ELISA完全总结
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ELISA缓冲液配方
书中ELISA封闭液：含5%脱脂奶粉或者5%BSA的PBS，请问5%BSA指的也是质量分数吗？，因为师姐笔记写的是体积分数，网上查了查也没弄清楚，请指教。
样品稀释液可以直接就用PBS稀释吗？文献上提到稀释液中也含脱脂奶粉或BSA，请指教PBST中吐温-20的体积分数为0.05%，这个含量是固定的吗？1.含5%脱脂奶粉或者5%B SA的PBS，5%BSA用质量分数即可；
2.样品稀释液一般可以用洗液直接稀释，也可加入一些蛋白（如脱脂奶粉或BSA）或牛、兔等血清，要根据你的试验而定；
3.至于PBST中吐温-20的体积分数，可以0.05%—0.2%，可以在你试验过程中摸索。
4.提供一般科研用简单配方，这些你都可以在网上或别人的文章中查到，仅供参考：
洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M
KH2PO4 0.2克
Na2HPO4·12H2O 2.9克
NaCl8.0克
KCl0.2克
Tween-200.05％0.5ml
加蒸馏水至1000ml
封闭液：
牛血清白蛋白(BSA) 5克
加洗涤缓冲液至100ml。
稀释液：
牛血清白蛋白(BSA) 1克
加洗涤缓冲液至100ml
或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。
BSA最好现配，价格又比脱脂奶粉贵，所以宜少量现用现配！
BSA一般是质量体积比，正如楼上所说，1%～3%为宜，如果实在是结果假阳性多，可加到5%！
TBST中吐温的浓度与你的洗涤强度（洗涤次数，洗涤时间，振荡幅度）有关，需要按实验数据来变化！
一、操作步骤
用于检测未知抗体的间接法
1.包被：用0.05MpH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗原稀释至蛋白质含量为
1~10µg/mL。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1mL，37℃温育2小时。
弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
（简称洗涤，下同）
2.封闭：间接法测定中，封闭一般是不可少的，最常用的封闭剂是0.05%-0.5%
的牛血清白蛋白，每孔中加0.1 mL，37℃温育1-2小时，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
（同时做空白孔、阴性对照孔及阳性对照孔）
3.加样：加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1 mL于上述已包被之反应孔中，
置37℃孵育1小时。
然后用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
（同时做空白孔、阴性对照孔及阳性对照孔）
4.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）
0.1 mL。
37℃孵育0.5-1小时，洗涤3次，最后一遍用DDW洗涤，DEA（二
乙醇氨）缓冲液平衡5min。
5.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的100µL 1m g/mL的PNPP，30℃45
分钟显色。
6.终止反应：于各反应孔中加入1M氢氧化钠0.05mL。
7.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳
性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“＋”、“－”
号表示。
也可测定OD值：在ELISA检测仪上，于405nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
计算公式：（待测样OD－空白OD）／（阴性对照OD－空白OD）。
若两者比值大于2.1可判读为阳性。
二、试剂配方：
1.试剂
（1）包被缓冲液（pH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液）：
Na2CO3 1.59克NaHCO3 2.93克加蒸馏水至1000mL。
（2）洗涤缓冲液（pH7.4 PBS）：0.15M KH2PO40.2克Na2HPO4·12H2O 2.9克NaCl 8.0克KCl 0.2克
Tween-20 0.05％0.5mL 加蒸馏水至1000mL。
（3）稀释液：牛血清白蛋白（BSA）0.1克加洗涤缓冲液至100mL。
（4）终止液（1M NaOH）：4克NaOH溶于80mL DDW中，加DDW 定容至100毫升。
