转基因动克隆动物共93页

microinjection
（二）反转录病毒感染法
将外源基因DNA插入逆转录病 毒载体；
通过辅助细胞包装成病毒颗粒， 感染胚胎；
再将感染的桑椹期胚胎导入子宫。
（三）胚胎干细胞法 （1）获取胚胎干细胞（ES细胞）； （2）将外源基因导入ES细胞； （3）获取囊胚期胚胎； （4）将含有外源基因的ES细胞注入
危动物。
第三节 转基因动物和克隆动物的 生物安全与社会安全
（1）生物安全——大自然正常的生态 平衡被打破。
（2）社会安全——涉及技术、宗教、 伦理等问题。如有人担心，坏人会克 隆出第二个希特勒，造成世界大乱。
新近克隆的8个人类胚胎的早期阶段
韩国科学家和美国《科学》周刊2004年2月12日 宣布克隆出世界上第一批成熟人类胚胎，称这是 克隆技术的又一重大进 展，有助于进一步加快 用干细胞治疗疾病的研 究。专家则警告说，这 一成果表明人类朝克隆出婴儿迈进了一步。
1987年，Martin Evans，Oliver Smithies 和 Mario Capecch 领导的 几个研究小组对胚胎干细胞中特定目 标基因进行失活，培育出了第一只基 因敲除小鼠。这三位科学家因为这项 工作在2001获得了Lasker奖。接下来， 科学家们用同样的技术又培育出了几 千只基因敲除小鼠。
第八章 转基因动物与克隆动物
第九章 转基因动物与克隆动物 第一节 转基因动物 第二节 克隆动物 第三节 转基因动物和克隆
动物的生物安全与社会安全
第九章 掌握内容
1、转基因动物和克隆动物的概念。 2、基因转移的5种方法。 3、动物克隆技术的基本方法。
第一节 转基因动物
一、转基因动物的概念
将特定的外源基因导入动物 受精卵或胚胎，使之稳定整合于 动物的染色体基因组并能遗传给 后代的一类动物。

转基因动物的产业 化
转基因动物的产业化现状
转基因动物在农业、 医药、环保等领域 的应用广泛
转基因动物产业化 面临技术、伦理、 法规等多重挑战
转基因动物产业化 需要加强技术研发 、伦理审查和法规 监管
转基因动物产业化 前景广阔，但需要 解决一系列问题
转基因动物的产业化前景
市场需求：随着人 们对食品、医药等 领域的需求不断增 长，转基因动物产 业化前景广阔。
伦理问题：公众对转基因动物 的接受程度和伦理争议
法规限制：各国对转基因动物 的法规限制和监管政策
市场风险：转基因动物的市场 接受度和竞争压力
转基因动物的社会 影响
转基因动物对人类健康的影响
转基因动物食品：可能含有新的过敏原，引发过敏反应 转基因动物药物：可能产生新的药物，治疗人类疾病 转基因动物实验：可能用于人类疾病的研究，提高医疗水平 转基因动物环境：可能对生态环境产生影响，影响人类健康
转基因动物的研究 进展
转基因动物的研究历程
转基因动物的研究现状
研究领域：基因编辑、基因表达调 控、基因功能研究等
应用领域：农业、医药、环境等领 域
添加标题
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添加标题
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研究进展：基因编辑技术不断成熟， 基因表达调控研究取得重要进展， 基因功能研究逐渐深入
研究挑战：伦理问题、安全性问题、 技术难题等
转基因动物对伦理道德的影响
基因编辑技术：改变动物基因，可能引发伦理道德争议 动物权益：转基因动物是否享有与人类同等的权益 生态平衡：转基因动物可能对生态系统产生影响，引发伦理道德问题 食品安全：转基因动物食品的安全性，可能引发伦理道德争议
转基因动物的未来 展望
转基因动物的技术发展趋势

