PCR实验室工作流程

1 PCR 实验操作流程（TB/LP/MPCP ）一、标本的核酸提取（痰标本）1、痰液液化：痰液加入四倍体积的4%NaOH ，摇匀静置30min ；（样本编号，离心管编号）2、将液化后的液体0.5ml 转至1.5ml 离心管中，再加入0.5ml 4%NaOH ，混匀静置10min 继续液化，13000rpm 离心5min ，去上清；3、加入1ml 生理盐水洗一次，振荡器震荡混匀，13000rpm 离心5min ，上清去除干净；4、沉淀直接加入100μl 核酸提取液（提取液使用之前混匀），混匀数秒，干热仪100℃加热10min ，然后13,000rpm 离心5min ，取上清4μl 作为PCR 反应模板。

二、试剂配制、加样三、PCR 扩增设置扩增循环参数设置：37℃×2min ，94℃×2min ，循环一次；93℃×15s ，60℃×60s ，循环40次，荧光检测在60℃×60s ，荧光通道FAM 和VIC 通道。

反应体系40μl 。

四、结果判断MPCP ：FAM 通道Ct ≤38，报告MP 为阳性；VIC 通道Ct ≤38， 报告CP 为阳性；如果Ct 值在38-40之间，复检一次，如果Ct 显示仍在38~40之间，则判断为低于检测线，判为阴性LP ：FAM 通道Ct ≤38，报告LP 为阳性；如果Ct 值在38-40之间，复检一次，如果Ct 显示仍在38~40之间，则判断为低于检测线，判为阴性TB ：FAM 通道Ct ≤38，报告TB 为阳性；如果Ct 值在38-40之间，复检一次，如果Ct 显示仍在38~40之间，且扩增曲线呈典型的S 型，则判断为阳性；若非典型S 型曲线，则判断为低于检测线，判为阴性。

pcr实验室操作流程PCR实验室操作流程。

PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。

它是一种重要的实验手段，广泛应用于基因克隆、基因检测、DNA测序等领域。

下面将介绍PCR实验室的操作流程，希望能够对初学者有所帮助。

1. 实验室准备。

在进行PCR实验之前，首先需要准备好实验室所需的各种试剂和设备。

确保PCR工作台表面清洁，使用紫外线消毒工作台。

准备好PCR试剂盒、PCR管、PCR仪、蒸馏水、DNA模板等。

2. 反应体系设计。

根据实验需要设计PCR反应体系，包括引物、模板DNA、缓冲液、酶和核苷酸。

确保反应体系中各组分的浓度和配比符合实验要求，避免出现反应体系不稳定或者无法扩增的情况。

3. PCR反应设置。

将设计好的PCR反应体系分装到PCR管中，注意避免气泡的产生。

在加盖后进行离心，确保反应体系均匀混合。

将PCR管放置于PCR仪中，设置好反应程序和温度，启动PCR反应。

4. PCR反应后处理。

PCR反应结束后，取出PCR管，检查反应体系是否正常。

将PCR 产物进行电泳检测，确认扩增片段的大小和纯度。

根据需要，可以进行DNA提取、测序或者下一步的实验操作。

5. 实验室清洁。

实验结束后，及时清洁PCR工作台和PCR仪，避免污染下一次实验。

将实验台面和设备用75%乙醇擦拭消毒，保持实验室的整洁和卫生。

以上就是PCR实验室操作流程的简要介绍，希望能够对初学者有所帮助。

在进行PCR实验时，需要严格按照操作流程进行，避免出现污染或者错误的情况。

同时，注意实验室安全和个人防护，确保实验过程安全顺利进行。

PCR技术的应用范围广泛，掌握PCR实验室操作流程对于科研工作者来说是非常重要的基本技能。

希望大家能够在实验操作中熟练掌握PCR技术，为科研工作的顺利进行提供有力支持。

qPCR实验操作流程`Q-PCR实验流程一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。

②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。

③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。

取完EP管/枪头后，袋子及时封好。

④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。

⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。

二、总RNA抽提1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS 吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min；组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称）2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致）3）4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层）4）,5）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min；6）4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀），去上清；7）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。

