伤。

%Aim To investigate the role of HIF-1 αin PC1 2 cell injury induced by quinolinic acid.Methods PC1 2 cells were treated with quinolinic acid at the do-ses of 2.5,5 and 1 0 mmol·L -1 ,the cell viability was determined by MTT reduction assay and LDH as-say,the intracellular levels of oxygen species was measured by assessing SOD and MDA levels,cell ap-optosis was determined by Hoechst 33258 staining,the intracellular distribution of HIF-1 αwas examined by HIF-1αimmunostaining,and the expressions of HIF-1 α,Akt,p-Akt,Bcl-2 and Bax were determined by im-munoblotting analysis.Results Quinolinic acid in-duced cell injury in PC1 2 cells in a dose-dependent manner,and potentiated oxygen radical production and cell apoptosis.Inaddition,quinolinic acid enhanced HIF-1 αexpression and accumulation in nuclei.The p-Akt expression and Bax/Bcl-2 ratio was increased by quinolinc acid in PC1 2 cells.Conclusions HIF-1 αand Akt medi ate qunolinc acid-induced cell apoptosis in PC1 2 cells.And cellular oxidative stress may con-tribute to the injury as well.【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2015(000)004【总页数】7页(P493-498,499)【关键词】喹啉酸;PC1 2 细胞;细胞损伤;细胞凋亡;HIF-1 α;信号通路;氧化应激【作者】李永金;杨开勇;张谊;陈月芳;端礼荣;黄晓佳【作者单位】江苏大学医学院 1.药理学系;江苏大学医学院 1.药理学系;江苏大学医学院 1.药理学系;基础医学与预防医学实验中心，江苏镇江 212013;基础医学与预防医学实验中心，江苏镇江 212013;江苏大学医学院 1.药理学系【正文语种】中文【中图分类】R-332;R329.25;R338.1;R977.6许多神经系统疾病，如脑缺血、阿尔茨海默病、帕金森病等的发生、发展过程，均与兴奋性神经递质，如谷氨酸，毒性损伤有关。

益智仁中的原儿茶酸对鱼藤酮损伤PC12细胞的保护作用刘叶明;郑甜甜;徐美娟;林景峰;孙淑华;李其久【摘要】建立鱼藤酮(rotenone)诱导的大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞(Pheochromocytoma,PC12)损伤的类帕金森病细胞模型,探讨益智仁中的原儿茶酸(PCA)对该类帕金森病细胞模型的保护作用及其可能作用机制.采用四唑盐(MTr)方法检测细胞活力,并且采用乳酸脱氢酶(LDH)方法作为细胞活力的进一步验证;对于细胞形态变化采用Hoechst 33258染色法进行观察;采用细胞内常见的抗氧化酶试剂盒(超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT),谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px))分别检测细胞内各抗氧化酶含量的变化;对于细胞内活性氧(ROS)水平的变化采用2',7'-二氯荧光素二乙酸(DCF-DA)进行检测;用Caspase-3/CPP32 Colorimetric 试剂盒检测细胞内Caspase-3的活性.