临床前遗传变异影响new chemical entities (新化 学实体)作用，美国FDA规定，新化学实体临床前研 究包括遗传效应对药物代谢影响。对药物有效或毒 性变异预测实验 用于新药临床实验中，筛选病人。
染色体较短，基因种类丰富，最活跃致病染色体（基 因密度在17、19、22号染色体上最高）。
其基因变异与免疫反应、精神分裂、心脏病、弱 智、白血病以及多种癌症相关。人体全部遗传密码图 谱绘制完毕，大量关于人类生长、发育、衰老、遗传 病变秘密随之揭开。
今后100年—200年生命科学奠定基础。随着对人 体致病基因展开全面搜索——了解各种基因功能及基 因之间相互作用。
Transgenic animals （转基因动物）
Clone animals (克隆动物)
博、硕士研究生
本次课所掌握内容
• 基因病的分类 • 基因在医学领域的用途 • 反求生物学 • 转基因动物及实施细则 • 转基因动物的应用 • 克隆动物的概念和技术过程
日本科学家培了一种新的基因改老鼠，它们不具备 感知危险气味的能力，对其“死对手”猫一点都不 觉得害怕，相反还大胆地在猫身上爬来爬去，甚至 依偎在猫身边。此研究发表《自然》杂志上。
这种鼠通过基因改造，失去其鼻腔特殊感受器， 是专门嗅知食物或捕食者气味的器官。科学家此做 是为更加了解嗅觉的机理。老鼠可以通过其它嗅觉 细胞来探知气味，可惜没有关键路线来触发大脑产 生恐惧感，当“死对手”猫或酸性化学物或其它凶 险化合物在场时，它们也不感到害怕。
为证实这一点，科学家将这种鼠放在猫身上，只见 它又闻又吻，还与猫玩耍起来。为进一步探测这些 老鼠对危险的感知能力，研究人员还将老鼠放在一 个能产生疼痛感的旋转平台上，还放些捕食动物如 雪豹和狐狸的尿液让它们闻，看老鼠是否害怕。结 果发现，这些老鼠开始小心翼翼，之后很好奇，没 有一点害怕的表现。

转基Fra bibliotek技术的发展现状
自从1983年第一株转基因烟草获得以来，至今已有120种植物转基因获 得成功。1996年全球大面积种植，并不断扩大。
国际农业生物技术应用服务局（ISAAA）统计结果 14
转基因产品销售情况： 2010年转基因产品年销售额达到200亿美元，1500万农民种 植转基因作物。 转基因作物种植国家情况： 美国（59%），阿根廷（20%），加拿大（6%） 中国 （5%），欧洲很少 美国最早批准种植转基因作物 2004年3月英国批准大面积种植转基因作物，但要求非常严格。 2005年德国通过法案，严格限制（包括实验室研究）。
转 基 因 技 术 发 展 简 史
1971年 史密斯等人从细菌中分离出一种能切开病毒DNA分子的 限制性内切酶，标志着DNA重组时代的开始； 1972年 伯格等用限制性内切酶分别酶切猿猴病毒DNA和噬菌体 DNA，并将二者用连接酶连接起来，得到重组DNA分子； 1973年 科恩等进一步将酶切的DNA分子与质粒DNA连接起来， 获得重组质粒并转入大肠杆菌中； 1978年 全球第一个重组DNA技术公司——Genetech开始利用重 组大肠杆菌生产人胰岛素。 1980年 第一例转基因动物——转基因小鼠在美国成功培育 1982年 第一例转基因植物——转基因烟草在美国问世 1987年 第一例转基因微生物——防冻基因工程菌进入田间试验 1994年 第一例转基因作物——延熟保鲜番茄在美国上市
The Washington University group, headed by Mary-Dell Chilton, had produced cells of Nicotiana plumbaginifolia, a close relative of ordinary tobacco, that were resistant to the antibiotic kanamycin (Framond et al., 1983). Jeff Schell and Marc Van Montagu, working in Belgium, had produced tobacco plants that were resistant to kanamycin and to methotrexate(氨甲蝶呤), a drug used to treat cancer and rheumatoid arthritis (Schell et al., 1983). Robert Fraley, Stephen Rogers, and Robert Horsch at Monsanto had produced petunia plants（矮牵牛花） that were resistant to kanamycin (Fraley et al, 1983a). The Wisconsin group, headed by John Kemp and Timothy Hall, had inserted a bean gene into a sunflower plant.