PCR实验室工作流程
PCR实验室工作流程
样本接收
1. 应在四区之外的地方接收样本。

2. 样品的标识应据可追溯性，实验室不应接受缺乏正确标识和不符合检测规定的样品。

3. 进行样品登记，根据实验安排，处理或储存样品。

样本接收记录详实可靠，接收人和送样人同时签字方为有效。

4. 样本接收记录详实可靠，接收人和送样人同时签字方为有效。

实验操作
1. 严格按照试剂准备区、标本制备区、扩增区、产物分析区的顺序单方向进行实验操作。

2. 各区域所使用的手套、帽子、实验服等各自独立，不能混穿。

3. 严格按照基因检测操作规程进行实验和使用仪器设备，定期检测、校正并作好记录工作。

4. 工作结束后必须立即消毒实验室台面，并用紫外灯照射实验室。

做好医废处理。

pcr实验操作流程及注意事项
哎呀呀，PCR 实验可真是个精细活儿！要想把这个实验做好，操作流程和注意事项可得牢记在心呀！
首先，准备工作得一丝不苟。

各种试剂、仪器都要准备齐全，就像战士上战场前要检查好装备一样。

然后，样品处理可不能马虎哟！得小心翼翼地提取样本中的核酸，这一步就如同在沙堆里寻找金子，需要耐心和细心。

接着，进行PCR 反应的设置，试剂的添加量要精准无误，温度和时间的设置更是关键。

嘿，这可不像随意做菜加盐，多一点少一点都不行呀！
反应过程中，要密切关注仪器的运行状态，稍有异常就得赶紧处理，千万别等到出了大问题才着急。

扩增完成后，产物的检测也不能掉以轻心哇！要确保检测方法准确可靠，不然前面的努力不都白费啦！
再说说注意事项。

实验环境得保持清洁无菌，不然杂菌会捣乱的呀！操作过程中要防止交叉污染，这就好比不能让不同的河流混在一起。

还有，试剂的保存要严格按照要求来，过期的试剂可不能用，就像过期的食品不能吃一样。

实验人员自身也要做好防护，保护自己的同时也是保证实验的准确性。

哇塞，PCR 实验可不简单，但只要严格按照流程，注意每一个细
节，就能取得成功，为科学研究贡献有价值的结果呀！
总之啊，PCR 实验操作流程和注意事项一定要牢记，这可不是闹着玩的，要以严谨的态度对待，才能得出可靠的实验结果哟！。

pcr的实验流程及注意事项嘿，搞科研的小伙伴们！今天咱们来唠唠pcr这个超重要的实验的流程及注意事项呀！这pcr实验啊，就像一场精密的魔法之旅呢！先说说实验流程吧。