将0.5μM鱼藤酮作用于PC12细胞48 h后,诱导其产生典型间接氧化应激过程并产生凋亡特征,益智仁中的1mM原儿茶酸对鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤有明显的抗凋亡保护作用,其可能机制是增强细胞内源性抗氧化酶的活力,抑制活性氧的产生,阻止Caspase-3的激活途径,从而达到减少或抑制细胞凋亡的目的.【期刊名称】《辽宁大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(043)001【总页数】7页(P61-67)【关键词】原儿茶酸;鱼藤酮;氧化应激;凋亡;PC12细胞【作者】刘叶明;郑甜甜;徐美娟;林景峰;孙淑华;李其久【作者单位】大连诚泽检测有限公司,辽宁大连116011;辽宁大学生命科学院,辽宁沈阳116036;辽宁仙人洞国家级自然保护区管理局,辽宁庄河116407;辽宁仙人洞国家级自然保护区管理局,辽宁庄河116407;辽宁仙人洞国家级自然保护区管理局,辽宁庄河116407;辽宁大学生命科学院,辽宁沈阳116036【正文语种】中文【中图分类】Q26常见的中枢神经系统退行性疾病的病理学特征是选择性黑质致密部里的多巴胺能神经元凋亡或变性，帕金森病(Parkinsons disease,PD)就是其中的一种.在大多数天然有机杀虫剂中，鱼滕酮具有亲脂性的，并可透过血脑屏障，强烈抑制脑组织线粒体呼吸链复合体Ⅰ的活性，而且引起黑质-纹状体多巴胺的神经系统选择性的变性，增强多巴胺能神经元对氧化应激的敏感程度.大量研究表明[1-2]，由于物质的代谢失衡而导致的氧化应激在PD中起主要作用.大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤细胞(Pheochromocytoma,PC12)与多巴胺能神经元在生理生化特征方面有许多相似之处.能够表达多巴胺转运体,并分泌多巴胺[3]，是研究体外神经细胞损伤及保护最为广泛的细胞系.作为我国的四大南药之一的益智仁，以往被大多数人用在温和脾胃，预防腹泻，摄唾涎，固精缩尿等方面.经过现代药理学研究后表明，益智仁提取物还在强心，防癌，抗过敏，延缓衰老等方面有着特殊的药理作用.最近文献表明，从益智仁中已经首次提取单体活性化合物原儿茶酸，具有明显神经保护作用[4].本文的研究是采用不同浓度鱼藤酮对PC12细胞进行不同时间的孵育作用，考察其对PC12细胞增殖和凋亡的影响，以建立一种类帕金森病的细胞损伤模型.在鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤之后，探讨原儿茶酸对其是否具有保护作用，并研究了其可能的药理作用机制，在防治由氧化应激介导的帕金森病药物开发中，可以将原儿茶酸作为主要成分之一而提供有力依据.1.1 材料大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞：采购于中科院上海细胞所细胞库；胎牛血清和DMEM培养基：采购于美国Gibco公司；青霉素和链霉素：采购于大连美罗制药；四唑盐，鱼藤酮，Hoechst 33258和碘化丙啶(propidium iodide，PI)，2′,7′-二氯荧光素二乙酸(2′,7′-dichlorofluorescin diacetate，DCF-DA)：采购于Sigma公司；Caspase-3/CPP32 Colorimetric检测试剂盒：采购于美国BioVision；LDH，SOD，CAT，GSH-Px检测试剂盒：采购于自南京建成生物工程研究所；益智仁：采购于大连中医药大厦；其余试剂为国产分析纯.益智仁中原儿茶酸的制备[4]：将3kg益智仁干粉采用95%乙醇室温渗漉，提取液通过减压蒸馏的方式，使其浓缩至浸膏，然后加水分散后，用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，收集其中的乙酸乙酯相，并采用100~140目硅胶柱进行干法上样层析，洗脱液为氯仿-甲醇一系列浓度梯度，同时采用细胞活性跟踪实验，收集具有活性的层析组分并重新溶解于甲醇中，最后采用Sephadex LH-20凝胶层析，甲醇洗脱，重结晶后得到活性单体化合物PCA，即原儿茶酸(如图1所示)，用于实验.1.2 PC12细胞的培养及药物处理1.2.1 细胞培养在37 ℃，5% CO2的孵箱中培养PC12细胞，细胞培养基是DMEM基础上添加10%灭活胎牛血清,100 U/mL青霉素,100 mg/L链霉素，培养48 h后换液.