分子生物学

对技术进行改进
2. Sanger法的技术改进 法的技术改进
得益于两项科学进展： 1）PCR技术 2）荧光染料
钱永健，华裔科学家 2008年获诺贝尔化学奖
Kary Mullis 1983年获诺贝尔化学奖 年获诺贝尔化学奖 唯一在公司工作获诺奖的人
全自动激光荧光 全自动激光荧光DNA测序
原理基于sanger双脱氧法， ，第一代测序技术，应用 十分普遍。 实现制胶，进样，电泳，检测数据分析全自动化 检测数据分析全自动化。 测序长度可以超过1000bp， ，准确率可达到99.999%
3’-5’磷酸 二酯键
不能与下一个脱氧 核苷酸结合!
Ø背景知识----DNA的复制 的复制
DNA聚合酶 聚合酶 Template Primer New strand
•在DNA合成过程中获得DNA DNA的序列信息
DNA合成时加入了标记的核苷酸 合成时加入了标记的核苷酸
也就是说： •新链是可以在合成过程中 进行可视性标记
Southern印迹杂交 Northern印迹杂交 核酸分子杂交分析 点杂交 基因芯片技术 Northern Blot RT­PCR
基因的量的分析
实时PCR
常用的分子生物学技术 常用的分子生物学技术小结
方法 DNA测序 核酸分子杂交 实时-PCR 基因芯片 优点与问题 是最精确的方法 操作繁琐 操作繁琐，特异性高 灵敏度 灵敏度、特异性高、成本高 效率高 效率高，成本高
第三步：硫酸化酶催化APS和PPI PPI形成等摩尔的ATP, ATP 驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素转化 驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素转化。（产生 的荧光强度与结合的核苷酸成正比 的荧光强度与结合的核苷酸成正比） 第四步：ATP和多余的dNTP被双磷酸酶降解 被双磷酸酶降解，淬灭光信号， 开始新一个循环。
DNA DNA序列测定
DNA sequencing DNA
DNA序列测定（DNA sequencing DNA sequencing ）
基因的一级结构是指脱氧核苷酸的排列顺序，解 基因的一级结构是指脱氧核苷酸的排列顺序 析一级结构最精确的技术就是 析一级结构最精确的技术就是DNA测序.
DNA测序技术 测序技术
Born: 13 Aug 1918 Died:19 Nov 2013 (aged 95)
主要内容 主要内容：
Ø基本原理 Ø技术改进 Ø测序结果分析 Ø应用
双脱氧末端终止法测序的基本原理 Ø背景知识---单核苷酸的结构 单核苷酸的结构
单脱氧核苷酸（dNTP)
A T C G
双脱氧核苷酸(ddNTP)
第五步：随着以上过程循环进行 随着以上过程循环进行，互补DNA链合成，DNA序 列由信号峰确定。 看一下视频
关键点
Ø dATP需要选择替代物 dATPS dATP的结构与ATP相似，能与荧光素反应发出荧光 能与荧光素反应发出荧光。 Ø 三磷酸腺苷双磷酸酶使测序能循环进行 使测序能循环进行，因为每加一 种dNTP时必需除去上一次未反应的 除去上一次未反应的dNTP。
ATP 硫酸化酶 PPi+ 磷酸化硫酸腺苷 (APS)—————————> ————————— 荧光素酶，ATP 荧光素 —————————> 氧化荧光素
ATP
焦磷酸测序的原理
引物与模板退火后，在四种酶及两种底物的协同作用下 在四种酶及两种底物的协同作用下，每加一个dNTP 就产生一次荧光信号，通过检测荧光信号来记录模板 通过检测荧光信号来记录模板DNA的核苷酸序列。
• 四色荧光法
DNA测序仪：其实它就是将测序 其实它就是将测序PCR产物进行PAGE，电泳时激 发出四色荧光，并进行软件分析 并进行软件分析。
自动化的毛细管电泳
测序结果分析
•序列准确性（正常）---可以测 可以测1000bp左右
出现异常结果 同一位置出现双峰：—单核苷酸多态性 单核苷酸多态性
MOVIE
基本原理小结
1.在DNA合成过程中掺 入双脱氧核苷酸使新 链延伸终止于链的末 端 2. 获得在任何一个核 苷酸上随机终止的一 系列长度不同的DNA片 段。 3.变性聚丙烯凝胶电 泳分辨仅差一个核苷 酸长度的DNA片段
Sanger双脱氧末端终止法 双脱氧末端终止法 Ø缺点：
• 模板浓度低，模板不纯 • 手工测序，放射自显影条带较宽 放射自显影条带较宽，读序列困难 • 泳道间迁移率有差异，对测序的精确性有一定的影响 对测序的精确性有一定的影响
药物的敏感性：为什么有的肿瘤患者对化疗药敏感，有的人不敏感？ 为什么有的肿瘤患者对化疗药敏感 单核苷酸多态性
² 单核苷酸多态性(SNP)：主要是指在基因组水平上由单个核 主要是指在基因组水平上由单个核 苷酸的变异所引起的DNA序列多态性 序列多态性。
