不同激素浓度培养基的配制

不同激素浓度配比对萝卜愈伤组织形成的影响作者：胡伟陈豫伍洋来源：《江苏农业科学》2014年第07期摘要：以萝卜直根形成层为试验材料，比较不同激素NAA、2，4-D和6-BA浓度配比对萝卜外植体形成愈伤组织诱导率和质量的影响。

结果表明：（1）与不添加任何激素相比，不同激素浓度配比对萝卜愈伤组织诱导效果明显。

（2）6-BA分别与NAA、2，4-D配比诱导萝卜愈伤组织的比较表明，2，4-D较NAA更适于诱导萝卜愈伤组织。

（3）6-BA与2，4-D浓度均为0.050～0.075 mg/mL的配比对萝卜愈伤组织诱导效果最好。

关键词：萝卜；激素；直根；愈伤组织；诱导率中图分类号： Q943.1；S631.104+.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）07-0060-03收稿日期：2014-04-01基金项目：发酵资源与应用四川高校重点实验室项目（编号：2012KFJ002）；宜宾学院青年基金（编号：2012Q14）。

作者简介：胡伟（1981—），男，宁夏吴忠人，硕士，讲师，主要从事有机农业及作物生产系统模拟与决策研究。

E-mail：wh_1981225@通信作者：陈豫，博士，副教授，主要从事农村沼气及生态农业研究。

E-mail：chenyu@。

萝卜（Raphanus sativus）是中国主要的大众化蔬菜作物之一，在民间有“小人参”之美称，具有较高的食用价值和医用价值。

萝卜采用常规育种手段需时长且劳动强度大，通过组织培养能够大量扩繁原种，并能更好地保持萝卜良种的性状。

关于萝卜组织培养的研究，国内外都有大量报道[1-9]，但大多数研究中应用的激素种类比较单一，外植体的类型从萝卜的带柄子叶、子叶、下胚轴、花药等进行研究，但未涉及外植体萝卜根部对愈伤组织的影响。

本试验旨在研究不同激素浓度配比下，以萝卜根部形成层为外植体进行愈伤组织的培养，分析不同激素配比对萝卜愈伤组织形成的影响及愈伤组织的生长情况，找出萝卜组织培养过程中适宜的激素配比浓度范围，为萝卜的组培技术提供理论参考。

研究20%次氯酸钠和0.1%升汞处理不同时间对番茄种子表面消毒和萌发的影响及不同激素组合对该品种再生芽形成和幼苗生根的影响。

结果表明:用20%次氯酸钠对番茄种子进行消毒20 min,可获得较多的无菌苗,同时发现,IAA浓度为0.2 mg/L和6-BA浓度为2 mg/L组合时,外植体再生芽频率较高为87.2.2%,促进不定芽生根最佳激素浓度为MS培养基中添加0.5 mg/L IAA。

再生苗移栽到灭菌处理后土壤中成活率较高,可达88%。

（1）配制MS大量元素母液一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。

分别称取NH4NO3 165g KH2PO4 17gKNO3 190g CaCl2·2H2O 44gMgSO4·7H2O 37g各自配成1L的母液。

倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

（2）配制MS微量元素母液一般将微量元素配制成100倍母液。

依次称取KI 0.083g Na2MoO4·2H2O 0.025gH3BO3 0.62g CuSO4·5H2O 0.0025gMnSO4·H2O 1.69g CoCl2·6H2O 0.0025gZnSO4·7H2O 0.86g 配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。

分别称取CuSO4·5H2O 0.05g CoCl2·6H2 O 0.05g 各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。

（3）配制MS有机母液一般配制成100倍MS有机母液。

依次称取肌醇10g 盐酸硫胺素（VB1）0.01g烟酸0.05g 甘氨酸0.2g盐酸吡哆醇（VB6）0.05g 配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。

（4）配制MS铁盐母液一般配制成100倍MS铁盐母液。

牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用）牛肉膏3g蛋白胨5g氯化10g钠琼脂15~20gpH 7.0~7.2水1000mL 121℃灭菌20min。

2、高氏（Gause）1号培养基（培养放线菌用）可溶性淀20g粉硝酸钾1g氯化0.5g钠磷酸氢二钾0.5g硫酸镁0.5g硫酸亚铁0.01g琼20g脂水1000mLpH7.2～7.4配制时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000mL。

121℃灭菌20min。

3、查氏（Czapek）培养基（培养霉菌用）硝酸钠2g磷酸氢二钾1g氯化钾0.5g硫酸镁0.5g硫酸亚铁0.01g蔗糖30g琼脂15~20g水1000mLpH 自然121℃灭菌20min。

