基因转移与重组体筛选和鉴定
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第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理,掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
2、学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来,构建体外重组DNA 分子的技术,了解并掌握几种常用的连接方法。
3、掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法;学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。
4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。
5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法;6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法;7、通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定,进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段,并验证重组子是期望的重组子。
二、实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列,并由此切割DNA 双链结构的酶,主要是从原核生物中分离纯化出来的。
在限制性核酸内切限制酶的作用下,侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段,而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用,则可免受限制酶的降解。
目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶,即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。
Ⅰ型酶切割位点是随机的,至少距识别位点1000bp。
Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。
Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近,而且具有序列特异性,故在基因克隆中有特别广泛的用途。
Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性:①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子,产生链的断裂;②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的;③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。
限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全,直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。
重组DNA转化及筛选实验报告引言DNA重组技术是现代生物学研究中不可或缺的工具之一,它可以将外源基因片段插入到宿主细胞的染色体中,从而实现特定基因的表达。
DNA转化是重组技术的关键步骤之一,通过电刺激或化学方法将外源DNA引入宿主细胞中。
本实验旨在通过DNA转化及筛选,构建宿主细胞中的重组DNA,并对成功转化的细胞进行筛选。
实验材料和方法材料:1. E. coli DH5α细胞2.外源质粒DNA3.LB琼脂培养基4.青霉素/链霉素抗生素5.离心管6.PCR仪7.恒温摇床方法:1.准备转化液:将50 mL LB琼脂培养基加入含有适量抗生素的离心管中,混匀。
2.取出青霉素/链霉素抗生素的冻存液,解冻后加入LB培养基中,使其浓度为最佳浓度。
3.取出冻存的E. coli DH5α细胞,放在冰上解冻。
4.加入转化液中的合适量DNA,比例为1:10(DNA:转化液)。
5.放入37℃恒温培养箱中孵育30分钟。
6.取出孵育后的细胞转化液,通过离心将细胞沉淀。
7.倒掉上清液,用适量的无菌去离子水悬浮细胞。
8.取一小部分悬浮液涂抹在含有抗生素的琼脂平板上。
9.将琼脂平板放置在37℃恒温培养箱中培养过夜。
10.检查平板上是否有菌落生长,记录结果。
11.选取生长菌落较大、菌落形态规则的菌落进行进一步筛选。
12.取一小部分菌落涂抹在新的琼脂平板上进行单克隆分离。
13.重复步骤12,直至获得纯合阳性克隆菌落。
14.提取纯合阳性菌落中的质粒DNA,进行PCR验证。
结果与讨论经过上述实验操作,我们成功地进行了重组DNA的转化和筛选。
在配制转化液时,选择适量的抗生素浓度非常重要,它可以帮助筛选出成功转化的细胞。
通过在琼脂平板上培养过夜后,我们可以观察到菌落的生长情况。
有菌落生长的平板可以说明转化成功,而没有菌落生长的平板则说明转化失败。
选取生长较大、形态规则的菌落进行进一步筛选是为了确保筛选出的细胞是单克隆的。
通过单克隆分离,我们获得了纯合阳性克隆菌落。
第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定第一节转化基因片段在体外只是一段核酸分子,是化学物质,无法表现出遗传物质的生命活性。
只有当其存在于活细胞后,生命的特征才能充分展示出来。
在分子克隆实践中,在体外操作的核酸分子只有进入细胞以后才能达到克隆的目的。
一、重组DNA分子转入原核生物细胞1. 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌转化(transformation)——重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞,并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞,而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。
(1)CaCl2处理后的细菌转化或转染A、制备感受态细胞受体细胞的细菌,经一定浓度的冰冷的 CaCl2(50~100 mmol/L)溶液处理后变成。
