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第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。
2、学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。
3、掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。
4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。
5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；7、通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。
二、实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。
在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。
目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。
Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。
Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。
Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。
Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。
限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。
重组DNA转化及筛选实验报告引言DNA重组技术是现代生物学研究中不可或缺的工具之一，它可以将外源基因片段插入到宿主细胞的染色体中，从而实现特定基因的表达。
DNA转化是重组技术的关键步骤之一，通过电刺激或化学方法将外源DNA引入宿主细胞中。
本实验旨在通过DNA转化及筛选，构建宿主细胞中的重组DNA，并对成功转化的细胞进行筛选。
实验材料和方法材料：1. E. coli DH5α细胞2.外源质粒DNA3.LB琼脂培养基4.青霉素/链霉素抗生素5.离心管6.PCR仪7.恒温摇床方法：1.准备转化液：将50 mL LB琼脂培养基加入含有适量抗生素的离心管中，混匀。
2.取出青霉素/链霉素抗生素的冻存液，解冻后加入LB培养基中，使其浓度为最佳浓度。
3.取出冻存的E. coli DH5α细胞，放在冰上解冻。
4.加入转化液中的合适量DNA，比例为1:10（DNA:转化液）。
5.放入37℃恒温培养箱中孵育30分钟。
6.取出孵育后的细胞转化液，通过离心将细胞沉淀。
7.倒掉上清液，用适量的无菌去离子水悬浮细胞。
8.取一小部分悬浮液涂抹在含有抗生素的琼脂平板上。
9.将琼脂平板放置在37℃恒温培养箱中培养过夜。
10.检查平板上是否有菌落生长，记录结果。
11.选取生长菌落较大、菌落形态规则的菌落进行进一步筛选。
12.取一小部分菌落涂抹在新的琼脂平板上进行单克隆分离。
13.重复步骤12，直至获得纯合阳性克隆菌落。
14.提取纯合阳性菌落中的质粒DNA，进行PCR验证。
结果与讨论经过上述实验操作，我们成功地进行了重组DNA的转化和筛选。
在配制转化液时，选择适量的抗生素浓度非常重要，它可以帮助筛选出成功转化的细胞。
通过在琼脂平板上培养过夜后，我们可以观察到菌落的生长情况。
有菌落生长的平板可以说明转化成功，而没有菌落生长的平板则说明转化失败。
选取生长较大、形态规则的菌落进行进一步筛选是为了确保筛选出的细胞是单克隆的。
通过单克隆分离，我们获得了纯合阳性克隆菌落。
第四章基因的转移与重组体的筛选和鉴定第一节转化基因片段在体外只是一段核酸分子，是化学物质，无法表现出遗传物质的生命活性。
只有当其存在于活细胞后，生命的特征才能充分展示出来。
在分子克隆实践中，在体外操作的核酸分子只有进入细胞以后才能达到克隆的目的。
一、重组DNA分子转入原核生物细胞1. 重组质粒DNA分子转化大肠杆菌转化（transformation）——重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程。
转化不仅适合于大肠杆菌受体细胞，而且适合于枯草杆菌和蓝藻等其他原核生物以及酵母等低等真核生物受体细胞。
（1）CaCl2处理后的细菌转化或转染A、制备感受态细胞受体细胞的细菌，经一定浓度的冰冷的 CaCl2（50～100 mmol／L）溶液处理后变成。
所谓感受态细胞，处在感受态状态的菌体有摄取各种外源 DNA的能力。
转化：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达质粒载体DNA分子的生命过程；转染：感受态的大肠杆菌细胞捕获和表达噬菌体DNA分子的生命过程；好的感受态细胞，每微克的超螺旋质粒DNA可得5×107个转化体。
B、细胞转化（或转染）的具体操作过程：①将处于对数期的新鲜培养物于0℃4000转/分离心10分，回收细菌细胞；②将细胞用0℃的0.1mol/L CaCl2低渗溶液处理30分钟，离心回收细胞，再用适量0℃的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，以诱导感受态产生。
③加入适量DNA，于42 ℃热处理混合物90秒，使DNA分子被细胞吸收；④将混合物快速转到冰浴中，冷却1~2分，加入适当的培养基，在37 ℃培养45分，使细胞复苏并表达质粒所携带的转化基因；⑤通过选择培养基上平板培养，选择转化体。
⑥如果用抗菌素筛选转化体，作为对照的受体菌应该在此培养基上不生长。
（2）电穿孔转化法基本原理是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔（electroporation），形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。