04
转基因克隆动物的伦理和社 会问题
转基因克隆动物的伦理问题
动物福利问题
转基因克隆动物通常在实验室或 农场中饲养，可能导致动物遭受
痛苦和折磨。
生物多样性问题
转基因克隆动物可能对生物多样性 产生负面影响，例如破坏生态平衡 和导致基因污染。
人类干预自然规律
转基因克隆技术违背了自然规律， 过度干预可能导致不可预测的后果 。
2000年代
随着CRISPR-Байду номын сангаасas9等新型基因编辑 技术的出现，转基因克隆动物的培育 效率和质量得到进一步提高。
1990年代
科学家开始尝试将转基因技术与克隆 技术结合，培育转基因克隆动物。
2010年代至今
随着基因编辑技术的发展，科学家成 功培育出多种转基因克隆动物，如转 基因克隆猪、转基因克隆牛等。
转基因克隆动物的应用前景
医学研究
01
转基因克隆动物可用于医学研究，模拟人类疾 病的发生和发展过程，为疾病治疗和药物研发
提供实验模型。
农业生产
03
转基因克隆动物可用于优良品种的快速繁殖和 遗传改良，提高农业生产效率。
生物制药
02
利用转基因克隆动物生产人类疾病治疗所需的 蛋白质、酶等生物活性物质，具有广阔的市场
THANKS
前景。
濒危物种保护
04
通过转基因克隆技术，可以保护濒危物种，避 免其灭绝。
02
转基因克隆动物技术
转基因技术
转基因技术定义
转基因技术是指通过人工方法将一个生物的基因切出来，接到另一个生物的基因上，让接收基因 的生物表现出新的特性。
转基因技术的应用
转基因技术广泛应用于农业、医药、工业等领域，例如转基因作物、转基因药物等。

• 为了使转基因动物体内能产生大量的目的蛋白， 满足应用的需求，人们特别希望转基因动物能 在某些腺体细胞内产生并被分泌到体外，而哺 乳动物的乳腺就是一个理想的外分泌器官。若 目的基因所限定在乳腺细胞中大量表达，就能 从转基因的动物乳汁里获得需要的基因产物。 这时转基因动物乳腺就成为一个为生产某种生 物活性蛋白的生物反应器（乳腺反应器）。转 基因动物总有一天会成为“动物药厂”。它们 可以持续地将人们所希望的蛋白质基因（你所 宠爱的基因、YFG）。 • 下一页
• 所谓转基因动物就是把外源性目的基因导入动 物的受精卵或其囊胚细胞中，后改用注入受精 卵的任何一个前核，并在细胞基因组中稳定整 合，再将合格的重组受精卵或囊胚细胞筛选出 来，采用借腹怀孕法寄养在雌性动物（foster mother）的子宫内, 使之发育成具表达目的基因 的胚胎动物, 并能传给下一代。这样，生育的 动物为转基因动物。这类动物由于外源性目的 基因的稳定存在而赋于子代动物个体。 如图14-1
六、克隆羊和动物克隆
• 动物克隆和转基因动物的技术不同，动物克隆 技术是核移植的一种无性繁殖法，把经过处理 的成年动物体细胞（如羊乳腺细胞）和另一只 动物的去核卵细胞（如羊卵细胞）进行细胞融 合，短期培养以后形成胚胎细胞，再植入借腹 怀孕的寄养的母体子宫内，使发育成提供体细 胞遗传的那只动物的克隆。克隆羊的培育是核 移植的无性繁殖，是体细胞的整套基因导入。 克隆羊只是从供体细胞中获得遗传物质，因此 克隆羊是与供体羊遗传性状完全一模一样，这 种通过无性繁殖方式进行动物克隆打破了传统 的有性生殖概念。 （如图1、图2）
第十四章
• • • •
转基因动物和动 物克隆
一、转基因动物（概念、研究、问题） 二、转基因的“动物药厂” 三、抗感染动物 四、转基因动物技术路线中的转基因胚胎干细 胞 • 五、基因敲除的小鼠模型（概念、方法、特点、 应用） • 六、克隆羊和动物克隆（概念、意义） • 七、克隆人

Dnmt1
61790 bp DNA 40个外显子 mRNA join(1..316,13059..13095,14251..14358,14567..14786, 17769..17844,19518..19596,21231..21265,21962..22046, 26772..26806,28451..28538,31776..31810,32388..32469, 34718..34752,35073..35118,35214..35294,35369..35478, 38627..38745,39191..39283,40080..40231,40363..40550, 40657..40843,43289..43386,43591..43738,45168..45283, 45479..45683,46119..46252,48612..48785,51149..51370, 52916..53108,53947..54031,54227..54355,54808..55090, 55319..55460,56531..56697,57127..57304,57856..58051, 58849..59015,59284..59400,60829..60919,61435..61790)
TE随机失活， 倾向已失活X 父源失活
供体细胞融合入去核MII卵母细胞
NEBD PCC
假原核形成并快速膨大
染色体全基因组水平去甲基化
胚胎早期发育基因的激活
发生充分的NEBD和PCC的灵长类SCNT胚胎
高达20%能发育至囊胚(Mitalipov, Zhou et al. 2007)。 Sung的研究结果却表明PCC不是牛体细胞重 编程的必需条件(Sung, Shen et al. 2007)