所谓感受态细胞,处在感受态状态的菌体有摄取各种外源 DNA的能力。
转化:感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程;转染:感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程;好的感受态细胞,每微克的超螺旋质粒DNA可得5×107个转化体。
B、细胞转化(或转染)的具体操作过程:①将处于对数期的新鲜培养物于0℃4000转/分离心10分,回收细菌细胞;②将细胞用0℃的0.1mol/L CaCl2低渗溶液处理30分钟,离心回收细胞,再用适量0℃的0.1mol/L CaCl2重悬细胞,以诱导感受态产生。
③加入适量DNA,于42 ℃热处理混合物90秒,使DNA分子被细胞吸收;④将混合物快速转到冰浴中,冷却1~2分,加入适当的培养基,在37 ℃培养45分,使细胞复苏并表达质粒所携带的转化基因;⑤通过选择培养基上平板培养,选择转化体。
⑥如果用抗菌素筛选转化体,作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。
(2)电穿孔转化法基本原理是利用高压电脉冲作用,在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔(electroporation),形成可逆的瞬间通道,从而促进外源DNA的有效吸收。
分⼦⽣物学问答题问答题第⼆章⼀、⽤于基因重组的载体需要具有哪些条件?1)具有⾃主复制能⼒,保证重组DNA分⼦可以在宿主细胞内得到扩增2)具有较多的拷贝数,易与宿主细胞的染⾊体DNA分开,便于分离提纯3)分⼦质量相对较⼩,易与操作,并能够容纳较⼤分⼦质量的⽬的基因4)具多个单⼀限制性内切酶位点,便于⽬的基因克隆5)有⼀个或多个筛选标记(如对抗⽣素的抗性、营养缺陷型或显⾊表型反应等)6)具有较⾼的遗传稳定性⼆、限制性内切酶主要分为⼏个类型?各有什么特点?限制性内切酶主要分为三种类型,即Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶。
Ⅰ型和Ⅲ型酶⼀般都是⼤的、多亚基的蛋⽩质复合物,同时具有内切酶活性和甲基化酶活性。
均需ATP ⽔解供能。
Ⅰ型酶能够识别特异的核苷酸序列,但是切割位点是随机的,Ⅲ型限制酶从距离识别位点⼀侧约25bq处单链切割DNA分⼦。
识别序列是⾮对称的,现在已知的酶数量相当少。
Ⅰ型和Ⅲ型酶在DNA重组技术中⽤处不⼤。
Ⅱ型限制性核酸内切酶只有⼀种多肽,通常以同源⼆聚体形式存在,核酸内切酶活性和甲基化作⽤活性是分开的。
⽆需ATP⽔解供能,仅需Mg2﹢参与。
具有序列特异性,可对靶DNA进⾏精确切割,在DNA 重组技术中有特别⼴泛的⽤途。
三、影响限制性内切酶作⽤的因素有哪些?DNA第底物的纯度、DNA的甲基化程度、DNA分⼦的结构、酶切反应的温度、酶切反应的时间、酶切反应的缓冲体系等四、DNA连接酶主要有哪些应⽤?1)作为DNA重组技术的重要⼯具酶,催化两个具有黏性末端或平末端的DNA⽚段5’-P和3’-OH之间形成磷酸⼆酯键,组成新的重组DNA分⼦。
2)在DNA复制中发挥接合缺⼝的作⽤,这种单链缺⼝是由复制叉上的不连续性所产⽣3)在DNA损伤修复、遗传重组、及DNA链的剪接中起缝合缺⼝的作⽤五、反转录病毒载体有哪些优点?1)具有⼴泛的哺乳动物细胞宿主2)可主动感染分裂细胞3)感染细胞后,病毒基因组反转录⽣成双链DNA,可整合到宿主染⾊体中,与染⾊体同时复制,持续表达外源基因4)基因组⾃⾝含有完整⾼效的调控元件六、腺病毒载体有哪些优点?1)可插⼊⼤⽚段外源基因,可达35kb2)宿主范围⼴,尤其⼈类是腺病毒的⾃然宿主3)不仅可感染分裂期细胞,也可感染⾮分裂细胞4)病毒滴度⾼,可达10^9-10^11pfu/ml5)可原位感染组织,如肺等6)重组载体进⼊细胞后并不整合到宿主染⾊体DNA上,⽽是游离于染⾊体外瞬时表达,安全性好七、腺病毒载体有哪些不⾜?①病毒基因组较⼤,构建载体较复杂②⼏乎可感染所有细胞,缺乏特异性③载体不发⽣整合,导致⽬的基因只能短暂表达,因此需要重复应⽤,可能诱发机体的免疫反应第三章①化学合成法已知⽬的基因的核苷酸序列,或根据基因产物的氨基酸序列推导出其核苷酸序列,可利⽤全⾃动DNA合成仪化学合成该⽬的基因。
实验九重组子的转化和筛选一. 概念1.transformation特指以质粒DNA或以它作为载体构建的重组子导入细菌的过程。
2.transfection指噬菌体、病毒或以它们作为载体构建的重组子导入细胞的过程。
3.感受态与致敏过程细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态,用理化方法诱导细胞进入感受态的操作叫致敏过程。
二.转化方法1.化学转化法细菌处于0 ℃,在CaCl2低渗溶液(0.1M)中,菌体细胞膨胀成球形,DNA 则与CaCl2形成抗Dnase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42 ℃短时间热冲击处理,促进细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增殖,重组子的基因在被转化的细菌中得到表达,在选择性培养基平板上,可选出所需的转化子。
2.电转化法取对数生长期细胞,制备一定浓度的细胞悬液(在低离子浓度状态以10%甘油制备),4℃条件下,以高压脉冲电击细胞,使细胞摄取外源DNA,电转化法不需制备感受态细菌,操作简便,适用于各种菌株的转化,其转化率可达109-1010,转化率受电场强度、电脉冲时间长度及DNA的浓度影响。
该法缺点是转化细胞受电场作用后活性受到一定影响。
3.感受态细胞及特点受体细胞处于感受态是转化成功与否的关键之一。
感受态是指细胞处于最适于摄取和容忍外来DNA的生理状态。
感受态细胞特点为:(1)细胞表面暴露出一些可接受外来DNA的位点(以溶菌酶处理,可促使受体细胞的接受位点充分暴露)。
(2)细胞膜通透性增加(用钙离子处理,可使膜通透性增加,使DNA直接穿过质膜进入细胞)。
(3)受体细胞的修饰酶活性最高,而限制酶活性最低,使转入的DNA分子不易被切除或破坏。
(4)受体细胞本身处于非生长繁殖阶段(即受体细胞染色体相对稳定)。
(5)不存在载体的筛选基因,多采用限制酶阴性、修饰酶阳性的大肠杆菌作为受体细胞。
三.筛选在转化过程中,并非每个宿主细胞都被转化,即使获得转化的细胞,也并非都含目的基因,可能含有自身形成环状的在体分子,一个载体与两个外源DNA 形成的重组子,或插入的非目的基因与载体形成的重组子等。