4、马丁氏（Martin）琼脂培养基（分离真菌用）葡萄糖10g蛋白胨5g磷酸二氢钾1g七水合硫酸镁0.5g1/3000孟加拉红100mL（rose bengal，玫瑰红水溶液）琼脂15—20gpH 自然蒸馏水800mL112℃灭菌30min。

临用前加入0.03%链霉素稀释液100mL，使每毫升培养基中含链霉素30μg。

5、马铃薯培养基（简称PDA）（培养真菌用）马铃薯200g蔗糖（或葡萄糖）20g琼脂15—20gpH 自然培养基的配制：马铃薯去皮，切成块煮沸30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，熔化后补足水至1000mL。

121℃灭菌30min。

6、麦芽汁琼脂培养基培养基的配制：(1)、取大麦或小麦若干，用水洗净，浸水6—12小时，至15℃阴暗处发芽，上面盖纱布一块，每日早、中、晚淋水一次，麦根伸长至麦粒的两倍时，即停止发芽，摊开晒干或烘干，贮存备用。

(2)、将干麦芽磨碎，一份麦芽加四份水，在65℃水浴中糖化3—4小时，糖化程度可用碘滴定之。

加水约20mL，调匀至生泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤。

(3)、将糖化液用4—6层纱布过滤，滤液如混浊不清，可用鸡蛋白澄清，方法是将一个鸡蛋白加水约20mL，调匀至生泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤。

培养条件：MS为基础培养基，加入ZT 1.0 mg/L + NAA 0.1 mg/L。

培养基配方：1.生长调节剂的配制：（1）6-BA：母液浓度1 mg/ml，5 mg6-BA + 5 ml水。

培养基内激素浓度0.5 mg/L，0.5 ml母液/1L培养基。

（2）IBA：母液浓度0.1 mg/ml，5 mgIBA + 50 ml水。

培养基内激素浓度0.1 mg/L，1 ml母液/1L培养基。

（3）NAA：母液浓度0.1 mg/ml，5 mgNAA + 50 ml水。

培养基内激素浓度0.1 mg/L，1 ml母液/1L培养基。

以上生长调节剂配制完成后，装入棕色瓶中，保存在冰箱中。

2.初代培养初代培养基配制：（1）MS40 g + 白糖10 g + 琼脂2.0 g，加热溶解，定容至1L。

（2）加激素，1 mg/ml的6-BA母液0.5 ml，0.1 mg/ml的IBA母液1 ml，0.1 mg/ml 的NAA母液1 ml。

（3）用1mol氢氧化钠调整pH=5.6，加0.5 ml左右。

分装，每瓶20 ml。

（4）灭菌，121℃，15min。

初代组培操作步骤：1.芽体消毒和预处理，取材前2天左右（晴天），待取材植株喷施800倍多菌灵一次，并用用透气纸袋套袋备用。

2.剪取半木质化供试材料，去除大叶，保留叶柄，用洗洁精、牙刷浸泡刷洗一遍，清水冲洗1 h，晾干，将枝条剪成3-5 cm的含2-3个腋芽的茎段。

3常规灭菌，在超净工作台上用75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3次，每次1 min。

4. 2%次氯酸钠溶液加几滴Tween80，消毒6-15 min，无菌水冲洗3-4次，每次1 min。

5.用无菌滤纸吸干水分，将腋芽部分剥离，接种于无糖初代培养基上，一周后转接。

3.继代培养培养基配制同初代培养。

(1)用75%酒精处理超净工作台台面、搁板、两侧。

(2)将培养基及接种工具等放在超净工作台上，打开紫外灯灭菌30min(3)接种前用75%酒精擦拭培养皿和接种工具，再在火焰上烘烤。

实验室常用培养基的配制方法五、实验室常用培养基的配制方法Ampicillin(氨卡青霉素)(100 mg/ml)组份浓度 100 mg/ml Ampicillin配制量 50 ml配制方法 1.称量5 g Ampicillin置于50 ml离心管中。

2.加入40 ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50 ml。

3.用0.22 µm过滤膜过滤除菌。

4.小份分装(1 ml/份)后，-20℃保存。

IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(24 mg/ml)组份浓度 24 mg/mL IPTG配制量 50 mL配制方法 1.称1.2 g IPTG置于50 ml离心管中。