第一步，那肯定是要准备好样本啦，这样本就像是pcr魔法的原材料，必须精心挑选，确保它的质量呀，啧，可不能随随便便拿个样本就开始呢。

然后呢，得把各种试剂都准备好，像什么引物啦，Taq酶啦，dNTP啦，这些可都是这场魔法的关键道具呢。

接着，就到了配置反应体系的时候啦。

这一步可得小心谨慎，就像在搭建一座精密的小城堡。

各种试剂的量都得按照比例来，多一点少一点都可能影响整个pcr的结果呢，这可不像做饭，调料多点少点可能只是味道有点差别。

把反应体系配置好后，就可以把它放到pcr 仪里面啦，这pcr仪就像是一个魔法小盒子，能让样本在里面发生神奇的变化。

然后咱们再来说说注意事项呀。

在准备样本的时候，一定要避免样本被污染哦，要是样本被污染了，那这pcr实验就像被施了坏魔法一样，结果肯定不对啦。

这就好比你在做蛋糕的时候，不小心把脏东西混进去了，那蛋糕能好吃吗？还有啊，配置反应体系的时候，加试剂一定要准确无误，可不能手抖。

而且呀，pcr仪的参数设置也很关键呢，温度、时间这些参数就像是魔法咒语，错了可不行。

再就是，在整个实验过程中，要保持实验室的清洁，这就像保持魔法场地的纯净一样。

如果实验室里乱糟糟的，到处都是灰尘或者其他杂质，那很可能就会干扰pcr实验的结果。

这就像在一个嘈杂的环境里想要安静地读书一样困难。

哎呀呀，pcr的实验流程和注意事项可真的要牢记于心呢。

咱们做实验的，只有严格按照流程走，注意每一个小细节，才能让pcr实验顺利进行，得到准确的结果呀。

这就像要登上山顶，每一步都要踩稳踩扎实一样。

千万不能马虎大意，不然之前的努力可就都白费啦。

咱们一定要像对待宝贝一样对待pcr实验，这样才能在科研的道路上不断前进，探索更多的奥秘呢！。

pcr三个步骤（pcr技术三大步骤）本文介绍了PCR的详细操作流程，强调了实验中的注意事项，列举了常用缓冲液的配方。

帮助我们在理解实验的基础上更顺利的操作。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外合成双链DNA的一种方法，其原理类似于天然DNA的复制过程，其特异性主要依赖于与其目的片段两端互补的特异引物和高特异性的酶（热启动酶）。

典型的PCR反应有三个步骤：变性，退火，延伸，经过多次循环反应，获得目的片段。

1.DNA模板2.特异性引物3.dNTP Mix4.PCR buffer5.热启动酶1.配置反应体系将各成分依次加入到0.5ml的离心管中扩增使用热启动酶，可在常温下操作，非热启动型的酶要在低温配置反应体系。

2.按照试剂盒说明书设置反应时间和温度，扩增结束后电泳鉴定3.琼脂糖核酸电泳·将电泳所用器具蒸馏水洗净，架好梳子·根据要分离的DNA片段大小制备合适浓度的琼脂糖凝胶，准确称取一定的琼脂糖加入到锥形瓶中，加入30ml左右的电泳缓冲液（TAE或TBE）·在微波炉中加热融化后冷却至40℃左右，充分混匀后倒入电泳槽中·室温下凝固40分钟左右，小心拔出梳子，将凝胶放置电泳槽中准备点样·在电泳槽中加入电泳缓冲液，漫过凝胶表面即可，点样孔内不要有气泡·样品点样前准备好，（在八连管中）加入5ul样品，1ul的6xLoding buffer和1ul的染料混合，用抢将混合后的样品缓缓注入到点样孔中，注意不要串孔·按照正负极（红正黑负），接通电源，电压40-60V，时间30-40min，可根据溴酚蓝的位置判断是否终止电泳·电泳结束，关闭电源，凝胶成像观察，并对比marker确定片段大小不同的琼脂糖浓度分离不同大小的DNA片段：引物引物是决定PCR反应成败的关键，要保证扩增的准确、高效，引物的设计要遵循如下原则：1.引物的设计在cDNA的保守区域，在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析的软件，得到不同基因相同的序列就是该基因的保守区2.引物的长度：15-28bp，长度大于38bp，会使退火温度升高，不利于普通Taq酶的扩增3.引物GC含量在40%-60%，Tm值最好接近72℃4.因密码子的简并性，引物的3’端最好避开密码子的第三位（最好为T）5.碱基分布错落有致，3’端不超过3个连续G或C6.引物自身不要形成发夹结构，引物设计完成，要BLAST验证模板PCR扩增对模板的要求不高，单链、双链DNA均可作为扩增片段，虽然PCR能够扩增微量的DNA，为了保证扩增的特异性，对不同来源的模板，起始浓度有一定要求，如下：模板可以是纯化后的样品也可以是粗制品，不同来源的模板采取不同的处理方法，实验模板的纯化越简单越好，但模板中如果含有任何的Taq酶抑制剂、蛋白酶、核酸酶等，会干扰反应。