已获得整合有生长激素（GH）、生长激素释放因子（GRF）、 肌肉生长刺激因子（cSK1）及能提高羊毛质量、牛奶产量等外源 基因的转基因家畜。其中含有GH的转基因猪己稳定地的遗传了五 个世代，其血液中GH均保持较高浓度，虽个体不比同胞更大，但 体重增长较快，料肉转化率提高17%，背膘厚度从18.5±1.8毫米 下降到7.0±1.8毫米；
出于安全性考虑，反转录病毒转染法主要是作 为实验手段应用于转基因动物的研究。
胚胎干细胞转移基因转移 法
胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，简称ES细胞)是从哺乳动物早 期胚胎的内细胞团中分离的一种二倍体细胞，可在体外培养并保持 全能分化的潜能，如给予适当环境即可形成胚系集落。
因此，胚胎干细胞经转染并鉴定后，移植到哺乳动物正常发育的囊 胚腔内，再将囊胚植入假孕动物子宫中，可产生嵌合体动物。转化 的细胞在嵌合体中能分化发育成为全能的生殖细胞，经简单的杂交 繁育即可得到携带外源基因的纯合转基因动物。
Measure Transgenic milk target protein
expression
目前，国际上己有多种转基因动物（绵羊、山羊、猪和牛） 能生产上百种医用蛋白，其中有30余种进入Ⅱ、Ⅲ期临床，有 的也己进行商业开发，产生了良好的经济效益，正逐步发展成 一新兴产业。
如荷兰金发马公司培育的转基因牛，生产人乳铁蛋白，提炼 的营养奶粉销售额为50亿美元；英国罗斯林研究所培育的抗胰 蛋白酶转基因羊，每升羊奶价值6000美元；芬兰得到红细胞生 成素的转基因牛，年产奶价值为40多亿美元。
异种移植目前最大的障碍，便是受体对异种器官的超急 性排斥反应，克服这一障碍便成为异种器官移植成功的一 个关键。
应用转基因技术，培育表达人补体调控蛋白，如人膜辅助 因子蛋白（human membrane cofactor protein MCP）、 人衰变加速因子（human decay-accelerating factor DAF） 的转基因猪，有望抑制或减弱人补体对猪器官的攻击。

克隆绵羊多莉出世，随后出现了克隆牛、克隆猪 等，人们把目光聚焦在了克隆人身上。2001年2月5 日，意大利的塞韦里诺.安蒂诺里宣布开场克隆人。 随后，陆续传来要进展克隆人实验的音讯。
威苏辛教授和他的克隆猫
克隆评价：
动物克隆技术被生物科学家誉为“生物原子弹〞，各国 都在竞相开展。动物克隆技术分胚胎克隆和体细胞克隆。相 比而言，体细胞克隆的难度更大，它是从成年动物身体上取 一点组织，分别出一个个细胞，将细胞核移植到去核的卵子 内构成克隆胚胎，然后再将其移植到动物受体内妊娠产子。
动物克隆与转基因技术
克隆技术
现代生物科技探求
多莉引发克隆震撼 Creating Dolly！
１９９７年，生物学界发生了一件惊动世界的大事：克隆羊多莉诞 生！
距爱丁堡市１０公里远的郊区，有一个罗斯林村，这是一个风景优美的 “世外桃源〞。罗斯林研讨所就建在这里，它是英国最大的家畜家禽研讨所， 也是世界著名的生物学研讨中心，这里便是克隆羊多莉物克隆技术不仅实际上有艰苦突破，无需有 性繁衍即可消费动物，而且可利用克隆羊技术来 克隆人体器官，有医学价值，还可使难以生殖或 即将灭种的动物〔如熊猫〕采用无性繁衍方式来 繁衍后代，因此引起全世界关注。现又有克隆牛、 克隆猪、克隆羊的问世，如今正在克隆熊猫。
转基因动物的运用前景
1. 研讨基因的构造与功能，了解动物生命景象的内 在本质〔基因治疗〕。 2. 建立多种疾病的动物模型，研讨发病机理及治疗 方法。 3. 改善动物消费性能，提高动物育种效率。 4. 作为医用或食用蛋白的生物反响器。可以经过家 畜乳腺分泌大量平安、高效、廉价的人体药用蛋白。
6 体细胞克隆两栖类动物的胜利
1962年，牛津大学生物学家John Gurdon宣布用曾经分化的南美青蛙蝌蚪 的肠细胞核克隆出完好个体，后来又从 成年娃的角质细胞克隆出了蝌蚪。这是 第一次体细胞克隆动物胜利地报道。