2.加入40 ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50 ml。

3.用0 22 µm过滤膜过滤除菌。

4小份分装(1 ml，份)后，-20℃保存。

X-Gal (20 mg/ml)组份浓度 20 mg/ml X-Gal配制量 50 ml配制方法 1.称量l g X-Gal置于50 ml离心管中。

2.加入40 ml DMF(二甲基甲酰胺)，充分混合溶解后，定容至50 ml。

3.小份分装(1 ml/份)后，-20℃避光保存。

LB培养基组份浓度 1%(W/V)Tryptone(胰蛋白胨)，0.5%(W/V)Yeast Extract(酵母提取物)，1%(W/V)NaCl配制量 1 L配制方法 1.称取下列试剂，置于l L烧杯中。

3.滴加5 N NaOH(约0.2 m1)，调节pH值至7.0。

4.加去离子水将培养基定容至1 L。

5高温高压灭菌后，4。

C保存。

LB/Amp培养基组份浓度配制量配制方法3.滴加5 N NaOH(约0.2 mL)。

调节pH值至7.0。

4.加去离子水将培养基定容至1 L。

5.高温高压灭菌后，冷却至室温。

6.加入1 ml Ampicillin(100 mg/ml)后均匀混合。

7.4℃保存。

TB培养基组份浓度配制量 1.L配制方法 1.配制磷酸盐缓；中液(0.17 M KH2PO4，0.72 M K2HPO4)100 ml。

各种培养基配方范文培养基是一种用于微生物培养的基础物质，能够为微生物提供所需的营养和环境条件。

不同的微生物在其生长过程中需要不同的养分和环境条件，因此培养基的配方需要根据微生物的需求来进行调整。

下面是几种常见的培养基配方。

1.大肠杆菌液体培养基配方：-蛋白胨或复合氮源：10g-酵母浸出物：5g-葡萄糖：1g-NaCl：5g-K2HPO4：2g-MgSO4：0.2g-pH调节至7.0后加水至1000mL2.牛心提取物琼脂糖培养基配方：-牛心提取物：3g-高级琼脂糖：15g-葡萄糖：10g-NaCl：5g-pH调节至7.0后加水至1000mL3.玉米浸出物琼脂糖培养基配方：-玉米浸出物：4g-高级琼脂糖：15g-酵母浸出物：1g-NaCl：5g-pH调节至7.0后加水至1000mL4.LB琼脂糖培养基配方：-液体LB培养基：10mL-高级琼脂糖：15g-NaCl：5g-pH调节至7.0后加水至1000mL 5.血寒养基配方：-羊血：50mL-肉浸出物：3g-酵母浸出物：3g-肉汤培养基：1L-红细胞素：5g-高级琼脂糖：3g-pH调节至7.0后加水至1000mL6.厌氧培养基配方：-肉浸出物：5g-酵母浸出物：5g-NaCl：5g-蒸馏水：900mL- 加入0.1%的L-cysteine：10mL-pH调节至7.0后用氮气替换空气注意事项：-培养基中的成分应严格按照配方比例加入，并保持无菌。

-配制好的培养基需要高温高压灭菌以保证无菌。

-不同的微生物可能对一些成分非常敏感，需要根据实际情况进行微调。

-培养基的pH值应根据微生物环境要求进行调整，一般在7.0左右。

-配好的培养基应存放在4℃的冰箱中，避免阳光直射以防止成分分解。

这只是一些常见的培养基配方，不同的微生物有不同的需求，可以根据具体的情况进行配方的调整。

在实际使用中，还需要根据微生物的特性和实验目的来选择合适的培养基。

培养基配置技术.液体培养基贮存于4c冰箱，防止光照，实验进行前放在37c水槽中温热。

1.液体培养基（加血清）存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，假设细胞生长不佳，可以再添加适量glulamine。

2.粉末培养基配制（以1升为例）：2.1.细胞培养基通常须添加10%血清，因此粉末培养基之配制体积为900 ml, pH 为7.2-7.4。

NaHCO3为另外添加，假设将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差，或局部过碱。

因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合, 然后用CO2气体调整pH,而非用强酸（HC1）或强碱（NaOH）,因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。

2.2.材料：纯水（milli-Q水或二次至三次蒸镭水，水品质非常重要），粉末培养基,NaHCO3 , 电磁搅拌器无菌血清瓶，（）.1或0.2 mm无菌过滤膜，pH计，真空泵，CO2气体步骤：2.2.1.取粉末培养基溶于700 mlmilli・Q水中,搅拌使其溶解°称取适量之NaHCO3粉末溶于200ml milli-Q水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2气体至饱和，约3-5分钟。