在细胞传代时，首先吸去培养瓶中的培养基，并加入适量的0.25%胰蛋白酶消化后轻轻吹打，达到吹散细胞团的目的，并取对数生长期的细胞进行以下实验.1.2.2 鱼藤酮对PC12损伤模型的建立在96孔培养板中接种细胞，每孔接种100 μL，接种密度为1×105个/mL，培养24 h后，在细胞培养基中添加不同量的鱼藤酮(事先用DMSO溶解，终浓度小于0.1%)，使其终浓度分别为0.01，0.05，0.1，0.25，0.5μM，并在孵箱中分别继续培养细胞24 h和48 h后，终止培养，采用MTT法检测细胞的活力.1.2.3 原儿茶酸的药物干预研究不同浓度原儿茶酸对鱼藤酮诱导的PC12损伤细胞时的影响，原儿茶酸预孵0.5 h后，再加入0.5 μM鱼藤酮处理，共同培养48 h，采用MTT法检测细胞活力，其中，原儿茶酸终浓度分别为0.1，0.2，0.5，1.0 mM.1.3 MTT法检测细胞存活率[5]在96孔培养板中接种细胞，每孔100 μL，接种密度为1×105个/mL，经过药物处理终止培养前，每孔加入MTT，使其终浓度为0.5 mg/mL，并继续在37 ℃，5% CO2孵箱中培养4 h后，将培养液吸出，在每孔中加入100 μL的DMSO，待紫色结晶物质完全溶解后，在570 nm处，参比波长设定为630 nm，采用M450型酶标仪测定每孔吸光值，计算细胞存活率.细胞存活率=(各浓度组吸光值/对照组吸光值)×100%1.4 细胞内乳酸脱氢酶(LDH)漏出率的测定在24孔培养板中接种细胞，每孔500 μL，接种密度为1×105个/mL，在培养24 h后加鱼藤酮于培养孔中，使其终浓度为0.5 μM，同时分别加入终浓度为0.1，0.2，0.5，1.0 mM的原儿茶酸，再培养48 h后，收集培养液.实验按照LDH检测试剂盒说明操作，通过如下公式计算细胞培养液的LDH漏出率.LDH漏出率=(培养液OD值)/(培养液OD值+细胞匀浆液OD值)×100%1.5 Hoechst 33258染色的细胞形态学变化观察参照文献[6]，细胞经过不同处理作用48 h后终止培养，将培养液吸出，4%多聚甲醛固定30 min，吸去多聚甲醛后以PBS洗3次，每次5 min.加入Hoechst 33258至终浓度为10 μg/mL，37 ℃避光染色15 min.荧光显微镜观察、拍照.1.6 细胞内相关抗氧化酶活力变化在24孔培养板中接种细胞，每孔500 μL，接种密度为1×105个/mL，在培养24 h后加鱼藤酮于培养孔中，使其终浓度为0.5 μM，同时加入终浓度为1.0 mM 的原儿茶酸，再培养48 h 后，收集培养液和细胞，按照SOD，CAT，GSH-Px检测试剂盒说明书，采用Bradford(1976)[7]的方法测定蛋白含量.1.7 细胞内活性氧(ROS)水平变化参照文献[8-9]，PC12细胞经过不同处理后，加入DCF-DA(终浓度1 mM)在37 ℃，5% CO2的孵箱中孵育PC12细胞60分钟后，用PBS清洗三次.细胞经1 000 g离心5 min，并去掉上清液后，采用1%TritonX-100溶解，在激发波长480 nm，发射波长540 nm处，应用荧光分光光度仪测定细胞内ROS水平. 1.8 细胞内的Caspase-3活性变化收集不同处理组的细胞(大约2×106个)分别于1.5 mL离心管中，并加入50 μL 预冷的Cell Lysis Buffer，在冰上孵育10 min；于4 ℃下，10 000 g离心1 min 后，缓慢将上清液(即胞质提取液)吸取至新的1.5 mL离心管中，放在冰上保存待用；对样品中蛋白含量进行测量，并根据所测每个样品的蛋白浓度，分别稀释一定量的蛋白(50~200 μg)至50 μL的Cell Lysis Buffer中，进行下一步的实验；加入50μL的2×Reaction Buffer(含有10 mM DTT)，再加入5 μL的4 mM DEVD-pNA底物(终浓度200 μM)，在37℃孵育1~2 h后，转移至96孔板中，用酶标仪在405 nm处测定其吸光值，并采用Bradford(1976)[7]的方法测定蛋白含量.1.9 统计学处理采用统计软件Origin 7.5对实验结果进行统计分析，数据用表示，组间比较用t 检验，P< 0.05为差异显著，P< 0.01为差异极显著.2.1 鱼藤酮对PC12细胞的损伤作用如图2所示，低浓度鱼藤酮(0.01 μM与0.05 μM)对PC12细胞的损伤不明显，但是当浓度超过0.1 μM以上时，PC12细胞存活率降低，并且鱼藤酮损伤程度呈时间、剂量依赖性，培养时间越长，即当鱼藤酮添加浓度越大，其诱导的细胞损伤程度越大.