关于逆转录病毒
1、Retrovirus是只有一条单链RNA的病 毒类的总称。
2、逆转录病毒在逆转录酶（RT）的作用下 可以将本身的单链RNA作为模板进行复 制和遗传信息的传递。
3、逆转录病毒通过病毒中膜糖蛋白和宿主 细胞表面的受体相互作用而进入宿主细胞。
原理
1、逆转录病毒具有高效感染和在宿 主细胞DNA上高度整合的特性。
1980年，Gordon等首次采用受精卵原 核显微注射法，首次将疱疹病毒和SV40 的DNA片段导入小鼠基因组，成功制作 转基因小鼠，开创了转基因动物的新纪 元。
1982年 Palmiter-“超级巨鼠”
华盛顿大学的Palmiter将大鼠 的生长激素基因注射到小鼠受精 卵内, 培育出体型明显大于正常 小鼠的超级鼠, 成果轰动一时。
第二部分 克隆动物
克隆（Clone）
WHO:遗传上同一的机体或细胞系 （株）的无性生殖。
克隆动物（clonal animal）
是指用人工方法得到无性繁殖的在 遗传上与亲本动物完全相同的动物
动物克隆方法
➢一、胚胎分割
➢二、细胞核移植 —— 胚胎细胞核移植 —— 体细胞核移植
一、胚胎分割法
原理
将未着床的早期胚胎经显微手术后，分割为二、四、六若干等份，给每个 受体内植入一部分胚胎而妊娠产仔，这样由一个胚胎可以克隆出多个遗 传性能完全一样的后代个体。
▪ 800余种人为改造小鼠产生
其中开发最成功的是转基因小鼠
HBV转基因动物树鼩
3.基因治疗（gene therapy）
指将外源功能性目的基因导入病人体内，通过调控目的基因表达，抑制、替代 或补偿缺陷基因，从而恢复受累细胞、组织或器官的生理功能，达到疾病治疗 目的的一种方法。

透明带的胚胎与分泌重组病毒颗粒的细胞共培养，
以达到将外源DNA 转移到胚胎中去的目的。

这一方法的优点是，重组逆转录病毒可同时感染大
量胚胎。感染后的整合率高； 外源DNA在受体细胞基因组中的整合通常是单拷贝 的； 不需要昂贵的显微注射设备。 本法的缺点是，由于选用的受体是早期胚胎，不是 受精卵，致使外源DNA 在动物各种组织中的分布不
以多拷贝串联的形式随机地整合于受体基因
组中，妨碍其表达的正常调节。

(二)逆转录病毒感染法：以逆转录病毒作载体， 把 重组的逆转录病毒载体DNA包装成高滴度病毒颗粒， 感染发育早期的胚胎，将外源基因导入宿主的染色
体内的方法称为逆转录病毒感染法。此法操作简单，
可通过注射将重组病毒转移到囊胚腔内，也可将去
包裹的卵。也可将注射有外源DNA的受精卵或桑椹
胚体外培养至囊胚，再行移植。显微注射后3.5天的
囊胚移植至受孕后2.5天的假孕鼠子宫，子宫移植不
需要有透明带。

此法的优点是，在一定设备和经验条件下， 实验过程大为简化；任何DNA 顺序都可直接 导入原核内,导入的外源DNA在卵裂前与受体 基因组整合,其缺点在于导入的外源DNA通常
核移植也称克隆或无性繁殖是将分离的胚胎卵裂球核供体或体细胞核与成熟并去核的卵母细胞或去核的原核期受精卵的去核胚胎核受体融合不经过有性繁殖过程连续不断地复制遗传上相同的胚胎并通过克隆胚胎的移植生产大量同基因型的克隆动物系或动物群的一项动物繁殖新技术
转基因动物和动物克隆

一、转基因动物（概念、研究、问题） 二、转基因的“动物药厂”
遗传背景，因此需用纯系鼠。

在实际操作中，一般用4～6周母鼠作为超排卵供体，
3～4周母鼠产卵更多但卵细胞膜脆性较大，在处理 过程中易破裂，而6周以后母鼠产卵逐渐减少。