（5）底物缓冲液（pH9.8二乙醇氨）：二乙醇氨97mL，加水至900mL，HCl调pH至9.8，定容至1L。
（6）PNPP：取5mg底物缓冲液，按1mg/mL加入PNPP。
反应前10min 配制此溶液。
（7）酶联缓冲液（pH7.4）：PVP（MW24000）20.0g；Tween-20 0.5mL；
BSA2.0g；MgCl2·6H2O0.2g。
上述药品溶于PBS溶液中，定容
至1L。
2.器材：
（1）聚苯乙烯塑料板（简称酶标板）40孔或96孔，ELISA检测仪，50µL加样器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。
（2）小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。
（3）4℃冰箱，37℃孵育箱。
1.包被抗原的选择
包被抗原可分为天然蛋白、重组蛋白和小分子抗原三大类。
天然蛋白需经纯化才能用直接吸附法包被，对于含杂质较多的抗原可以采用间接捕获法包被（先用能够与目的抗原反应的物质如抗体直接吸附在酶标板上，再通过特异性反应使抗原固相化）。
经纯化的重组蛋白一般皆可直接包板。
小分子抗原比如多肽以及一些小分子有机化合物，由于分子量太小，往往难于直接吸附在酶标板上，一般都先使其与无关蛋白质如BSA等偶联，偶联物吸附于固相载体上。
2.包被液的选择
一般常用的是pH9.6的碳酸盐缓冲液，如果包被的抗原在碱性条件下不稳定的话，也可
以使用pH7.2的磷酸盐缓冲液。
3.包被温度的选择
通常是4-8度条件下过夜或者37度保温2小时，我们强烈建议4-8度条件下包被，有利于蛋白活性的保持。
4.包被浓度的选择
包被的最适浓度随固相载体和包被物的性质变化，一般蛋白质的包被浓度为1-5ug/ml，要明确针对特定包被抗原的最适包被浓度需要通过实验来确定。
包板后需要封闭吗？应该选择什么样的封闭体系？
封闭是否必要，取决于ELISA的模式及具体的实验条件。
一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。
而在间接法测定中，封闭一般是必不可少的。
常用的封闭剂有0.05%-0.5%的BSA、10%的小牛血清、1%明胶、5%的脱脂奶粉，AbMART 推荐使用5%脱脂奶粉，价廉而且封闭能力强，不过5%脱脂奶粉只适合短期内使用，不宜长期保存，所以试剂盒中较少使用。
ELISA双抗体夹心法原理、特点和实验步骤
1、原理
ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。
加入酶标记的抗原或抗体，通过反应也结合在固相载体上。
加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。
2、特点
某些分泌型蛋白，用siRNA 干扰后可以用ELISA 进行检测。
3、ELISA 实验流程示图（以双抗体夹心法为例）
4、试剂与耗材
（1）包被缓冲液（pH 9.6 0.05 M 碳酸盐缓冲液）：（2）洗涤缓冲液（pH 7.4，0.15 M PBS）：
（3）稀释液：
（4）终止液（2 M H2SO4）：
（5）底物缓冲液（pH 5.0）：
（6）四甲基联苯胺（TMB）使用液：
（7）2，2’-连氮基-双-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺（ABTS）使用液：（8）抗原、抗体和酶标记抗体：按说明书处理。
（9）标准品：用稀释液稀释成梯度浓度溶液。
（10）96 孔聚苯乙烯塑料板（酶标板）。
2、实验步骤（双抗体夹心法）：
（1）包被：用包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1-10 μg/mL。
在酶标板反应孔中加0.1 mL，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。
（2）加样：加一定浓度稀释的待检样品（同时做空白对照，阴性对照孔及阳性对照）0.1 mL 于上述已包被的反应孔中，置湿盒中，37℃， 1 hr。
用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。
（3）加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度） 0.1ml。
37℃，0.5 - 1 hr，用洗涤缓冲液洗板3 次，每次3 min。
（4）加底物液显色：于各反应孔中加入现配的TMB 底物溶液0.1 mL，37 ℃，10 - 30min。
（5）终止反应：于各反应孔中加入终止液0.05 mL。
（6）结果判定：将酶标板在酶标仪上，于450 nm （若ABTS 显色，读410 nm），读数，输出到Excel 中。
（7）以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，生成标准曲线和直线回归方程式，根据公式计算未知样品的浓度，并记录。