其中，终浓度0.5 μM的鱼藤酮处理48 h后，细胞存活率降低到(40.08±2.28)%，接近于半数细胞损伤，所以选择0.5 μM鱼藤酮作用于PC12细胞48 h，以考察原儿茶酸作用于这种损伤细胞的影响.2.2 原儿茶酸对鱼藤酮损伤的PC12细胞活力的影响如图3所示，不同浓度的原儿茶酸保护细胞的存活率都高于单独鱼藤酮损伤组，说明原儿茶酸可以抑制鱼藤酮对PC12细胞的损伤，其中，0.5 mM及1.0 mM保护组与损伤组相比有极显著差异，具有明显的保护作用.2.3 原儿茶酸对鱼藤酮损伤的PC12细胞胞内LDH漏出率的影响如图4所示，在终浓度0.5 μmol鱼藤酮处理PC12细胞48 h后，导致了细胞中LDH的漏出率为(64.26±2.11)%，而对照细胞的漏出率仅为(2.51±1.10)%.随着原儿茶酸的加入，可以剂量依赖地减轻了LDH的漏出，0.1，0.2，0.5，1.0 mM的原儿茶酸分别使细胞中LDH的漏出减少到(54.36±2.11)%，(50.38±2.00)%，(32.36±1.60)%和(17.36±2.00)%.因此，这更深层次揭示了在鱼藤酮造成的PC12细胞质膜破坏而生存力丧失后，原儿茶酸能够减弱这种影响，并减少LDH从细胞中漏出.2.4 Hoechst 33258染色观察细胞凋亡如图5所示，在荧光显微镜下观察，正常对照组(如图5A所示)中，PC12的染色质分布均匀，显示出极淡的荧光，当0.5 μM鱼藤酮与PC12细胞共同孵育48 h 后，有大量的细胞核呈致密浓染或碎块状浓染的固缩形态，显示出较强的荧光，产生少量凋亡小体(如图5B所示)，发生了明显的凋亡特征.但是在同时加入1 mM原儿茶酸(如图5C所示)时，可以看出细胞荧光强度明显减弱，染色体浓缩以及出现凋亡小体的细胞减少，细胞核状态接近于正常对照组，这揭示了原儿茶酸能抑制鱼藤酮诱导的PC12细胞凋亡.2.5 原儿茶酸对胞内相关抗氧化酶活性的影响如图6所示，与正常对照组相比，单独添加1 mM原儿茶酸没有影响PC12细胞中SOD，CAT和GSH-Px的活性，而0.5 μM鱼藤酮处理组同时降低了这三种抗氧化酶的活性.当细胞在鱼藤酮和原儿茶酸同时处理后，比较单独鱼藤酮处理组，尽管GSH-Px的活性没有明显的变化，但SOD和CAT的活性得到了明显的提高.而且与正常对照组相比，在0.5 μM鱼藤酮和1 mM原儿茶酸的共同孵育48 h后，CAT的活性提高了103.43%.这个结果提示：在单独添加原儿茶酸处理后，虽然对正常PC12细胞内的抗氧化酶表达没有影响，但在鱼藤酮刺激下，能够激活抗氧化酶表达途径，对由于鱼藤酮所引起的细胞内抗氧化酶活性降低起到明显抑制作用. 2.6 原儿茶酸对胞内活性氧(ROS)的水平的影响如图7所示，与正常对照组相比，当PC12细胞被加入0.5 μM鱼藤酮处理48 h 后，引起细胞内ROS水平增加到(225.54±7.89)%，而添加原儿茶酸后，其明显抑制了ROS的形成，0.1，0.2，0.5及1.0 mM的原儿茶酸分别使ROS水平剂量依赖地下降至(217.15±12.24)%，(199.92±10.10)%，(174.91±11.53)%和(136.63±10.05)%.这说明损伤的PC12细胞受到氧化应激程度，随原儿茶酸浓度增加而呈明显地剂量依赖性减弱.2.7 原儿茶酸对胞内的Caspase-3活性的影响如图8所示，与正常对照组相比，当PC12细胞被加入0.5 μM鱼藤酮处理48 h 后，细胞内caspase-3活性增加到正常对照组的(242.34±12.74)%，而原儿茶酸的加入明显抑制了caspase-3的活性，0.1，0.2，0.5，1.0 mM的原儿茶酸分别使Caspase-3的活性下降至(235.39±13.49)%，(220.96±13.02)%，(160.39±12.93)%及(130.59±12.87)%.这说明原儿茶酸抑制caspase-3的活性呈明显地剂量依赖性.最近的许多文献表明,神经退行性疾病发病过程中，神经元凋亡或缺失发挥着重要作用[10],但是其凋亡或缺失的原因和机制还没有完全被阐明，普遍存在的一种观点认为，这与神经元在受到氧化应激过程中的敏感程度强弱有密切关系.因此，直接或间接地增强机体抗氧化防御体系，减少或抑制细胞凋亡是目前防治神经退行性疾病的基本策略之一.本实验采用不同浓度的鱼藤酮，在体外建立诱导PC12细胞凋亡的类帕金森病细胞损伤模型之后,探讨原儿茶酸在体外对该模型的保护作用.通过PC12细胞与鱼藤酮共同孵育,采用四唑盐(MTT)方法、乳酸脱氢酶(LDH)方法及细胞核形态观察等方法，证明鱼藤酮诱导的PC12细胞凋亡是典型的类帕金森病细胞损伤模型，并进一步通过胞内抗氧化酶活性，活性氧水平，及Caspase-3活性分析实验表明，推测该凋亡可能Caspase依赖的线粒体通路有关.