pcr实验基本流程PCR实验就像是一场微观世界里的奇妙旅程，那我就来给你唠唠它的基本流程吧。

一、准备工作。

PCR实验开始之前啊，就像我们出门旅行要准备行李一样，得把东西都准备齐全喽。

咱得有模板DNA，这可是主角，就像一场演出里的大明星。

然后呢，要有引物，引物就像是给DNA这个大明星带路的小向导，能带着反应找到要复制的特定区域。

接着就是DNA聚合酶啦，这个酶就像是一个超级工匠，负责把新的DNA链一点点搭建起来。

还有dNTP，这就像是盖房子用的砖头，是构建新DNA链的基本材料。

缓冲液也不能少，它就像是一个舒适的工作环境，能让整个反应顺利进行。

二、反应体系的配制。

好啦，东西都齐了，就开始配反应体系了。

这就好比是在做一道超级精密的料理。

把适量的模板DNA、引物、DNA聚合酶、dNTP还有缓冲液按照一定的比例混合在一起。

这个比例可不能乱哦，就像做蛋糕的时候，面粉、糖、鸡蛋的比例要是不对，那蛋糕可就做失败了。

要是模板DNA放太多了，可能会导致反应太复杂，容易出错；要是引物放少了呢，就像小向导不够用，找不到要复制的地方。

所以啊，得小心翼翼地按照规定的量来放这些东西。

三、PCR反应过程。

接下来就是PCR反应啦。

这个反应有三个阶段，就像一场音乐会有三个乐章似的。

1. 变性。

第一个阶段是变性。

这时候啊，就把反应体系加热到大概90 - 95℃，这个温度下，DNA双螺旋结构就像两个紧紧拥抱的好朋友突然被分开了，变成了两条单链。

这就像是把一个缠绕在一起的绳子解开，这样后续才能在单链上进行复制工作呢。

2. 退火。

然后就是退火阶段啦。

把温度降低到50 - 65℃左右，这个时候引物就会跑过来，跟单链DNA按照碱基互补配对原则结合。

就像小向导找到了自己要带领的路，紧紧地贴上去了。

这个温度很关键，如果温度不合适，引物就可能结合不好，那整个反应就可能跑偏啦。

3. 延伸。

最后就是延伸阶段。

把温度再升高到70 - 75℃，这时候DNA聚合酶就开始大显身手了。

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PCR实验室操作流程⼀、INFORMATIONFORTEST检测信息⼆、ANALYTICALPRINCTPLE检测原理聚台酶链式反应(PCR〕可对特定核苷酸⽚段进⾏指数级的扩增，⽽实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加⼊荧光基团，利⽤荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进⾏定量分析的⽅法。

在实时荧光定量PCR 反应中，引⼊了⼀种荧光化学物质，荧光物质有两种：荧光探针和荧光染料。

我们⽬前是使⽤TaqMan荧光探针的检测原理：PCR扩增时在加⼊⼀对引物的同时加⼊⼀个特异性的荧光探针，该探针为⼀寡核苷酸，两端分别标记⼀个报告荧光基团和⼀个淬灭荧光基团。

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’⼀3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从⽽荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增⼀条DNA链，就有⼀个荧光分⼦形成，荧光信号强度也等⽐例增加（图⼀）。

这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从⽽得到⼀条荧光扩增曲线图。

三、操作步骤（⼀）试剂配制1、进⼊试剂准备区，开启冰箱冷冻层取出HBV-DNA检测试剂盒。

查看外包装盒(包括⽣产批号、有效期)，⽆误后拆开试剂盒，取出核酸提取液、反应液及Taq酶(核对核酸提取液、HBVPCR反应液及Taq酶管上批号与试剂外包装盒批号是否⼀致)（图1），不⼀致则不可使⽤，需更换新的试剂。

室温平衡20min，完全融化后2000rpm离⼼备⽤。

2、核酸提取液的分装（1）取离⼼管架置于超净⼯作台内(开机前⽤紫外线消毒30分钟)，⽤右⼿拿起镊⼦逐个将离⼼管放⼊离⼼管架（注意应夹住离⼼管外壁，不能碰到管内壁)，摆放顺序为横列从左往右摆，竖列为从上往下隔⾏排，离⼼管个数为n(n=样本数+对照品+质控品)。

完成后将镊⼦放回原位（图2）。

（2）⽤移液器准确吸取核酸提取液50ul分装⾄离⼼管中(左上⾓第⼀排开始，从左住右依次加⼊）。