凝 胶 色 谱 分 析
二〇一一年九月九日 1 第九章 凝胶色谱分析
凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography, GPC），又称尺寸排阻色谱（Size Exclusion
Chromatography, SEC），其以有机溶剂为流动相，流经分离介质多孔填料（如多孔硅胶或多孔树脂）而实现物质的分离。GPC可用于小分子物质和化学性质相同而分子体积不同的高分子同系物等的分离和鉴定。凝胶渗透色谱是测定高分子材料分子量及其分布的最常用、快速和有效的方法[1]。凝胶渗透色谱（GPC）的创立历程如下[2,5]：
1953年Wheaton和Bauman用多孔离子交换树脂按分子量大小分离了苷、多元醇和其它非离子物质，观察到分子尺寸排除现象；1959年Porath和Flodin用葡聚糖交联制成凝胶来分离水溶液中不同分子量的样品；1964年J. C. Moore将高交联密度聚苯乙烯-二乙烯基苯树脂用作柱填料，以连续式高灵敏度的示差折光仪，并以体积计量方式作图，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱。
近年来，光散射技术（如图9-1所示，一束光通过一间充满烟雾的房间，会产生光散射现象。）广泛应用于高分子特征分析领域[3]。将光散射技术和凝胶渗透色谱（GPC）分离技术相结合，可以测定大分子绝对分子量、分子旋转半径、第二维里系数，也可测定分子量分布、分子形状、分枝率和聚集态等。目前，该技术在高分子分析领域已成为一种非常有效的工具，在美国，日本及欧洲广为使用，国内近年来亦引进了此项技术。
入射光
散射光
图9-1光散射现象
9.1 基本原理
9.1.1 凝胶渗透色谱分离原理
让被测量的高聚物溶液通过一根内装不同孔径的色谱柱，柱中可供分子通行的路径包括粒子间的间隙（较大）和粒子内的通孔（较小）。如图9-2、图9-3所示，当待测聚合物溶液流经色谱柱时，较大的分子只能从粒子间的间隙通过，被排除在粒子的小孔之外，速率较快；较小的分子能够进入粒子中的小孔，通过的速率慢得多。这样经过一定长度的色谱柱分离后，不同相对分子质量的物质就被区分开了，相对分子质量大的在前面流出（其淋洗时间短），相对分子质量小的在后面流出（淋洗时间长）。从试样进柱到被淋洗出来，所接受到的淋出液总体积称为该试样的淋出体积。当仪器和实验条件确定后，溶质的淋出体积与其分 2 子量有关，分子量愈大，其淋出体积愈小[7]。
凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、疏水层析的洗脱条件
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凝胶过滤层析的原理
凝胶过滤层析是一种常见的生物化学实验技术，它基于生物大分子在凝胶中的分子大小差异而进行分离和纯化。本文将介绍凝胶过滤层析的原理及其在生物化学实验中的应用。
首先，我们来了解一下凝胶过滤层析的原理。凝胶过滤层析是利用凝胶作为分离介质，根据生物大分子在凝胶孔隙中的大小排列顺序进行分离的一种技术。凝胶通常是一种多孔性材料，可以是琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。生物大分子在凝胶孔隙中的排列受到分子大小的影响，分子越大，在凝胶中的孔隙中运动受到的阻力越大，因此移动速度越慢，分子越小，移动速度越快。通过这种原理，可以实现生物大分子的分离和纯化。
凝胶过滤层析在生物化学实验中有着广泛的应用。首先，它可以用于蛋白质的分离和纯化。蛋白质是生物体内重要的大分子，具有多种功能。在研究蛋白质的功能和结构时，需要对蛋白质进行分离和纯化。凝胶过滤层析可以根据蛋白质的大小差异，将不同大小的蛋白质分离开来，达到纯化的目的。其次，凝胶过滤层析还可以用于核酸的分离和纯化。核酸是生物体内的遗传物质，研究核酸的结构和功能对于理解生命活动具有重要意义。凝胶过滤层析可以根据核酸的大小差异，将不同大小的核酸分离开来，实现纯化。此外，凝胶过滤层析还可以用于糖类、多肽等生物大分子的分离和纯化。
除了在生物化学实验中的应用，凝胶过滤层析还在生物制药、生物技术等领域有着重要的应用价值。例如，在生物制药中，需要对蛋白质药物进行分离和纯化，以确保药物的纯度和活性。凝胶过滤层析可以实现对蛋白质药物的纯化，为生物制药提供了重要的技术支持。在生物技术领域，凝胶过滤层析可以用于基因工程、蛋白质工程等技术的研究和应用，为生物技术的发展提供了重要的实验手段。
综上所述，凝胶过滤层析是一种重要的生物化学实验技术，它基于生物大分子在凝胶中的分子大小差异进行分离和纯化。在生物化学实验、生物制药、生物技术等领域都有着重要的应用价值。通过对凝胶过滤层析原理的深入理解和实验技术的掌握，可以为生物化学研究和生物产业的发展提供重要的支持。
凝胶过滤法原理
凝胶过滤法是一种常用的分子分离方法，主要用于分离和分析生物大分子，如蛋白质、核酸和多肽等。凝胶过滤法是一种基于分子大小的分离方法，利用分子在凝胶中的深度穿透程度来分离分子大小不同的物质。本文将详细介绍凝胶过滤法的原理、操作步骤、优缺点以及应用领域。
一、凝胶过滤法原理
凝胶过滤法是一种分子尺寸分离的方法，属于分子筛分离方法。其原理是通过凝胶微球的孔径大小来实现对分子进行分离。凝胶微球的孔径大小与其交联程度及交联剂浓度有关，一般来说，交联程度越高，孔径越小，分子的分离效果就越好。凝胶过滤法的操作步骤如下：
1. 凝胶材料的制备：根据需要分离的分子大小选择合适的凝胶材料，如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等。制备时需要根据实验要求控制凝胶的交联程度和孔径大小，并进行脱氧处理以去除残留的殉使剂。
2. 凝胶柱的制备：将制备好的凝胶注入柱体中，制备凝胶柱。凝胶柱的长度和直径应根据实验需要进行选择。凝胶柱的前端和后端各设置一个过滤器，以保持凝胶柱内部的凝胶均匀分布。
3. 样品的预处理：根据实验需要，对待分离样品进行预处理，如去除蛋白质中的盐、重组蛋白中的肽、除去核酸样品中的杂质等。预处理的方法包括低速离心、热处理、加盐沉淀、酸性沉淀、甲醇沉淀等。
4. 样品的注入：将预处理好的样品注入凝胶柱中，根据实验需要调整注入速度和量，并在实验过程中保持凝胶柱内部湿润。
5. 柱洗脱液的选择：根据分离物的性质和实验要求选择合适的柱洗脱液，如生理盐水、磷酸盐缓冲液、硝酸盐缓冲液等，逐一加入凝胶柱中。
6. 分离物的收集：收集不同分子大小的分离物，根据需要进一步进行分析、纯化、测定样品的组成和浓度等。
凝胶过滤法有许多优势，如不需要高压，适用范围广，简单易操作，分离效果好，分离物得到的样品污染小等。它也有一些缺点，如无法分离小分子物质，分子大小分离效果有限，凝胶材料存在的自由基和殉使剂会对样品产生影响等。