实验结果表明，当0.5 μM鱼藤酮作用于PC12细胞48 h后，细胞质膜被破坏，乳酸脱氢酶(LDH)漏出率明显升高；从形态上观察，细胞性状发生变化，皱缩成圆形或椭圆形，在胞浆中可见到存在的颗粒及空泡，并且细胞核中的DNA发生凝集和断裂，通过Hoechst 33258染色法可以观察到高亮蓝色荧光，并有凋亡小体存在,表现出明显的凋亡特征.本课题组先前实验显示，益智仁中的原儿茶酸在细胞[11-12]与动物[13]水平上具有明显的神经保护作用，本文的研究揭示，在鱼藤酮诱导的PC12细胞凋亡过程中，原儿茶酸起到明显地抑制作用.当加入1.0 mM原儿茶酸时,通过Hoechst 33258染色法观察到蓝色荧光明显减弱,出现凋亡小体的细胞明显减少，细胞内源性抗氧化酶活性由于鱼藤酮导致的氧化应激所激发而增强，产生的活性氧含量受到明显抑制，并且Caspase-3的激活途径被阻止.因此，原儿茶酸对鱼藤酮诱导的PC12细胞保护作用的可能机制与以下几个方面有关，一是增强细胞内源性抗氧化酶的活力；二是抑制活性氧的产生；三是阻止Caspase-3的激活途径，从而达到减少或抑制细胞凋亡的目的.【相关文献】[1]Zhang J,Perry G,Smith MA,et al.Parkinson′s disease is associated with oxidative damage to cytoplasmic DNA and RNA in substantia nigra neurons[J].Am J Pathol,1999,154(5):1423-1429.[2]Yoritaka A,Hattori N,Mori H,et al.An immunohistochemical study on manganese superoxide dismutase in Parkinson′s disease[J].J Neurol Sick,1997,148(2):181-186.[3]Kadota T,Yamaai T,Saito Y,et al.Expression of dopamine transporter at the tips of growing neuritis of PC12 cells[J].J Histo-chem Cytochem,1996,44(9):989-996.[4] An L J,Guan S,Shi G F,et al.Protocatechuic acid from Alpinia oxyphylla against MPP+-induced neurotoxicity in PC12 cells[J].Food and Chemical Toxicology,2006,44(3):436-443.[5]Lourdes Massieu,Julio Moran,Yves Christen.Effect of Ginkgo biloba(EGb 761)on staurospor ine-induced neuronal death and caspase activity in cortical cultured neurons[J].Brain Research ,2004,1002:76-85.[6] Chen A Y,Yu C,Bodley A,et al.A new mammalian DNA topp-isomerase I poison Hoechst 33258:cytotoxicity and drug resistance in human cell culture[J ].Cancer Res,1993,53(6):1332-1337.[7]Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Analyt Biochem,1976,72(3):248-254.[8]Wang H,Joseph J A.Quantifying cellular oxidative stress by dichlorofluorescein assay using microplate reader[J].Free Radicals in Biology and Medicine,1999,27:612-616.[9] Lautraite S,Bigot-Lasserre D,Bars R,et al.Optimization of cell-based assays for medium throughput screening of oxidative stress[J].Toxicology in Vitro ,2 003,17:207-220.[10]Nirit Lev,Eldad Melamed,Daniel 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