抑癌基因K­ras ras SNP位点的检测
K-ras正常基因的患者对特罗凯药敏感 敏感； 突变基因的患者对某些抗肿瘤药不敏感 不敏感,反而会加快肿瘤细胞的生长。
第一代：Sanger法测序技术 Maxam-Gilbert Gilbert测序技术 第二代：焦磷酸测序技术 单分子合成测序技术 第三代：实时单分子测序技术 实时单分子测序技术 杂交-连接纳米球测序技术 连接纳米球测序技术 第四代：单细胞测序技术等
一、Sanger Sanger测序技术
又名： 要内容：
Ø基本原理 Ø基本过程 Ø结果分析 Ø在分子诊断中的应用
什么是焦磷酸？
提问:先回忆一下什么是ATP? ATP ATP? ATP 是怎么水解的？
ATP 水解实际上是指ATP分子中 高能磷酸键的水解。
ATP
ADP +磷酸盐
AMP+磷酸盐
AMP+2分子磷酸盐（P~P) 分子简式：A—P～P～P
举例说明1： 应用焦磷酸测序法检测纯合子和杂合子
SNP 182A/G
举例说明2： 应用焦磷酸测序法检测基因的甲基化
Ø基因的甲基化
CpG二核苷酸的胞嘧啶 添加了甲基基团
Ø基因的甲基化与肿瘤有密切的关系 基因调控区CpG 岛处于非甲基化的状态，当细胞发出癌变 岛处于非甲基化的状态 后，这些CG区域往往呈甲基化状态 区域往往呈甲基化状态。
焦磷酸
什么是焦磷酸？
DNA聚合酶在合成DNA的时候可产生焦磷酸 的时候可产生焦磷酸。
dTTP
5’ 5’ Extension
3’
A
5’
3’
5’
—每延长一个核苷酸就会生成一个焦磷酸
测序时如何检测焦磷酸的产生 测序时如何检测焦磷酸的产生？
通过一系列酶促反应将焦磷酸变成氧化荧光 通过一系列酶促反应将焦磷酸变成氧化荧光（可视性）
ØPCR扩增模板
在PCR反应体系中，如果只加入一条引物是什么样子的结果 如果只加入一条引物是什么样子的结果？
• 单引物只能扩增单链DNA • 扩增的包含引物的单链DNA
Ø 四色荧光法
荧光标记四种ddNTP，只需做一个反应 只需做一个反应。
赋予DNA片段4种 不同的颜色
。
一个样品的4个反应产物 可在同一泳道内电泳
Ø 每一个循环生成的的ATP必须被双磷酸酶降解 必须被双磷酸酶降解.
技术流程
多孔测序，一次可检测 96个样本
（三）焦磷酸测序的结果分析 焦磷酸测序的结果分析
结果分析
序列：TGGCCGGGTCACGAGGCCCTA
• 横坐标：掺入dNTP的顺序 • 纵坐标：荧光信号的值：（峰高与掺入的核苷酸数量成正比 峰高与掺入的核苷酸数量成正比）
Sanger双脱氧末端终止法测序原理 双脱氧末端终止法测序原理
一个反应
DNA pol
合成一系列长短不同的以G为结尾的 为结尾的DNA片段
Sanger双脱氧末端终止法原理 双脱氧末端终止法原理
四个反应
Sanger双脱氧末端终止法原理 双脱氧末端终止法原理
区分不同大小DNA片段 --聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( PAGE) A C G T 泳道上长短不同的寡核 苷酸片段在变性聚丙烯 凝胶中泳动的距离不同
焦磷酸测序分析基因突变，SNP SNP的方法！ 实时PCR、基因芯片是定量分析基因的最 基因芯片是定量分析基因的最好方法！是非常实 用的几种常规技术。
（三）焦磷酸测序在分子诊断中 焦磷酸测序在分子诊断中 的应用
焦磷酸测序的应用
特点：检测已知序列，测序长度大约在 测序长度大约在20-150bp。 应用:
Ø 细菌和病毒等微生物分型鉴定 鉴定 Ø 疾病相关基因序列的突变位点 位点 Ø 基因CpG甲基化的分析 Ø 单核苷酸多态性位点（SNP SNP)分析 Ø 等位基因频率测定 焦磷酸测序是一 种可行的方法
K-ras sequence to analyze: GGTGGCGTAGG
K-ras是一种抑癌基因， K-ras突变患者对某些抗肿瘤药不敏感 突变患者对某些抗肿瘤药不敏感。 患者的SNP检测可以指导医生临床用药 检测可以指导医生临床用药。 ------指导医生临床用药
SNP等位频率的检测
检测SNP的等位频率：如需要检测 如需要检测 K­ras SNP位点的等位频率
利用焦磷酸测序检测DNA甲基化的步骤及结果分析 甲基化的步骤及结果分析 Ø步骤
5’甲基胞嘧啶 在亚硫酸盐的作用下变成胸腺嘧啶
Ø结果
焦磷酸测序可在一次检测中快速定量一个或多个甲基化位点， 焦磷酸测序可在一次检测中快速定量一个或多个甲基化位点 以及每个位点的甲基化程度。 。
举例说明3： 应用焦磷酸测序法检测SNP位点并分 应用焦磷酸测序法检测 析SNP的频率。
A 61.7%/T 30.3%
上千份来自不同个 体的基因组样品
只需做一次PCR，进行一次焦磷酸测序 进行一次焦磷酸测序，即可分析该SNP在这 些样本中的频率。