2.2.2.将溶解且含饱和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液体培养基中混合。

混后溶液之pH应为7.2-74除非pH值偏差太大，否那么不需用酸碱再调整之。

假设为太碱,可再通入CO2气体调整pHo培养基以真空帮浦通过过滤膜时，pH会升高以0.1或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4℃。

（血清亦可加入培养基中一起过滤）2.2.3.配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。

附-配制培养基之生长测试材料：MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)6-weil TC plate (or 35 mm TC dish)methanolglacial acetic acid10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)步骤：1.以待测试培养基培养MDCK cell,接种MDCK细胞于6-well plate (或35mm TC dish)中，每个well接种1 X 102活细胞，同时作对照组实验。

实验提供激素：2,4-D/6-BA/NAA
以下可能会用到的激素：KT，BR（油菜素内酯）
1.甘蓝型
2.0mg/L 2,4-D 出愈伤组织的概率最高，达到90% 09Y
2.对比三个不同类型0.1mg/L 2,4-D、1.0mg/L 6-BA、5.0mg/L AgNO3 愈伤组织的诱导率最高81% 植物的组织和细胞在离体培养时易产生乙烯，而乙烯对细胞的生长有毒害作用，在培养基中添加AgNO3可有效地抑制乙烯的形成
3.甘蓝型湘油14号0.3mg/L 2,4-D和3.0mg/L 6-BA
4.6-BA浓度为1.5mg/L和2.5mg/L时，子叶柄芽的再生率可达90%以上。

而NAA浓度超过0.2mg/L 时再生率会下降，超过0.5mg/L则会产生抑制。

2,4-D对于诱导愈伤组织的产生是必须的
5.0.5mg/L 2,4-D单独添加既可促进脱分化，加0.2mg/L 6-BA可以促进愈伤组织生长。

该实验结果认为KT和6-BA的作用相差不大，当其浓度在1.0-5.0mg/L，再加0.2-0,5mg/L NAA时效果更好。

6.3mg/L 2,4-D和0.2mg/L 6-BA 75%
综上，我完全不知道说什么了……还得看大家的讨论结果。

不过新的药剂除了AgNO3就没有了，因为老师提供的三种激素是最常用也是效果最好的三种。

就是感觉好像是随机组合组合就出一篇文章……再组合组合再出一篇，总之很无语。

但也有重合的数据，比如0.2mg/L 6-BA。

备注：培养基和激素母液配制方法（1）母液配制时，先向容量瓶中注入1/3定容体积的蒸馏水，再一一称取各种盐放入烧杯中溶解，装入容量瓶，不得一次称取所有盐，混合溶解！在配制大量母液时，氯化钙最后加入。

（2）200×Fe盐溶液称取1.39g FeSO4•7H2O溶于水（A液）；称取1.865 g Na2•EDTA溶于热水（B液）；将A液缓慢倒入正在加热的B液中，加水接近250ml，煮沸，混合液颜色变深，冷却到室温，定容到250ml后,置于棕色试剂瓶内4℃保存。

（3）0.5mg/ml 2,4-D母液的配法称取50mg 2,4-D，置于小烧杯内；加少量无水乙醇或95%乙醇使之完全溶解；加水定容至100ml，4℃保存。

如果出现沉淀，需要重新配置。

（4）0.5mg/ml α-NAA母液的配法称取100mgNAA置于小烧杯内；用1N的KOH溶液溶解NAA；用水定容至200m l，4℃保存。

（5）0.5mg/ml 6-BA母液的配法称取100mg 6-BA置于小烧杯中；加少量的浓盐酸，用玻棒研磨成糊状，再加入少量浓盐酸，使之完全溶解；用水稀释并定容至200ml，4℃保存。

（6）100mM乙酰丁香酮（As）的配制称取196.2mg As，用5ml DMSO直接溶解，再加水定容至10ml，过滤灭菌后，分装入无菌小管，-20℃冰冻保存。

使用前加入灭菌培养基。

（7） 0.5mg/ml KT和ABT的配法称取50mg kenetin或ABT生根粉，先用少量1N KOH溶解，再用水稀释定容至100ml，4℃保存。

（8）其他附加物的溶解及配制A、称取吗啉乙磺酸（MES）5g溶于水中，定容至10mL。

4℃保存。

B、称取1g L-半胱氨酸(Cys) 溶于2mL 0.2mol/L或10%的NaOH溶液, 用蒸馏水稀释定容至10mL，现用配制。

4℃保存。

C、称取850mg硝酸银，用蒸馏水溶解后定容至100mL。

4℃保存。

D、头孢霉素（cefotaxime）2500mg，用蒸馏水溶解后定容至10mL。